Summary
Nous décrivons ici une préparation facile des hydrogels injectables axée sur le chitosan aide chimie dynamique imine. Méthodes pour ajuster la résistance mécanique de l’hydrogel et son application en culture cellulaire 3D sont présentés.
Abstract
Le protocole présente une méthode facile, efficace et polyvalente pour préparer les hydrogels axée sur le chitosan aide chimie dynamique imine. L’hydrogel est préparé en mélangeant des solutions de chitosan de glycol avec un gelator de polymère synthétisé benzaldéhyde résilié et hydrogels sont efficacement obtenus en quelques minutes à température ambiante. Par divers ratios entre chitosane de glycol, gelator de polymère et des teneurs en eau, hydrogels polyvalents avec temps de gélification différents et rigidité sont obtenus. Si endommagé, l’hydrogel peut récupérer ses apparitions et du module, en raison de la réversibilité des liaisons dynamiques imine comme crosslinkages. Cette propriété se guérissables permet l’hydrogel à être injectable car il peut être autonome guéri de morceaux pressés d’un hydrogel intégrale en vrac après le processus d’injection. L’hydrogel est également multi-sensible aux nombreux stimuli bio-actifs en raison de statuts différents de l’équilibration des liaisons dynamiques imine. Cet hydrogel a été confirmé comme bio-compatibles et cellules de fibroblaste de souris L929 étaient embarqués suivant les procédures standards et la prolifération cellulaire a été évaluée facilement par un procédé de culture cellulaire 3D. L’hydrogel peut offrir une plate-forme réglable pour différentes recherches où un imitateur physiologique d’un environnement 3D pour les cellules est profité. Ainsi que ses propriétés multiples adaptées, Self guérissables et injectables, les hydrogels peut potentiellement être appliqués comme plusieurs transporteurs des médicaments et des cellules dans les futures applications bio-médicales.
Introduction
Les hydrogels sont des matériaux polymères réticulés avec de grandes quantités d’eau et des propriétés mécaniques douces et ils ont été utilisés dans nombreuses applications bio-médicales1,2. Hydrogels peuvent offrir un environnement doux et humide, ce qui est très similaire à l’environnement physiologique des cellules in vivo. Par conséquent, hydrogels sont devenus l’un des plus populaires utilisés pour 3D cell culture3,4. Par rapport à la culture cellulaire 2D Pétri, culture cellulaire 3D a progressé rapidement pour offrir qu'une matrice extracellulaire (ECM) imité le micro-environnement des cellules à contacter et assembler pour la prolifération et la différenciation des fins5. En outre, hydrogels contenant des polymères naturels pourrait offrir des environnements biocompatibles et promotion pour les cellules à proliférer et se différencier3. Hydrogels dérivés de polymères synthétiques sont préférés pour leurs composants simples et claires, qui excluent des influences complexes comme les protéines d’origine animale ou des virus. Parmi tous les candidats d’hydrogel pour culture cellulaire 3D, hydrogels qui sont facilement préparés et ont une propriété compatible sont toujours préférés. La possibilité d’ajuster les propriétés de l’hydrogel pour s’adapter aux exigences différentes recherches est importante en tant que puits6.
Ici, nous introduisons une préparation facile d’un glycol axée sur le chitosan hydrogel utilisant la chimie dynamique imine, qui devient une plateforme polyvalente hydrogel pour 3D cell culture7. Dans cette méthode, bien connu biocompatible glycol chitosan servent à établir les cadres des réseaux de l’hydrogel. Ses groupes aminés sont réagit avec un benzaldéhyde résilié polyéthylène glycol comme le gelator de polymère forment des liaisons dynamiques imine comme crosslinkages des hydrogels8. Liaisons dynamiques imine peuvent former et se décomposent réversiblement et adaptée à un environnement, dotant les hydrogels avec réglage mécanique réticulé réseaux9,10,11. En raison de sa teneur en eau élevée, matériaux biocompatibles et résistances mécaniques réglables, l’hydrogel est appliquée avec succès comme un échafaudage pour les cellules L929 3D cell culture12,13. Le protocole ici en détail les procédures, y compris la synthèse des polymères gelator, hydrogel préparation, cellule intégration et mise en culture cellulaire 3D.
