Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

إعداد المستندة إلى الشيتوزان الهلاميات المائية القابلة للحقن وتطبيقه في ثقافة الخلية 3D

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56253
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1The Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Department of Chemistry, Tsinghua University, 2Institute of Chemical Materials, China Academy of Engineering Physics

Summary

هنا يصف لنا إعداد المستندة إلى الشيتوزان الحقن الهلاميات المائية باستخدام الكيمياء الحيوية ايمين السطحية. وترد أساليب لضبط القوة الميكانيكية المائية وتطبيقه في ثقافة الخلية 3D.

Abstract

ويقدم البروتوكول بطريقة سهلة وفعالة، وتنوعاً لتحضير الهلاميات المائية المستندة إلى الشيتوزان باستخدام الكيمياء الحيوية ايمين. المائية تعدها خلط حلول الشيتوزان جليكول مع جيلاتور بوليمر المركب benzaldehyde إنهاء، والهلاميات المائية يتم الحصول على كفاءة في عدة دقائق في درجة حرارة الغرفة. بنسب متفاوتة بين الشيتوزان غليكول، جيلاتور البوليمر، ومحتويات المياه، يتم الحصول على الهلاميات المائية تنوعاً مع أوقات مختلفة جيليشن وصلابة. عند تلف، يمكن استعادة المائية المظاهر ومعامل التحويل، نظراً لإمكانية الرجوع للسندات ايمين الديناميكية كروسلينكاجيس. تتيح هذه الخاصية الذاتية هيالابل المائية لأن الحقن يمكن أن تلتئم ذاتيا من القطع تقلص إلى المائية الأكبر لا يتجزأ بعد عملية الحقن. المائية أيضا متعددة تستجيب للعديد من المحفزات الحيوية النشطة بسبب حالات الموازنة المختلفة للسندات ايمين الديناميكية. وتم تأكيد هذا المائية الحيوية المتوافقة، وخلايا تنتجها الخلايا الليفية الماوس L929 كانت جزءا لا يتجزأ من الإجراءات القياسية التالية وقيمت تكاثر الخلايا بسهولة قبل عملية زراعة خلية 3D. المائية يمكن أن تقدم منهاج البحثية المختلفة حيث يتم استفادت من تقليد فسيولوجية لبيئة ثلاثية الأبعاد للخلايا القابلة لتعديل. جنبا إلى جنب مع خصائصه القابلة للحقن الذاتي هيالابل واستجابة متعددة، يمكن تطبيق الهلاميات المائية يحتمل أن تكون كشركات متعددة للأدوية والخلايا في التطبيقات الطبية الحيوية المستقبلية.

Introduction

الهلاميات المائية مواد البوليمر كروسلينكيد مع كميات كبيرة من المياه وخواصها الميكانيكية لينة، وأنها قد استخدمت في العديد من التطبيقات الطبية الحيوية1،2. الهلاميات المائية يمكن أن توفر بيئة لينة ورطبة، ومشابهة جداً لمحيط الفسيولوجية للخلايا في الجسم الحي. ولذلك، أصبحت الهلاميات المائية واحدة من السقالات الأكثر شعبية لخلية 3D الثقافة3،4. مقارنة 2D بيتري طبق خلية ثقافة، ثقافة الخلية 3D متقدمة بسرعة إلى عرض مصفوفة خارج الخلية (ECM) يحاكي المكروية للخلايا للاتصال وتجميع ل أغراض الانتشار والتفرقة5. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر الهلاميات المائية التي تتضمن البوليمرات الطبيعية المتوافقة مع الحيوية وتعزيز البيئات للخلايا تتكاثر والتفريق بين3. الهلاميات المائية المستمدة من البوليمرات الاصطناعية المفضلة لمكوناتها بسيطة وواضحة، مما يستبعد التأثيرات المعقدة مثل البروتينات الحيوانية المنشأ أو الفيروسات. بين جميع المرشحين المائية لاستزراع خلية ثلاثية الأبعاد، دائماً الهلاميات المائية التي يتم إعدادها بسهولة وتحتوي على خاصية متسقة المفضل. مرفق لضبط الخصائص المائية لتناسب الاحتياجات البحثية المختلفة بأهمية جيدا6.