L’hydrogel montre également plusieurs autres fonctionnalités en raison de son crosslinkages imine dynamique, y compris ses multiples adaptés à divers bio-stimulants (acide/pH, pyridoxal dérivés de vitamine B6, papaïne protéine, etc.), ce qui indique que l’hydrogel peut être induit à se décomposer sous des conditions physiologiques8. L’hydrogel est également automatique guérissables et injectable, qui signifie l’hydrogel pourrait être administré via une méthode d’injection invasive minimale et obtenir un avantage dans la drogue et la cellule livraisons14,15. En ajoutant des additifs fonctionnels ou gelators polymère préconçu spécifique, l’hydrogel est compatible à l’obtention de propriétés spécifiques comme magnétique, température, pH réactif, etc.16,17, ce qui pourrait remplir un large gamme de besoins de recherche. Ces propriétés révèlent capacité potentielle de l’hydrogel pour être un injectable plusieurs porteuses des médicaments et des cellules dans des applications et de recherches bio-médicales in vitro et in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
attention : veuillez consulter toutes les fiches signalétiques (FS) avant utilisation. S’il vous plaît utiliser les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution des expériences de chimie, y compris l’utilisation d’une hotte de laboratoire et des équipements de protection individuelle (lunettes, gants, blouse de laboratoire, etc.). Le protocole exige des cellules standard (stérilisation, récupération de cellules, cellule passage, gel cell, cellule coloration, etc.) des techniques de manutention.
1. préparation des Hydrogels
- synthèse du benzaldéhyde résilié fonctionnalisés di polyéthylène glycol (PEG DF)
- avant la dessiccation du PEG polymère
- peser 4,00 g PEG (MW 4 000, 1,00 mmol), transférer dans un ballon à fond rond (250 mL) et ajouter le toluène (100 mL).
Remarque : Autres pinces avec des poids moléculaires différents peuvent travailler pour la formation d’hydrogel mais conduira à différent raideur. - Chauffer la solution par un pistolet à air chaud (ou une plaque de cuisson autour de 40 ° C) légèrement pour aider à dissoudre tous les polymères. Après que tous les polymères se dissolvent, utiliser un évaporateur pour supprimer tous les solvants. Répétez ce processus sec et dissoudre deux fois pour faire le PEG séché polymères.
ATTENTION : Ceci doit être effectuée sous une hotte avec un soin extrême. Le toluène est inflammable.
- peser 4,00 g PEG (MW 4 000, 1,00 mmol), transférer dans un ballon à fond rond (250 mL) et ajouter le toluène (100 mL).
- Réaction de terminaison benzaldéhyde de PEG
- Ajouter un agitateur magnétique et le tétrahydrofurane (THF, 100 mL) dans le ballon et dissoudre la cheville à l’aide d’un agitateur. Ajouter 4-carboxybenzaldéhyde (0,90 g, 6,0 mmol) et la 4-diméthylaminopyridine (0,07 g, 0,6 mmol) séquentiellement aux solutions pour dissoudre tous les solides complètement.
- Add N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) à la solution et ajouter un tube de séchage qui est rempli d’anhydre CaCl 2 au ballon. Laissez la réaction sous agitation à température ambiante (~ 20 ° C) pendant environ 12 h.
- Processus de réaction post
- Filtrer les blancs solides générés dans la solution par le vide après la réaction est terminée. Versez la solution dans l’éther diéthylique froid (500 mL) en remuant pour précipiter les solides blancs. Rassembler tous les solides blancs par filtre et sécher les solides sous une hotte.
- Dissoudre les solides blancs en THF à nouveau, filtrer toute insolubles solides blancs, verser la solution dans la fraîche froide diéthyléther à précipiter les solides blancs et séchez-le. Répétez cette opération deux ou trois fois et puis placez les solides blancs dans un four de séchage sous vide (20 ° C, 0,1 mbar) pour les faire sécher complètement. Recueillir la poudre blanche que le produit final : benzaldéhyde résilié PEG DF.
- avant la dessiccation du PEG polymère
- Préparation des hydrogels
- peser des quantités différentes de DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol ; 0,22 g, 0,055 mmol ; 0,44 g, 0,110 mmol) dans un tube (10 mL), ajouter de l’eau désionisée (5,0 mL) et utiliser un vortex ou agitateur magnétique pour aider dissoudre le polymère.
- Dissoudre glycol chitosan (0,495 g, 6,18 x 10 -3 mmol) dans l’eau désionisée (15,0 mL) dans un tube (50 mL) et utiliser un vortex pendant quelques minutes pour homogénéiser la solution de chitosan (3 % en poids).
- Ajouter la solution de chitosan de glycol (0,2 mL, 3 % en poids) et DF PEG (0,2 mL) séquentiellement dans un tube (2,0 mL). Utiliser un vortex pour mélanger les solutions homogène aux hydrogels de forme en quelques minutes. Suivre les ratios dans le tableau 1 pour rendre les hydrogels de différentes résistances mécaniques.
Remarque : Utilisez la méthode tube inversé afin de déterminer si l’hydrogel a déjà formé.
- Des analyses de rhéologie
- réaliser des analyses de rhéologie sur un rhéomètre rotationnel avec une plaque d’acier parallèle (diamètre : 20 mm). Pour le test de gélification, répandre la solution de chitosan glycol (0,2 mL, 3 % en poids) sur une plaque inférieure. Ensuite, ajouter les solutions aqueuses de DF PEG (0,2 mL, 2 % en poids) uniformément goutte sur la surface de solution de chitosan et mélanger rapidement avec une pipette. Plus bas vers le bas de la plaque supérieure et commencer à tester
- D’hydrogel ' test de rigidité s, couper un hydrogel en un cercle (diamètre : 20 mm) et de mesurer le module de stockage (G ') valeurs en fonction des analyses de fréquence à une déformation de 1 %. G typique ' valeurs à 6,3 rad s − 1 sont répertoriés dans le tableau 1.
Note : Effectuer les analyses de la rhéologie de l’hydrogel 0,5 h après la formation d’hydrogel pour assurer la stabilisation de la liaison dynamique de l’hydrogel. - Pour l’hydrogel ' propriété Self guérissables s test, couper un hydrogel en morceaux et rassembler les morceaux d’auto-guérison pour une pièce intégrale. Puis couper le morceau d’hydrogel pour faire un cercle (diamètre : 20 mm) et placez-le sur le rhéomètre pour effectuer l’analyse rhéologique.
2. la culture cellulaire 3D en Hydrogels
- préparation des solutions de gélification hydrogel
- DF peser PEG (0,44 g, 0,11 mmol) dans un tube stérile (4,0 mL), ajouter dans les milieux de culture cellulaire (RPMI-1640, 2.0 mL) et utiliser un vortex ou agitateur pour aider à dissoudre le polymère pour obtenir la solution de polymère (20 % en poids). Chargez la solution dans une seringue (10,0 mL) et ensuite de le stériliser en le faisant passer à travers un filtre anti-microbien micron (0,22 µm).
- Peser le chitosane de glycol (0,165 g, 2,06 x 10 -3 mmol) dans un tube stérile (15,0 mL), ajouter dans les milieux de culture cellulaire (RPMI-1640, 4,0 mL) et vortex pour aider à dissoudre le polymère pour obtenir la solution de chitosan de glycol (4,0 % en poids). Chargez la solution dans une seringue (10,0 mL) et de la filtrer avec un filtre anti-microbien 0,22 µm.