نقدم لك هنا إعداد السطحية المائية المستندة إلى الشيتوزان غليكول استخدام الكيمياء ايمين الحيوي، الذي يصبح منبرا متعدد الاستخدامات المائية للخلية 3D الثقافة7. في هذا الأسلوب، تستخدم الشيتوزان غليكول الحيوية المتوافقة المعروفة جيدا وضع أطر للشبكات المائية. هي رد فعل أفرقتها الأمينية مع غليكول البولي إثيلين benzaldehyde إنهاء جيلاتور البوليمر شكل سندات ايمين الديناميكية كروسلينكاجيس من الهلاميات المائية8. يمكن أن تشكل سندات ايمين دينامية وتتحلل عكسية ومستجيب للبيئة المحيطة، تزويد الهلاميات المائية مع قابل للتعديل آليا كروسلينكيد الشبكات9،،من1011. نظراً لارتفاع المياه محتوياته، والمواد الحيوية المتوافقة، والقوة الميكانيكية للتعديل، تطبيق المائية بنجاح سقالة للخلايا L929 في الخلية 3D الثقافة12،13. البروتوكول هنا تفاصيل الإجراءات، بما في ذلك البوليمر جيلاتور التوليف وإعداد المائية، تضمين الخلية، واستزراع خلية ثلاثية الأبعاد.

المائية يظهر أيضا العديد من الميزات الأخرى بسبب لها كروسلينكاجيس ايمين الحيوية، بما في ذلك ما متعددة استجابة لمختلف المحفزات الحيوية (حمض/الرقم الهيدروجيني، بيريدكسال مشتقات فيتامين B6، غراء البروتين، إلخ)، مما يشير إلى أن المائية يمكن أن تكون التي يسببها لتتحلل تحت الظروف الفسيولوجية8. المائية أيضا هيالابل الذاتية والحقن، مما يعني المائية يمكن أن تدار عن طريق أسلوب حقن الغازية الحد أدنى وكسب ميزة في المخدرات وخلية تسليم14،15. بإضافة إضافات وظيفية أو جيلاتورس البوليمر محددة مسبقاً، المائية متوافق للحصول على خصائص محددة مثل المغناطيسية، درجة الحرارة، درجة الحموضة مستجيبة، إلخ16،17، الذي يمكن أن يفي الحصول على مجموعة واسعة من الاحتياجات من البحوث. وتكشف هذه الخصائص المائية القدرات الكامنة لتكون حقن عدة شركات للأدوية، والخلايا في المختبر و في فيفو البحوث الطبية الحيوية والتطبيقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تنبيه: الرجاء مراجعة صحائف بيانات السلامة المادية ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. الرجاء استخدام ممارسات السلامة المناسبة عند إجراء تجارب الكيمياء، بما في ذلك استخدام غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية (سلامة النظارات، وقفازات واقية، ومعطف مختبر، إلخ). يتطلب البروتوكول قياسي خلية معالجة تقنيات (تعقيم، استرداد خلية، خلية باساجينج، تجميد الخلايا، وتلطيخ الخلايا، إلخ).

1-"إعداد الهلاميات المائية"