- Culture cellulaire en hydrogels
attention : effectuer tous procédures connexes sous une hotte de vitroplants de cellules. Connaissance de base de la technique de stérilisation est prévu.- Préparation de la suspension de cellules
- cellules L929 de Culture en milieu RPMI-1640 additionné de 10 % BF, la pénicilline (10 mL) de 5 % à un Petri dish (diamètre 10 cm) et incuber à 37 ° C, 5 % de CO 2. Changer le milieu chaque jour avant l’utilisation.
- Récolter les cellules L929 avec du PBS contenant de la trypsine (0,025 % w/v) et l’EDTA (0,01 % p/v), puis centrifuger (70 x g, 5 min) et remettre en suspension les cellules dans le milieu RPMI-1640 (1,0 mL). Effectuer le comptage des cellules à l’aide de fonctionnement standard de comptage sang Conseil. Remettre en suspension les cellules pour ajuster la concentration en cellules à ~ 3,75 × 10 6 cellules/mL.
- Encapsulation de cellules dans des hydrogels
- solution de chitosan de glycol (0,4 mL) dans un tube (4,0 mL) par vortex se mêlent les suspensions de cellules L929 (0,4 mL, 3,75 x 10 6 cellules mL -1). Pipetter, la solution de chitosan L929/glycol (0,8 mL) dans le centre d’un plat de Pétri confocale (diamètre 2,0 cm). Dans le même plat, déposer les solutions de PEG DF (0,2 mL) et Pipetez doucement pour mélanger la solution et d’induire la formation de l’hydrogel.
Remarque : Évaluer la formation de l’hydrogel en inclinant le Pétri. - Pour la culture cellulaire directe, ajouter des montants supplémentaires de milieux de culture RPMI-1640 (1,0 mL) sur le dessus de l’hydrogel. Mettre les hydrogels cellule intégrée (1,0 mL, wt 1,5 % glycol chitosan, 4,0 % en poids DF PEG, 1,5 × 10 6 cellules mL -1) dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO 2) et changer le support de tous les jours. Se préparer pour l’imagerie cellulaire jour 1, 3, 5 et 7, après l’encapsulation de cellules.
- solution de chitosan de glycol (0,4 mL) dans un tube (4,0 mL) par vortex se mêlent les suspensions de cellules L929 (0,4 mL, 3,75 x 10 6 cellules mL -1). Pipetter, la solution de chitosan L929/glycol (0,8 mL) dans le centre d’un plat de Pétri confocale (diamètre 2,0 cm). Dans le même plat, déposer les solutions de PEG DF (0,2 mL) et Pipetez doucement pour mélanger la solution et d’induire la formation de l’hydrogel.
- Pour la culture post de cellule 3D en hydrogels après injection, préparer la cellule chargé hydrogel (1,0 mL, reportez-vous à l’étape 2.2.2) dans une seringue (10,0 mL, 48 G aiguille). Après les formes d’hydrogel, injecter l’hydrogel lentement dans une boîte de Pétri pour l’imagerie confocale. Ajouter un montant additionnel de milieux de culture (1,0 mL) sur le dessus de l’hydrogel et changez-la tous les jours. Mettre la boîte de Pétri dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO 2) et se préparer pour l’imagerie par la suite.
ATTENTION : Veuillez vérifier et suivre le protocole de fonctionnement de sécurité d’une seringue.
- Préparation de la suspension de cellules
- Analyse de viabilité de cellules
- confocale observation
- Rincer les hydrogels avec du PBS (1,0 mL) deux fois. Tacher les hydrogels avec fluorescéine diacétate (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) et solutions de propidium iodure (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) pendant 15 min. Après coloration, retirer tous les solvants.