  1. إنهاء توليف بينزالديهيدي di فونكتيوناليزيد البولي إيثيلين غليكول (الوتد مدافع)
    1. جفاف قبل "ربط" البوليمر
      1. تزن ز 4.00 شماعة (4,000 ميغاواط، ملمول 1.00)، تحويلها إلى قاع جولة قارورة (250 مل)، وإضافة التولوين (100 مل)-
        ملاحظة: يمكن العمل من أجل تشكيل المائية أوتاد الأخرى مع الأوزان الجزيئية مختلفة لكن سوف يؤدي إلى صلابة مختلفة.
      2. الحرارة الحل ببندقية حرارة (أو لوحة الساخن حوالي 40 درجة مئوية) أقل ما يقال للمساعدة في حل جميع البوليمرات. بعد حل كافة البوليمرات، استخدام مبخر إزالة جميع المذيبات. كرر عملية جافة وحل هذا مرتين لجعل شماعة المجففة البوليمرات.
        تنبيه: وهذا ينبغي أن يجري في غطاء دخان بعناية فائقة. تولوين الاشتعال.
    2. بينزالديهيدي إنهاء رد فعل شماعة
      1. إضافة محرض المغناطيسية ورباعي هيدرو الفوران (THF، 100 مل) إلى قارورة وحل استخدام محرض شماعة. إضافة 4-كاربوكسيبينزالديهيدي (ز 0.90، 6.0 ملمول) و 4-ديميثيلامينوبيريديني (ز 0.07، 0.6 ميللي مول) تسلسلياً للحلول لحل جميع المواد الصلبة تماما.
      2. إضافة ن، ن '-ديسيكلوهيكسيلكاربودييميدي (DCC، ز 1.25، 6.0 ملمول) إلى الحل، وإضافة أنبوب تجفيف مليئة كاكل اللامائى 2 إلى قارورة. يبقى رد الفعل تحت التحريك في درجة حرارة الغرفة (~ 20 درجة مئوية) لحوالي 12 h.
    3. رد فعل بعد انتهاء عملية
      1. بتصفية المواد الصلبة البيضاء التي تم إنشاؤها في الحل بالفراغ بعد الانتهاء من رد فعل. صب الحل في البرد إثيل الاثير (500 مل) تحت إثارة يعجل بالمواد الصلبة البيضاء. جمع جميع المواد الصلبة البيضاء بواسطة عامل تصفية والجاف للمواد الصلبة في غطاء دخان.
      2. تذوب المواد الصلبة البيضاء إلى THF مرة أخرى وتصفية أي مادة صلبة بيضاء غير قابلة للذوبان وصب الحل الطازجة الباردة إثيل الاثير يعجل بالمواد الصلبة البيضاء والجافة. كرر هذه العملية مرتين إلى ثلاث مرات، ومن ثم وضع مادة صلبة بيضاء في فرن التجفيف الفراغ (20 درجة مئوية، 0.1 [مبر]) تجفيفها تماما. جمع مسحوق أبيض كالمنتج النهائي: benzaldehyde أنهى مدافع الوتد.
  2. إعداد الهلاميات المائية
    1. وزن كميات مختلفة من الوتد مدافع (0.11 ز، ملمول 0.028 ز 0.22، ملمول 0.055؛ 0.44 ز، ملمول 0.110) في أنبوب (10 مل) وإضافة المياه (5.0 مل)، واستخدام دوامة أو محرض المغناطيسي لمساعدة حل البوليمر.
    2. حل الشيتوزان غليكول (0.495 ز، 6.18 × 10 -3 ملمول) في المياه (15.0 mL) في أنبوب (50 مل)، واستخدام دوامة لبضع دقائق لمجانسة الشيتوزان الحل (3 wt %).
    3. إضافة الحل الشيتوزان غليكول (0.2 مل، 3% بالوزن) وحلول الوتد مدافع (0.2 مل) التتابع في أنبوب (2.0 mL). استخدام دوامة لخلط الحلول البلوتينيوم للنموذج الهلاميات المائية في عدة دقائق. اتبع النسب الواردة في الجدول 1 لجعل الهلاميات المائية من مختلف نقاط القوة الميكانيكية-
      ملاحظة: استخدم الأسلوب عكس أنبوب لتحديد ما إذا كانت المائية قد شكلت بالفعل-
  3. تحليلات ريولوجيا
    1. الاضطلاع بتحليلات ريولوجيا في رهيوميتير تناوب مع صفيحة فولاذية متوازية (القطر: 20 مم). لاختبار جيليشن، نشر الحل الشيتوزان غليكول (0.2 مل، 3% بالوزن) على لوحة أقل. ثم إضافة المحاليل الوتد مدافع (0.2 مل، 2% بالوزن) دروبويسي بالتساوي على سطح حل الشيتوزان وخلط مع ماصة بسرعة. انخفاض أسفل اللوحة العلوية والبدء في test.
    2. للمائية ' اختبار صلابة s، قطع المائية في دائرة (القطر: 20 مم) وقياس معامل التخزين (غ ') القيم مقابل تحليلات التردد في سلالة 1%. ز النموذجية ' القيم في راد 6.3 s − 1 وترد في الجدول 1.
      ملاحظة: الاضطلاع بتحليلات ريولوجيا هيدروجيل ح 0.5 بعد تشكيل المائية لضمان استقرار السندات دينامية المائية.
    3. للمائية ' s هيالابل الذاتي خاصية اختبار، قطع المائية لقطع وجمع القطع معا للاعطاب إلى جزء لا يتجزأ. ثم قص قطعة المائية جعل دائرة (القطر: 20 مم) ووضعه على رهيوميتير إجراء التحليل ريولوجيا.

2-3D "زراعة الخلية" في الهلاميات المائية

  1. إعداد الحلول جيليشن المائية
    1. "تزن ربط مدافع" (ز 0.44، 0.11 ميللي مول) في أنبوب عقيم (مل 4.0)، إضافة في خلية ثقافة وسائل الإعلام (ربمي-1640، 2.0 مل)، واستخدام دوامة أو محرض للمساعدة على حل البوليمر للحصول على الحل البوليمر (20% بالوزن). تحميل الحل في حقنه (10.0 mL) وتعقيم ثم أنها بتمريره من خلال مرشح بكتيريا متذكر ميكرون (0.22 ميكرومتر).
    2. تزن الشيتوزان غليكول (0.165 غ، 2.06 × 10 -3 ملمول) في أنبوب عقيم (15.0 مل)، وإضافة في خلية ثقافة وسائل الإعلام (ربمي-1640، مل 4.0)، ودوامه للمساعدة على حل البوليمر للحصول على الحل الشيتوزان غليكول (4.0 wt %). تحميل الحل في حقنه (10.0 mL) وتصفيته مع عامل تصفية بكتيريا متذكر 0.22 ميكرومتر.
  2. زراعة الخلية في الهلاميات المائية
    تنبيه: أداء كل خلية الإجراءات ذات الصلة في غطاء زراعة الأنسجة. ومن المتوقع معرفة أساسية بأسلوب تعقيم. طبق FBS، البنسلين 5% (10 مل) في بيتري المتوسطة
    1. إعداد تعليق خلية
      1. الخلايا L929 الثقافة في RPMI 1640 تستكمل مع 10% (قطرها 10 سم)، واحتضان في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5% 2. تغيير في المتوسط كل يوم قبل الاستخدام.
      2. حصاد الخلايا L929 مع برنامج تلفزيوني يتضمن التربسين (0.025% w/v) ويدتا (0.01% w/v)، ثم الطرد المركزي (70 x غ، 5 دقيقة) وتعليق إعادة الخلايا في المتوسط RPMI 1640 (1.0 مل). إجراء العد الخلية استخدام العملية القياسية للمجلس عد الدم. تعليق إعادة الخلايا لضبط تركيز الخلية إلى ~ 3.75 × 10 6 خلايا/مل.
    2. تغليف خلية في الهلاميات المائية
      1. مزيج تعليق خلية L929 (0.4 مل، 3.75 × 10 6 خلايا مل -1) مع غليكول الشيتوزان الحل (0.4 mL) في أنبوب (4.0 مل) من دوامة. "الماصة؛" الحل الشيتوزان L929/غليكول (0.8 مل) في وسط صحن بتري [كنفوكل] (قطرها 2.0 سم). "الماصة؛" الحلول الوتد مدافع (0.2 مل) في الطبق نفسه، و "الماصة؛" بلطف مزيج الحل والحث على تشكيل المائية-
        ملاحظة: تقييم تشكيل هيدروجيل عن إمالة الطبق بيتري.
      2. للثقافة الخلية مباشرة، وإضافة كميات إضافية من RPMI 1640 ثقافة وسائل الإعلام (1.0 مل) على رأس المائية. وضع في الخلية المدمجة الهلاميات المائية (1.0 mL، 1.5 wt % الشيتوزان غليكول، 4.0 wt % الوتد مدافع، 1.5 × 10 6 خلايا مل -1) في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO 2) وتغيير في المتوسط كل يوم. الاستعداد لتصوير الخلية في اليوم 1، 3، 5، و 7 بعد تغليف الخلية.
    3. لثقافة ما بعد خلية ثلاثية الأبعاد في الهلاميات المائية بعد الحقن، تعد الخلية تحميل المائية (1.0 مل، راجع الخطوة 2.2.2) في حقنه (10.0 مل، إبرة ز 48). بعد النماذج المائية، حقن المائية بطء في طبق بتري لتصوير [كنفوكل]. إضافة مبلغاً إضافيا قدرة وسائط الثقافة (1.0 مل) على رأس المائية وتغييره كل يوم. وضع طبق بتري في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO 2) والتحضير للتصوير بعد ذلك.
      تنبيه: الرجاء التحقق ومتابعة سلامة تشغيل البروتوكول لحقنه.
  3. خلية تحليل الجدوى
    1. المراقبة [كنفوكل]
      1. شطف الهلاميات المائية مع برنامج تلفزيوني (1.0 مل) لمرتين. وصمة عار في الهلاميات المائية مع اسيتات فلوريسسين (إدارة الأغذية والعقاقير، ومل 0.5، 0.05 مغ/مل) وحلول بروبيديوم يوديد (PI، 0.5 مل، 0.08 ملغ/مل) لمدة 15 دقيقة. بعد تلطيخ، إزالة جميع المذيبات.
      2. مراقبة الهلاميات المائية استخدام مجهر [كنفوكل] تحت موجات الإثارة من 488 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط لتصور لايف 543 والميت الخلايا، على التوالي. تأخذ z-أكوام من خلال كل عمق 2 ميكرومتر الهلاميات المائية للتحقق من صحة توزيع حتى للخلايا في جميع أنحاء-
        ملاحظة: إدارة الأغذية والعقاقير البقع خلايا حية بينما PI البقع الخلايا الميتة.
    2. تتحلل المائية (1.0 مل) مع حمض الخليك (HAc، v % 3، 1، 0 مل) لمدة 5 دقائق وماصة في أنبوب (مل 4.0). جمع الخلايا بالطرد المركزي (70 x غ، 5 دقيقة) وتعليق إعادة الخلايا في RPMI 1640 خلية الثقافة المتوسطة (1.0 مل). إجراء عد الخلايا باستخدام دم عد المجلس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تقديم عرض تخطيطي لهذا البروتوكول بشأن إعداد المائية واستخدامها كثقافة خلية ثلاثية الأبعاد في الشكل 1. موجز للمعلومات المائية محتويات ونسب إعدادها مع القوة الميكانيكية المختلفة في الجدول 1. المائية ذاتية هيالابلي ويعرض الممتلكات ريولوجيا صلابة المائية بمعامل التخزين مقابل الاختبار التردد في الشكل 2. ويعرض الصور [كنفوكل] الخلية وأرقام الخلية مع الأيام الثقافة في الهلاميات المائية في الشكل 3، يؤكد بقاء الخلية وتكاثر الخلايا عن طريق زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد. ويعرض الشكل 4 مجهرية والصور [كنفوكل]، وتحليل معدلات انتشار الخلايا للخلايا المضمنة في الهلاميات المائية التي عانت من الحقن وثقافة ما بعد. خلية عالية الجدوى وتكاثر الخلايا تشير إلى أن الخلايا المضمنة في المائية لحق لا ضرر المدمرة ويمكن استرداد بثقافة ما بعد، مما يشير إلى إينجيكتابيليتي المائية.