- Observer les hydrogels à l’aide d’un microscope confocal sous excitation longueurs d’onde de 488 nm et 543 nm pour visualiser en direct et morts cellules, respectivement. Prendre z-piles grâce à chaque profondeur de 2 µm de l’hydrogel pour valider une répartition uniforme des cellules tout au long de.
Remarque : FDA taches des cellules vivantes tandis que PI taches mortes.
- Dégradent l’hydrogel (1,0 mL) avec de l’acide acétique (HAc, 3 v %, 1,0 mL) pendant 5 min et pipette dans un tube (4,0 mL). Prélever des cellules par centrifugation (70 x g, 5 min) et remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture cellulaire RPMI-1640 (1,0 mL). Effectuer le comptage des cellules à l’aide d’un sang comptage Conseil.
- confocale observation
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Une présentation schématique du présent protocole sur la préparation de l’hydrogel et son utilisation comme culture cellulaire 3D est offert à la Figure 1. Information des contenus et des rapports préparés avec différentes résistances mécaniques de l’hydrogel est résumée dans le tableau 1. L’hydrogel de self guérissables et propriété de rhéologie présente la raideur de l’hydrogel de module de stockage par rapport à la fréquence de test dans la Figure 2. Les images confocales de cellule et le nombre de cellules avec jours de culture en hydrogels est présenté dans la Figure 3, qui confirme la viabilité cellulaire et la prolifération cellulaire par l’intermédiaire de la culture cellulaire 3D. La figure 4 présente la microscopie confocale images et analyse des taux de prolifération cellulaire des cellules intégrées dans les hydrogels qui a subi l’injection et la culture après. Viabilité cellulaire élevée et la prolifération des cellules indiquent que les cellules intégrées dans l’hydrogel ne subi aucun préjudice destructrice et qu’il pourraient récupérer par la culture post, indiquant l’injectabilité de l’hydrogel.
Figure 1 : Préparation de l’hydrogel et son utilisation comme culture cellulaire 3D. (A) Hydrogel préparation ; (B) cellule de préparation de la solution ; (C) la culture cellulaire 3D en hydrogels avec ou sans injection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Hydrogel raideur. Module de stockage G' versus fréquence de (A) origine et hydrogels Self cicatrisés (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La culture cellulaire 3D dans l’hydrogel. (A) 3D images confocales de cellules L929 incorporé dans la résistance raide hydrogel (vert : vivent les cellules ; Rouge : les cellules mortes) ; (B) cellule de comptage des résultats des cellules L929 incorporés dans l’hydrogel après l’encapsulation de cellules au moment notée. Echelle = 300 µm. les données présentées comme moyenne ± écart-type. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Cellule 3D après culture en hydrogel après injection. (A) A l’image schématique d’injection et de la culture post d’un hydrogel chargés en cellule. Insertion : Images de microscopie des cellules intégrées dans hydrogels avant injection (à gauche) et après la culture cellulaire après les 7 jours (milieu et droite). Echelle = 100 µm ; (B) les images confocales de cellules L929 incorporé dans un hydrogel de vive force et post cultivés après injection (vert : vivent les cellules ; Rouge : les cellules mortes), barre d’échelle = 300 µm ; (C), une comparaison entre le taux de prolifération des cellules cultivées en hydrogels avec ou sans injection après encapsulation. Données présentées comme moyenne ± SD. (adapté de référence12; Copyright © 2017 Elsevier). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Rigidité de l’hydrogel | Mous | Médium | Stiff |
| Glycol chitosan (mg) | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| DF PEG (mg) | 4.4 | 8.8 | 17,6 |
| Teneur en polymère gelator (% poids) | 1 | 2 | 4 |
| Eau désionisée (mL) | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| Gelaion temps (min) | 7.5 | 5 | 3.5 |