Figure 1
الشكل 1 : إعداد المائية واستخدام ذلك كثقافة الخلية 3D- (أ) إعداد المائية؛ (ب) خلية إعداد تعليق؛ (ج) الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد في الهلاميات المائية مع أو بدون حقن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: صلابة هيدروجيل. معامل التخزين ز ' مقابل التردد الأصلي (A) و (ب) تلتئم ذاتيا الهلاميات المائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : 3D خلية ثقافة في المائية. 3D صور [كنفوكل] (A) من الخلايا L929 جزءا لا يتجزأ من قوة شديدة المائية (الأخضر: يعيش الخلايا؛ الأحمر: قتل الخلايا)؛ (ب) خلية عد النتائج من الخلايا L929 جزءا لا يتجزأ من المائية بعد تغليف خلية في وقت تتم الإشارة إليها. شريط المقياس = 300 ميكرون. البيانات المعروضة يعني ± التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : ثقافة ما بعد خلية ثلاثية الأبعاد في المائية بعد حقن. (A) بصورة التخطيطي حقن وبعد انتهاء ثقافة المائية تحميل الخلية. إدراج: صور الفحص المجهري للخلايا المضمنة في الهلاميات المائية قبل الحقن (يسار) وبعد خلية ثقافة ما بعد لمدة 7 أيام (الأوسط وحق). شريط المقياس = 100 ميكرومتر؛ (ب) صور [كنفوكل] من الخلايا L929 جزءا لا يتجزأ من المائية قوة شديدة ومثقف ما بعد بعد حقن (الأخضر: يعيش الخلايا؛ الأحمر: قتل الخلايا)، مقياس بار = 300 ميكرون؛ (ج) مقارنة بمعدل انتشار الخلايا المستزرعة في الهلاميات المائية مع أو بدون حقن بعد التغليف. البيانات المعروضة يعني ± التنمية المستدامة. (مواءمة من مرجع12؛ حقوق الطبع والنشر © عام 2017 السفير). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تصلب المائية لينة متوسطة قاسية
الشيتوزان غليكول (mg) 6.6 6.6 6.6
مدافع شماعة (mg) 4.4 8.8 17.6
بوليمر جيلاتور المحتوى (wt %) 1 2 4
المياه (mL) 0.4 0.4 0.4
غليون الوقت (دقيقة) 7.5 5 3.5
ز ' (السلطة الفلسطينية)* 900 2100 4700
* اختبار تحت التردد راد 6.3 s-1، سلالة % 1 باستخدام صفيحة متوازية (قطرها 20 مم) في رهيوميتير تناوب.