| G' (AP)* | 900 | 2100 | 4700 |
| * testé sous fréquence 6,3 rad s-1, 1 % à l’aide d’une plaque en parallèle de la souche (diamètre 20 mm) sur un rhéomètre rotationnel. |
Tableau 1 : Information des hydrogels préparés avec différentes résistances mécaniques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’hydrogel présentée dans le présent protocole (Figure 1) comporte deux grands volets : le chitosan de glycol polymère naturel et un benzaldéhyde synthétique fin gelator polymère DF PEG, qui sont les deux matériaux biocompatibles. Synthèse de DF PEG est présentée à l’aide d’une réaction de modification en une seule étape. PEG de poids moléculaire de 4 000 a été choisie dans le présent protocole dans les préoccupations de solubilité, efficacité de la modification, ainsi que raideur hydrogel. Une série d’hydrogels avec différentes résistances mécaniques ont été préparés à l’aide de différentes matières solides et les ratios de glycol chitosan et DF PEG. Hydrogels homogènes se forment rapidement en quelques minutes en mélangeant des solutions de gélification sous la température de la pièce, bien que la vitesse de congélation pourrait également ralentir en solutions diluées. Test de rhéologie a été utilisée pour évaluer les résistances mécaniques des hydrogels différents. Les modules de stockage (G') de ces hydrogels trouvées diffère environ 900 Pa (soft), 2 100 Pa (moyen) à 4 700 Pa (raide) (tableau 1 et Figure 2 a). Cela a contribué à la plus forte densité de réticulation en ajoutant les plus gelators de polymère dans le réseau d’hydrogel, résultant dans le module de stockage élevé (plus de rigidité). La propriété auto guérissables est également confirmée par récupération du module de l’hydrogel (Figure 2 b). On sait que la raideur de l’ECM est différent pour différents tissus, ainsi l’hydrogel pourrait offrir des indices mécaniques réglables et recherche différentes exigences de divers rapports de glycol chitosan à DF PEG polymère gelators18.
Les cellules L929, une lignée de cellules de fibroblaste de souris typique avec in vivo environnement tissulaire rigidité ~ 5 600 pa19, a été utilisé comme un modèle de cellule pour être embarquée dans l’hydrogel. Après l’encapsulation de cellules en hydrogels, il peut être facilement observé que les cellules dans les hydrogels a montré la viabilité extrêmement élevée (> 99 %) tout au long du processus de culture, confirmant l’excellente biocompatibilité de l’hydrogel axée sur le chitosan. Une augmentation remarquable de densité cellulaire dans l’hydrogel implicite que cet hydrogel peut appuyer la prolifération des cellules L929 même sans extra-ajout des facteurs de croissance (Figure 3 a). Après 7 jours de culture dans l’hydrogel, le nombre de cellules a augmenté de 300 % (Figure 3 b). Il est rapporté que les cellules cultivées dans les échafaudages pouvaient différencier suivant les signaux mécaniques20,21, qui pourrait impliquer des recherches plus poussées à l’aide de cette méthode de culture hydrogel 3D.
L’implantation de cellules avec des hydrogels injectables a acquis des avantages incomparables pour améliorer considérablement l’efficacité de la livraison et la viabilité des cellules implantées14. Dans un réseau de RETICULE imine dynamique, l’hydrogel pourrait auto-guérison après l’injection. La propriété auto guérissables permet l’hydrogel à être injectable, qui implique des applications potentielles pour les hydrogels comme injectable porteuses multiples. Pour mieux évaluer cet hydrogel comme un transporteur de cellule injectable, une expérience d’injection-imitant et post-culture a été réalisée. L’hydrogel cellule intégrée a été chargé dans une seringue et évincés au moyen d’une seringue de 48 G dans une boîte de Pétri, suivie d’une journée 7 post-culture processus avec taux de viabilité et de la prolifération de cellules étudié.
Comme illustré à la Figure 4 a, les pièces de l’hydrogel ratatinée pourraient auto-guérison pour réformer un hydrogel intégré environ 1 h après l’injection, ce qui est utile dans la prestation de la cellule. Pour les cellules de l’hydrogel, en comparaison avec l’image a pris juste après encapsulation (Figure 4 a, insert gauche), la densité cellulaire a augmenté considérablement après 7 jours (Figure 4 a, insert central). Dans la vision élargie, plus détaillée des processus cellulaires-fissional dans lequel certaines cellules sont trouvent être divisée en deux (Figure 4 a, encart de droite), a confirmé directement par la prolifération des cellules 3D de l’hydrogel. Figure 4 b montre les images confocales de l’essais sur des cellules de mort vivre après l’injection et de la culture post expérience. La densité des cellules injectées augmente évidemment avec une viabilité cellulaire élevée (> 99 %), démontrant la prolifération des cellules réussie l’hydrogel en 3D après injection. Pour savoir que si l’injection affecte le taux de prolifération cellulaire, une comparaison de l’analyse des statistiques quantitatives pour le taux de prolifération cellulaire dans les hydrogels avec ou sans injection a été réalisée (Figure 4). Le taux de prolifération cellulaire après l’injection, bien que légèrement diminué, est resté à un niveau élevé (~ 75 %) et le nombre de cellules a augmenté de 145 % relativement après 7 jours de culture dans l’hydrogel, indiquant que la force de cisaillement pendant l’injection a une observable peu d’influence négative sur la prolifération cellulaire.
Nous avons décrit une procédure typique de cette application d’hydrogel, mais les chercheurs peuvent modifier le protocole pour s’adapter aux exigences spécifiques de recherche. Gelators polymère ont une influence significative sur l’hydrogel et sont facilement modifiables. Par exemple, la rigidité de cet hydrogel peut être facilement manipulée par différentes proportions de glycol chitosan et DF PEG gelator. Pendant ce temps, l’utilisation de DF PEG des autres masses moléculaires puisse également remplir cet objectif. Nous avons utilisé PEG 4K dans le présent protocole, mais fonctionne également PEG 2 à 10K. Lorsque vous utilisez d’autres chevilles, il est important de surveiller le temps de gélification et rigidité plus précisément. Autres gelators de polymères fonctionnels peuvent également travailler si les chercheurs disposent des compétences de synthèse pour préparer les polymères se terminant par benzaldéhyde fonctionnels particuliers17.
Ce protocole a plusieurs limitations. Tout d’abord, en raison de la structure dynamique, la rigidité de cet hydrogel est limitée par rapport à un liaison covalente réticulé hydrogel. L'on peut rencontrer des échecs pour préparer les hydrogels avec trop élevée d’une conception de module. Deuxièmement, cet hydrogel est bio-dégradable, limitant ainsi la culture de cellule à long terme au sein de l’hydrogel. Troisièmement, l’hydrogel offre un milieu de culture réticulé 3D qui s’inquiète de la diffusion. A ce jour, la plupart des bio-analyses reposent sur la culture 2D. La structure 3D pourrait entraver les autres cellules liées études in vivo.
Lorsque vous utilisez ce protocole, il y a plusieurs étapes essentielles à suivre. Tout d’abord, au cours de la synthèse de la gelator de polymère DF PEG, la déshydratation est très importante. Deuxièmement, lorsque vous effectuez les procédures connexes, opération stérile est critique. Troisièmement, le temps de coloration doit être bien contrôlé dans les hydrogels pour obtenir de belles images confocales.
En résumé, le protocole introduit une préparation facile des hydrogels injectables axée sur le chitosan, qui sont appliquées comme une plate-forme pour la culture cellulaire 3D et pourrait offrir des signaux mécaniques réglables pour diverses recherches. Il a déjà été appliquée dans des domaines concernant l’administration de médicaments, thérapie cellulaire et chimiothérapie de tumeur, qui non seulement est un témoignage de ses performances, mais augmente également son potentiel pour ap biomédicaleplis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le National Science Foundation de Chine (21474057 et 21604076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