الجدول 1: معلومات من الهلاميات المائية أعد مع القوة الميكانيكية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المائية عرضت في هذا البروتوكول (الشكل 1)، عنصرين رئيسيين هما: الشيتوزان غليكول البوليمر الطبيعي وبينزالديهيدي اصطناعية أنهى البوليمر جيلاتور الوتد مدافع، التي هي على حد سواء المواد متوافق حيويا. ويرد توليف الوتد مدافع استخدام فعل تعديل خطوة واحدة. واختير شماعة الوزن الجزيئي 4,000 في هذا البروتوكول في المخاوف من الذوبان، وتعديل الكفاءة، فضلا عن صلابة المائية. تم إعداد سلسلة من الهلاميات المائية مع القوة الميكانيكية المختلفة باستخدام محتويات صلبة مختلفة ونسب الشيتوزان غليكول والوتد مدافع. تم تشكيل الهلاميات المائية متجانساً بسرعة في دقيقة بخلط الحلول جيليشن تحت درجة حرارة الغرفة، على الرغم من أن يمكن أن تبطئ سرعة جيليشن أيضا بتمييع الحلول. اختبار ريولوجيا استخدمت لتقييم مواطن القوة الميكانيكية في الهلاميات المائية المختلفة. بواقي التخزين (ز ') وجدت هذه الهلاميات المائية تختلف ما يقرب من 900 السلطة الفلسطينية (الناعمة)، 2,100 السلطة الفلسطينية (متوسطة) إلى 4,700 السلطة الفلسطينية (قاسية) (الجدول 1 و الشكل 2 أ). هذا هو أسهم أعلى كثافة crosslinking بإضافة المزيد من جيلاتورس البوليمر في الشبكة المائية، أدى إلى ارتفاع معامل التخزين (زيادة صلابة). الخاصية هيالابلي الذاتي تؤكده أيضا انتعاش المعامل المائية (الشكل 2). فمن المعروف أن تصلب ECM يختلف بالنسبة لمختلف الأنسجة، وبالتالي المائية يمكن أن توفر الرموز الميكانيكية قابل للتعديل وتلبية الاحتياجات البحثية المختلفة بنسب متباينة بين الشيتوزان غليكول والوتد مدافع البوليمر جيلاتورس18.

L929 الخلايا، خط خلية تنتجها الخلايا الليفية ماوس المعتاد مع فيفو بيئة الأنسجة تصلب ~ 5,600 السلطة الفلسطينية19، استخدمت كنموذج خلية لتكون جزءا لا يتجزأ من المائية. بعد التغليف خلية في الهلاميات المائية، فإنه يمكن بسهولة ملاحظة أن الخلايا في الهلاميات المائية أظهرت إمكانية عالية للغاية (> 99 ٪) طوال عملية الثقافة، مؤكدا توافق مع الحياة الممتازة من المائية المستندة إلى الشيتوزان. زيادة ملحوظة من كثافة الخلية في المائية ضمناً أن هذا المائية يمكن أن تدعم انتشار الخلايا L929 حتى بدون إضافة إضافية عوامل النمو (الشكل 3A). بعد 7 أيام في الثقافة المائية، زاد عدد الخلايا 300% (الشكل 3B). وأفيد أن الخلايا المستزرعة في السقالات يمكن التفريق بعد العظة الميكانيكية20،21، الذي قد ينطوي على مزيد من البحث باستخدام هذا الأسلوب الثقافة المائية 3D.

زرع الخلايا مع الهلاميات المائية القابلة للحقن اكتسبت مزايا لا تضاهي يعزز إلى حد كبير كفاءة التسليم وبقاء خلايا مزروع14. ضمن شبكة كروسلينكيد ايمين دينامية، يمكن المائية الاعطاب بعد الحقن. الخاصية هيالابلي الذاتي تمكن المائية أن تكون عن طريق الحقن، مما يعني ضمناً التطبيقات المحتملة الهلاميات المائية كالحقن شركات متعددة. لمواصلة تقييم هذه المائية كحاملة خلية القابلة لحقن، أجريت تجربة محاكاة الحقن وتثقيف بعد. تم تحميله في حقنه المائية الخلية المدمجة ويضيق طبق بيتري، تليها يوم 7 بعد استزراع العملية مع معدل البقاء وانتشار الخلايا درس بها من خلال إبرة ز 48.

كما هو موضح في الشكل 4A، يمكن القطع المائية مسحوق الاعطاب لإصلاح المائية متكاملة حوالي 1 ساعة بعد الحقن، ومفيدة في إيصال خلية. للخلايا في المائية، بالمقارنة مع أخذ الصورة بعد التغليف (الشكل 4A، إدراج الأيسر)، كثافة الخلية زيادة كبيرة بعد 7 أيام (الشكل 4A، إدراج الأوسط). في الرؤية الموسعة، أكثر تفصيلاً خلية فيشنال العملية التي تم العثور على بعض الخلايا أن تكون مقسمة إلى قسمين (الشكل 4A، إدراج الحق)، أكدت مباشرة بتكاثر الخلايا 3D في المائية. ويبين الشكل 4B الصور [كنفوكل] لفحوصات الخلايا الميت يعيش بعد الحقن وثقافة ما بعد التجربة. كثافة الخلايا المحقون زادت من الواضح مع بقاء خلية عالية (> 99 ٪)، مما يدل على انتشار الخلايا ناجحة في المائية 3D بعد الحقن. معرفة ما إذا كان تأثير الحقن معدل انتشار الخلايا، مقارنة بين تحليل الإحصاءات الكمية بالنسبة لمعدلات انتشار الخلايا في الهلاميات المائية مع أو بدون حقن المنجز (الشكل 4). معدل انتشار الخلايا بعد الحقن، على الرغم من انخفاض طفيف، ظلت في مستوى عال (~ 75%)، وعدد الخلايا زيادة 145% نسبيا بعد 7 أيام في الثقافة المائية، مشيراً إلى أن قوة القص أثناء الحقن قد ملاحظ محدود التأثير السلبي في انتشار الخلية.

وصفت لنا إجراء نموذجي لهذا التطبيق المائية ولكن الباحثين يمكن تعديل البروتوكول لتناسب الاحتياجات المحددة للبحث. جيلاتورس البوليمر تأثيراً كبيرا على المائية والقابلة للتعديل بسهولة. على سبيل المثال، يمكن بسهولة التلاعب التصلب من هذه المائية بنسب مختلفة من الشيتوزان غليكول والوتد مدافع جيلاتور. وفي الوقت نفسه، استخدام الوتد مدافع من الأوزان الجزيئية الأخرى يمكن أيضا الوفاء بهذا الهدف. كنا شماعة ك 4 في هذا البروتوكول، ولكن أيضا قد عمل شماعة 2 كيلو إلى 10 كيلو. عند استخدام أوتاد الأخرى، من المهم رصد الوقت جيليشن وصلابة على وجه التحديد. كما قد تعمل جيلاتورس البوليمر الوظيفية الأخرى إذا كان الباحثون مهارات التوليف تحضير البوليمرات إنهاء benzaldehyde وظيفية محددة17.

هذا البروتوكول له العديد من القيود. أولاً، نظراً للهيكل الديناميكي، التصلب من هذه المائية محدودة بالمقارنة مع رابطة تساهمية كروسلينكيد المائية. واحد قد تواجه حالات فشل تحضير الهلاميات المائية مع عالية جداً من تصميم معامل التحويل. ثانيا، هذا المائية الحيوية القابلة للتحلل، مما يحد من ثقافة خلية طويل الأجل داخل المائية. ثالثا، يقدم المائية بيئة زراعة كروسلينكيد ثلاثي الأبعاد يحتوي على الشواغل نشر. وحتى الآن، معظم بيو-التحليلات تستند إلى ثقافة 2D. بنية ثلاثية الأبعاد قد تعوق خلية أخرى تتعلق بدراسات فيفو.

عند استخدام هذا البروتوكول، وهناك العديد من الخطوات الهامة لمتابعة. أولاً، خلال توليف جيلاتور البوليمر الوتد مدافع، الجفاف مهم جداً. وثانيا، عند تنفيذ الإجراءات المتصلة بالخلية، عملية عقيمة أمر بالغ الأهمية. وثالثاً، ينبغي أن تتم مراقبة الوقت المصبوغة جيدا في الهلاميات المائية للحصول على صور جميلة [كنفوكل].

وباختصار، عرض البروتوكول إعداد السطحية على أساس الشيتوزان الحقن الهلاميات المائية، التي يتم تطبيقها كمنبر للثقافة خلية ثلاثية الأبعاد ويمكن أن توفر الرموز الميكانيكية قابل للتعديل لمختلف البحوث. قد سبق أن طبق في مجالات تتعلق بإيصال الأدوية والعلاج بالخلايا والورم العلاج الكيميائي، الذي لا يشهد على أدائها فحسب، بل يزيد أيضا من إمكاناتها للطب الحيوي وكالة اسوشييتد برسبليكيشنز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث "الوطني العلم مؤسسة في الصين" (21474057 و 21604076).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycol chitosan Wako Pure Chemical Industries 39280-86-9 90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 619-66-9 99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 538-75-0 99%
Calcium chloride anhydrous Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 10043-52-4 96%
4-dimethylamiopryidine Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 1122-58 99%
Polyethyleneglycol Sino-pharm Chemical Reagent 5254-43-7 99%
Tetrahydrofuran Sino-pharm Chemical Reagent 109-99-9 99%
Toluene Sino-pharm Chemical Reagent 108-88-3 99%
Ethyl ether Sino-pharm Chemical Reagent 60-29-7 99%
Acetic acid Sino-pharm Chemical Reagent 64-19-7 99%
Anhydrous CaCl2 Sino-pharm Chemical Reagent 10043-52-4 99%
Fluorescein diacetate Sigma 596-09-8 99%
Propidium iodide  Sigma 25535-16-4 94%
RPMI-1640 culture media Gibco
Fetal bovine serum Gibco
Trypsin-EDTA Gibco 0.25%
PBS Solarbio 0.01 M
Penicillin streptomycin solution Hyclone 10,000 U/mL
Rheometer TA Instrument AR-G2
Confocal microscope Zeiss 710-3channel
L929 Cells ATCC NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator EYELA N-1100
48 guage needle ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD 48-guage
Microscope Leica DM3000 B
Microscope software Imaris
Heat gun Confu KF-5843 
Petri dish NEST

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
  2. Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
  3. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  4. Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
  5. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
  6. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
  7. Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
  8. Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
  9. Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
  10. Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
  11. Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
  12. Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
  13. Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
  14. Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
  15. Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
  16. Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
  17. Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
  18. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
  19. Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
  20. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
  21. Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).

Tags

الكيمياء، 127 قضية، المائية، الشيتوزان غليكول، ايمين، هيدروجيل ذاتية هيالابل، المائية القابلة للحقن، وثقافة خلية ثلاثية الأبعاد
إعداد المستندة إلى الشيتوزان الهلاميات المائية القابلة للحقن وتطبيقه في ثقافة الخلية 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Zhang, Y., Wei, Y., Tao, L.… More

Li, Y., Zhang, Y., Wei, Y., Tao, L. Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (127), e56253, doi:10.3791/56253 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter