Summary
כאן נתאר להכנת נתיישב hydrogels להזרקה מבוסס משקם באמצעות הכימיה אימין דינמי. שיטות להתאמת חוזק מכני של הידרוג ויישומה בתרבות תא 3D מוצגים.
Abstract
הפרוטוקול מציג שיטה נתיישב, יעיל, ו תכליתי כדי להכין hydrogels מבוססי משקם באמצעות הכימיה אימין דינמי. הידרוג מוכן על ידי ערבוב פתרונות של גליקול משקם עם gelator פולימר benzaldehyde מסונתז הסתיים, hydrogels מתקבלים ביעילות תוך מספר דקות בטמפרטורת החדר. על ידי יחסי משתנות בין גליקול משקם, פולימר gelator ותוכן מים, מתקבלים hydrogels רב-תכליתי עם gelation שונים פעמים וקשיחות. כאשר פגום, הידרוג יכול לשחזר שלה הופעות, המודולוס, בשל הפיכות מכבלי אימין דינמי כמו crosslinkages. מלון healable עצמית זה מאפשר את הידרוג להיות להזרקה, שכן הוא יכול להיות עצמי נרפא מפיסות סחוט הידרוג בצובר נפרד לאחר תהליך ההזרקה. הידרוג הוא גם רב מגיב לגירויים ביו-אקטיביות רבות בשל מצבים שונים equilibration מכבלי אימין דינמי. הידרוג הזה אושר כמו ביו-תואם, תאי פיברובלסט העכבר L929 היו מוטבעים הבאים הליכים סטנדרטיים, התפשטות תא הוערכה בקלות על ידי תהליך הטיפוח תא תלת-ממד. הידרוג יכולים להציע פלטפורמה מתכווננת למחקר אחר שבו לחקות פיזיולוגיים של סביבה תלת-ממד עבור תאים הוא מרוויח. יחד עם תכונותיו רב מגיב healable עצמית, זריקות, פוטנציאל ניתן להחיל את hydrogels כמו ספקים מרובים עבור תאים יישומים ביו-רפואיים עתידיים וסמים.
Introduction
Hydrogels הם חומרים פולימריים תפור עם כמויות גדולות של מים רכים תכונות מכניות, הם שימשו. יישומים ביו-רפואיים רבים1,2. Hydrogels יכולים להציע סביבה רך ורטוב, אשר דומה מאוד הסביבה פיזיולוגיים עבור תאים ויוו. לכן, hydrogels הפכו לאחד פיגומים הפופולרי ביותר עבור תא 3D-תרבות-3,-4. בהשוואה ל תרבית תאים 2D פטרי, תרבית תאים 3D התקדמה במהירות להציע שמטריצה חוץ-תאית (ECM) חיקה microenvironment עבור תאים ליצור קשר עם ולהרכיב למטרות של התפשטות ובידול -5. בנוסף, hydrogels המכילה פולימרים טבעיים יכול להציע ביו תואמי וקידום סביבות עבור תאים להתרבות, להבדיל3. Hydrogels נגזר פולימרים סינתטיים עדיפים רכיבי שלהם פשוטה וברורה, אשר לא לכלול השפעות מורכבות כמו חיה-מקור חלבונים או וירוסים. בין כל הידרוג המועמדות תרבית תאים 3D, hydrogels מוכנים בקלות, יש מאפיין עקבי הם תמיד המועדף. המתקן כדי להתאים את המאפיינים של הידרוג כדי להתאים לדרישות מחקר שונים חשוב כמו טוב6.
כאן אנו מציגים נתיישב הכנת גליקול מבוססי משקם הידרוג באמצעות כימיה אימין דינאמי, אשר הופכת פלטפורמה תכליתי הידרוג תרבות תלת התא7. בשיטה זו, משקם גליקול ביו תואמי ידועים משמשים להקים מסגרות של הרשתות של הידרוג. קבוצות אמינו שלה הם הגיבו benzaldehyde הסתיים פוליאתילן גליקול כמו פולימר gelator כדי ליצור חוב אימין דינמי כמו crosslinkages של hydrogels8. אימין דינמית אג ח ניתן ליצור, מתפרקים הפיכה ואת responsively לסביבתם, שהעניקו את hydrogels עם תפור באופן מכני מתכוונן רשתות9,10,11. בשל שלה לתוכן מים גבוהה, חומרים ביו-תואם, חוזק מכני מתכוונן, הידרוג מיושמת בהצלחה בדומה לפיגום עבור תאים L929 תא 3D תרבות12,13. פרוטוקול כאן פרטים ההליכים, לרבות פולימר gelator סינתזה, הכנה הידרוג, תא הטבעה culturing תא תלת-ממד.
הידרוג מציגה גם מספר תכונות אחרות בשל שלה crosslinkages אימין דינמיים, כולל שלה רב מגיב לגירויים שונים ביו-(חומצה/pH, pyridoxal נגזרות ויטמין B6, חלבון פפאין, וכו '), המציין כי הידרוג יכול להיות המושרה מתפרקת תחת התנאים הפיזיולוגיים8. הידרוג הוא גם עצמית healable להזרקה, מה שאומר הידרוג אפשר יהיה לנהל באמצעות שיטת הזרקת פולשני מינימלי ולהשיג יתרון סמים ותא משלוחים14,15. על ידי הוספת תוספים תפקודית או פולימר ספציפיות מוגדרות מראש gelators, הידרוג מתאים להשגת מאפיינים ספציפיים כמו מגנטי, טמפרטורה, pH מגיבים, ועוד16,17, אשר יכול להגשים מגוון רחב של דרישות המחקר. מאפיינים אלה חושפים יכולת פוטנציאלית של הידרוג ניתן בהזרקה ספקים מרובים עבור תאים בתוך חוץ גופית ו ויוו מחקר ביו-רפואי והן יישומים וסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אזהרה: נא היוועץ כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני השימוש. אנא השתמש נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע ניסויים בכימיה, כולל השימוש של הוד fume וכן ציוד מגן אישי (בטיחות משקפיים, כפפות מגן, חלוק המעבדה, וכו '). הפרוטוקול מחייב תא רגיל בטיפול טכניקות (לחיטוי, שחזור תא, passaging תא, תא הקפאה, תא מכתים, וכד').
1. הכנה של Hydrogels
- סינתזה של benzaldehyde הסתיים di functionalized פוליאתילן גליקול (DF PEG)
- לייבוש מראש של פג פולימר
- שוקל 4.00 ג'י פג (4,000 מגה-וואט, 1.00 mmol), להעביר את זה לתוך בקבוקון התחתון עגול (250 מ"ל), ולהוסיף טולואן (100 מ"ל).
הערה: אחרים יתדות עם משקולות מולקולרית שונים יכולים לעבוד על היווצרות הידרוג אך יוביל קשיחות שונות. - מחממים את הפתרון על ידי אקדח חום (או פלטה בסביבות 40 ° C) במתינות כדי לעזור לפזר את כל פולימרים. לאחר כל פולימרים התמוססות, להשתמש של המאייד כדי להסיר את כל ממיסים. חזור על זה התמוססות ותהליך יבש פעמיים כדי להפוך פג מיובשים פולימרים.
התראה: זו צריכה להתבצע בשכונה fume בזהירות מרבית. טולואן הוא דליק.
- שוקל 4.00 ג'י פג (4,000 מגה-וואט, 1.00 mmol), להעביר את זה לתוך בקבוקון התחתון עגול (250 מ"ל), ולהוסיף טולואן (100 מ"ל).
- Benzaldehyde התגובה סיום של פג
- להוסיף פגים ו tetrahydrofuran (THF, 100 מ ל) ל הבקבוק, להמיס פג באמצעות של בחישה. להוסיף 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6.0 mmol) ו- 4-dimethylaminopyridine (0.07 g, 0.6 mmol) ברצף הפתרונות כדי להמיס כל מוצקים לחלוטין.
- הוסף N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1.25 g, 6.0 mmol) לפתרון, ולהוסיף צינור ייבוש מלא CaCl נטול מים 2 הבקבוקון. לשמור את התגובה תחת ערבוב בטמפרטורת החדר (~ 20 ° C) במשך כ- 12 ח'
- פוסט-תגובה תהליך
- לסנן מוצקים לבן המופקים הפתרון על ידי ואקום בסיום התגובה. שופכים את הפתרון לתוך קר דיאתיל אתר (500 mL) תחת זע, כדי לזרז את מוצקים לבן. לאסוף את כל המוצקים לבן על-ידי מסנן ויבשה מוצקים בשכונה fume.
- יתמוסס מוצקים לבן THF שוב, לסנן מוצקים לבן לא מסיסים, שופכים את הפתרון לתוך טריים דיאתיל קר, כדי לזרז את מוצקים לבן, לייבש אותו. חזור על תהליך זה שתיים עד שלוש פעמים, ולאחר מכן מקם מוצקים לבן בתנור ייבוש ואקום (20 ° C, 0.1 mbar) כדי לייבש אותם לחלוטין. לאסוף את אבקה לבנה כמו המוצר הסופי: benzaldehyde הסתיים DF פג.
- לייבוש מראש של פג פולימר
- הכנת hydrogels
- לשקול כמויות שונות של DF פג (0.11 גרם, 0.028 mmol גרם 0.22, 0.055 mmol; 0.44 g, 0.110 mmol) צינור (10 מ"ל), להוסיף מים יונים (5.0 מ"ל) ולהשתמש למערבולת או פגים כדי לעזור להמיס הפולימר.
- לפזר משקם גליקול (0.495 ז, 6.18 x 10 -3 mmol) במים יונים (15.0 מ ל) צינור (50 מ"ל), והשתמש מערבולת לכמה דקות כדי homogenize את הפתרון משקם (3 wt %).
- להוסיף את פתרון משקם גליקול (0.2 מ ל, 3 wt %) ו- DF יתד פתרונות (0.2 מ"ל) ברצף בצינור (2.0 מ"ל). השתמש מערבולת לערבב את הפתרונות homogeneously hydrogels טופס מספר דקות. בצע את היחס טבלה 1 כדי לגרום hydrogels של חוזק מכני שונה.
הערה: השתמש בשיטת היפוך-צינור כדי לקבוע אם הידרוג כבר הקים.
- Rheology ניתוחים
- לבצע rheology ניתוח על rheometer המסתובבת עם צלחת פלדה מקבילים (קוטר: 20 מ מ). עבור הבדיקה gelation, התפשטה פתרון משקם גליקול (0.2 מ ל, 3 wt %) על צלחת התחתון. לאחר מכן, מוסיפים DF יתד פתרונות מימית (0.2 מ"ל, 2 wt %) שווה dropwise על גבי המשטח פתרון משקם ומערבבים עם פיפטה במהירות. נמוך יותר למטה את הלוח העליון ולהתחיל כשהילדים
- עבור הידרוג ' s נוקשות מבחן, של הידרוג לחתוך עיגול (קוטר: 20 מ מ) ולמדוד את המודולוס אחסון (G ') ערכים לעומת ניתוח תדירות-זן 1%. G טיפוסי ' ערכים-ראד 6.3 s − 1 המפורטים בטבלה 1-
הערה: לבצע את הבדיקות rheology של הידרוג 0.5 h לאחר היווצרות הידרוג כדי להבטיח ייצוב דינמי בונד הידרוג- - עבור הידרוג ' s healable עצמי לבדוק, לחתוך חתיכות של הידרוג ורכוש לאסוף את החלקים יחד כדי self-heal אל כלי נפרד של. ואז לחתוך את פיסת הידרוג לעשות עיגול (קוטר: 20 מ מ), שים rheometer כדי לבצע את הניתוח rheology.
2. תא תלת-ממד, בטיפוח Hydrogels
- ההכנה של פתרונות gelation הידרוג
- שוקל DF פג (0.44 g, 0.11 mmol) בצינור סטרילי (4.0 מ"ל), להוסיף תא תרבות בתקשורת (RPMI-1640, 2.0 mL), ולהשתמש למערבולת או קדירות לעזור לפזר הפולימר להשגת הפתרון פולימר (20 wt %). לטעון את הפתרון ב מזרק (10.0 מ ל) ולחטא אותו לאחר מכן על ידי העברתו דרך מסנן חיידקים-לפרטים מיקרון (0.22 מיקרומטר).
- שוקל את משקם גליקול (0.165 g, 2.06 x 10 -3 mmol) בצינור סטרילי (15.0 מ ל), להוסיף תא תרבות המדיה (RPMI-1640, 4.0 מ"ל) ב, מערבולת כדי לעזור לפזר הפולימר להשגת הפתרון משקם גליקול (4.0 wt %). לטעון את הפתרון ב מזרק (10.0 מ ל) ולסנן אותו עם מסנן חיידקים-לפרטים מיקרומטר 0.22.
- תא בטיפוח hydrogels
זהירות: לבצע כל תא שגרות בשכונה תרביות רקמה. ידע בסיסי סטרילי טכניקה צפוי.- הכנה של השעיה תא
- התרבות L929 תאים RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS, 5% פניצילין (10 מ"ל) ב- פטרי צלחת (בקוטר 10 ס מ), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. מחליף המדיום כל יום לפני השימוש.
- לקצור את התאים L929 עם PBS המכיל טריפסין (0.025% w/v) ו- EDTA (0.01% w/v), ואז צנטריפוגה (70 x גרם, 5 דקות), מחדש להשהות את התאים בטווח הבינוני RPMI-1640 (1.0 מ"ל). לבצע ספירת תאים באמצעות הפעולה הרגיל של לוח ספירת דם. מחדש להשעות את התאים כדי להתאים את הריכוז תא ל ~ 3.75 × 10 6 תאים למ"ל.
- תא כימוס ב- hydrogels
- לערבב את המתלים תא L929 (0.4 mL, 3.75 x 10 6 תאים מ ל -1) עם פתרון משקם גליקול (0.4 מ"ל) צינור (4.0 מ"ל) על ידי מערבולת. Pipette הפתרון משקם L929/גליקול (0.8 מ ל) אל מרכז צלחת פטרי קונאפוקלית (קוטר 2.0 ס מ). Pipette הפתרונות DF פג (0.2 מ"ל) לתוך אותה המנה, פיפטה בעדינות כדי לערבב את הפתרון זירוז היווצרות הידרוג-
הערה: להעריך את היווצרות הידרוג בהטיית הפטרי. - לקבלת תרבית תאים ישירה, להוסיף סכומים נוספים של RPMI-1640 תרבות המדיה (1.0 מ"ל) על גבי הידרוג. לשים את hydrogels תא מוטבע (1.0 מ"ל, 1.5 wt % גליקול משקם, wt 4.0% DF פג, 1.5 × 10 6 תאים מ ל -1) בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) ושנה את המדיום כל יום. להתכונן תא הדמיה ביום 1, 3, 5 ו- 7 אחרי כימוס תא.
- לערבב את המתלים תא L929 (0.4 mL, 3.75 x 10 6 תאים מ ל -1) עם פתרון משקם גליקול (0.4 מ"ל) צינור (4.0 מ"ל) על ידי מערבולת. Pipette הפתרון משקם L929/גליקול (0.8 מ ל) אל מרכז צלחת פטרי קונאפוקלית (קוטר 2.0 ס מ). Pipette הפתרונות DF פג (0.2 מ"ל) לתוך אותה המנה, פיפטה בעדינות כדי לערבב את הפתרון זירוז היווצרות הידרוג-
- עבור התרבות שלאחר תא תלת-ממד ב- hydrogels לאחר ההזרקה, להכין הידרוג התא טעון (מל ' 1.0, ראה שלב 2.2.2) במזרק (10.0 mL, המחט 48 גרם). לאחר הטפסים הידרוג להזריק את הידרוג לאט לתוך צלחת פטרי עבור הדמיה קונפוקלי. להוסיף סכום נוסף של תרבות התקשורת (1.0 מ"ל) על גבי הידרוג ולשנות אותו כל יום. לשים את צלחת פטרי באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) ולהתכונן הדמיה לאחר מכן.
התראה: בבקשה לבדוק ולעקוב אחר הפרוטוקול מבצע בטיחות של מזרק.
- הכנה של השעיה תא
- תא הכדאיות ניתוח
- תצפית קונאפוקלית
- לשטוף את hydrogels עם PBS (1.0 מ"ל) עבור שתי פעמים. מכתים את hydrogels עם diacetate Fluorescein (ה-FDA, 0.5 mL, 0.05 מ"ג/מ"ל) ופתרונות יודיד (PI, 0.5 mL, 0.08 מ"ג/מ"ל) propidium למשך 15 דקות. לאחר צביעת, להסיר כל ממיסים את.
- לבחון את hydrogels באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי תחת עירור אורכי הגל של 488 ננומטר, 543 nm לדמיין חיים ומתים תאים, בהתאמה. לקחת את z-במחסן דרך כל עומק מיקרומטר 2 hydrogels כדי לאמת ריפודי כתופיים של תאים בכל רחבי.
הערה: ה-FDA כתמי תאים חיים בזמן PI כתמי תאים מתים.
- לבזות את הידרוג (1.0 מ"ל) עם חומצה אצטית (HAc, 3 v %, 1.0 מ"ל) במשך 5 דקות, פיפטה לתוך צינור (4.0 מ"ל). איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (70 x גרם, 5 דקות), מחדש להשעות את התאים RPMI-1640 תא תרבות בינוני (1.0 מ"ל). לבצע תא ספירת דם ספירת לוח.
- תצפית קונאפוקלית
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מצגת סכמטי של פרוטוקול זה על הידרוג ההכנה והשימוש בה כמו תרבית תאים 3D מוצע באיור1. פרטים של התוכן של הידרוג יחסי המוכנים חוזק מכני שונה מסוכם בטבלה1. הידרוג healable עצמית, rheology מאפיין מציג נוקשות של הידרוג על-ידי אחסון מודולוס לעומת מבחן תדירות באיור2. תמונות קונאפוקלית התא ואת מספרי הטלפון הנייד עם ימים תרבות hydrogels מוצגים באיור 3, המאשרת את התא הכדאיות ואת התפשטות תאים באמצעות תרבית תאים תלת-ממד. איור 4 מציג מיקרוסקופ, תמונות וידאו, וניתוח תא התפשטות המחירים עבור תאים נעוץ hydrogels שסבלו הזרקת ותרבות שלאחר. תא גבוהה הכדאיות והתפשטות תאים מצביעים על כך התאים נעוץ את הידרוג סבל אין נזק הרסני יכול לשחזר על-ידי תרבות פוסט, המציין injectability של הידרוג.
איור 1 : הכנת את הידרוג, את השימוש בשם תרבות תלת התא. (א) הכנת הידרוג; (B) תא הכנה ההשעיה; (ג) תרבית תאים תלת-ממד ב- hydrogels עם או בלי זריקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הידרוג נוקשות. אחסון מודולוס G' לעומת התדירות של (A) המקורי, hydrogels עצמית בריאה (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : תרבות תלת התא הידרוג- (A) 3D תמונות קונאפוקלית של תאים L929 נעוץ הידרוג כוח נוקשה (ירוק: לחיות תאים; אדום: תאים מתים); תא (B) סופר תוצאות של תאים L929 מוטבע הידרוג לאחר תא כימוס בזמן מסומן. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. נתונים שהוצגו כמו זאת אומרת ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : פוסט-תרבות תא 3D הידרוג לאחר ההזרקה- (א) א תמונה סכמטי של הזרקה של התרבות פוסט הידרוג שנטענו תא. הוספה: תמונות מיקרוסקופ של תאים מוטבע hydrogels לפני ההזרקה (משמאל) ואחרי תרבית תאים לאחר 7 ימים (התיכון וימינה). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר; (B) תמונות קונאפוקלית של תאים L929 נעוץ הידרוג כוח נוקשות ותרבותית פוסט לאחר ההזרקה (ירוק: לחיות תאים; אדום: תאים מתים), סולם בר = מיקרומטר 300; (ג) A השוואה של קצב התפשטות של תאים תרבותי ב hydrogels עם או בלי הזרקת לאחר אנקפסולציה. נתונים שהוצגו כמו זאת אומרת ± SD. (Adapted הפניה12; זכויות יוצרים © Elsevier 2017). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| הידרוג נוקשות | רך | בינוני | נוקשות |
| משקם גליקול (מ ג) | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| DF פג (מ ג) | 4.4 | 8.8 | 17.6 |
| פולימר gelator תוכן (wt %) | 1 | 2 | 4 |
| מים יונים (mL) | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| Gelaion הזמן (דקות) | 7.5 | 5 | 3.5 |
| G' (Pa)* | 900 | 2100 | 4700 |
| * בדקו תחת תדירות ראד 6.3 s-1, זן 1% באמצעות צלחת מקבילים (בקוטר 20 מ מ) על rheometer הסיבוב. |
טבלה 1: מידע hydrogels המוכנים חוזק מכני שונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הידרוג הוצג פרוטוקול זה (איור 1) מכיל שני רכיבים מרכזיים: את משקם גליקול פולימרים טבעיים, benzaldehyde סינתטי הסתיים פולימר gelator פג DF, אשר שניהם חומרים מסתיימים. סינתזה של DF פג מוצג באמצעות תגובת שינוי בשלב אחד. יתד של משקל מולקולרי 4,000 נבחר ב פרוטוקול זה, חששות, המסיסות, שינוי יעילות, וכן הידרוג נוקשות. סדרה של hydrogels עם חוזק מכני שונה הוכנו תוך שימוש שונות לתוכן מוצק יחסי של גליקול משקם, DF פג. Hydrogels הומוגנית נוצרו במהירות תוך דקות על ידי ערבוב gelation פתרונות מתחת לטמפרטורת החדר, למרות המהירות gelation יכול גם להאט על ידי תמיסות. מבחן rheology הועסק כדי להעריך את נקודות החוזק המכני של hydrogels שונים. מודולים אחסון (G ") של hydrogels האלה נמצאו דברים שונים כ 900 הרשות הפלסטינית (רך), 2,100 הפלסטינית (בינוני) 4,700 הרשות הפלסטינית (נוקשה) (טבלה 1 , איור 2A). זה תרמו crosslinking צפיפות גבוהה יותר על-ידי הוספת עוד פולימר gelators ברשת הידרוג, וכתוצאה מכך אחסון גבוה מודולוס (נוקשות יותר). המאפיין healable עצמית הוא אישר גם על ידי שחזור מודולוס של הידרוג (איור 2B). זה ידוע כי ECM נוקשות שונה בשביל לרקמות שונות, ובכך הידרוג יכול להציע רמזים מכני מתכוונן בדרישות מחקר שונים על ידי יחסי מגוונים בין גליקול משקם DF פג פולימר gelators18.
L929 תאים, קו תא פיברובלסט עכבר אופייני עם ויוו הסביבה רקמות קשיחות של ~ הרשות הפלסטינית 5,60019שימש כמודל תא ניתן להטביע את הידרוג. לאחר כימוס תא ב- hydrogels, זה יכול להיות בקלות שנצפו כי התאים hydrogels הראו הכדאיות גבוה ביותר (> 99%) לאורך כל התהליך תרבות, המאשרת את הביו מעולה של הידרוג מבוססי משקם. עלייה מרשימה של צפיפות התאים הידרוג נרמז הידרוג הזה יכול. לתמוך התפשטות התאים L929 גם בלי תוספת-נוסף גורמי גדילה (איור 3 א). לאחר 7 ימים בתרבות ב הידרוג, המספר הסלולרי עלה 300% (איור 3B). הוא דיווח כי התאים בתרבית, פיגומים יכולה להבחין בעקבות רמזים מכני20,21, אשר עשוי לרמוז מחקר נוסף בשיטה זו תרבות הידרוג תלת-ממד.
השתלת תאים עם hydrogels להזרקה צבר יתרונות שאין דומה לו מאוד לשפר את יעילות משלוח ואת הכדאיות של תאים מושתל14. בתוך רשת תפור אימין דינמי, הידרוג יכול self-heal לאחר ההזרקה. המאפיין healable עצמית מאפשר את הידרוג להיות להזרקה, ממנה משתמע יישומים אפשריים עבור hydrogels כמו בזריקות ספקים מרובים. להעריך עוד יותר את הידרוג כנשא התא להזרקה, בוצע ניסוי הזרקת מחקה, שלאחר culturing. הידרוג תא מוטבע הטעון מזרק, לחוץ דרך מחט 48 גרם לתוך צלחת פטרי, ואחריו יום 7 שלאחר culturing תהליך עם תא הכדאיות והתפשטות קצב למד.
כפי שמוצג באיור 4A, החלקים הידרוג מחוצה יכול self-heal לבצע רפורמה של הידרוג משולבת בערך 1 h לאחר ההזרקה, אפשרות שימושית במשלוח התא. עבור תאים הידרוג, כאשר לעומת התמונה לקח רק לאחר כימוס (איור 4A, הוספה השמאלי), צפיפות תא גדל באופן דרמטי לאחר 7 ימים (איור 4A, הוספה האמצעי). בחיזיון מוגדלות יותר מפורט תא-fissional תהליך שבו נמצאו תאים מסוימים כדי להיות מחולק לשני (איור 4A, הוספה נכון), אישר ישירות על ידי התפשטות תאים תלת-ממד ב- הידרוג. איור 4B מראה תמונות קונאפוקלית של מבחני תא חי-מת לאחר הזרקת וניסוי פוסט תרבות. הצפיפות של תאים מוזרק גדל ברור עם יכולת הקיום התא גבוהה (> 99%), הממחיש את התפשטות תאים מוצלחת ב- הידרוג 3D לאחר ההזרקה. כדי ללמוד שאם הזריקה מושפעות את קצב התפשטות התאים, השוואה של נתונים סטטיסטיים כמותיים ןועברל בבתי התפשטות תאים hydrogels עם או בלי הזרקת היה לבצע (איור 4C). קצב התפשטות התאים לאחר ההזרקה, אמנם ירד מעט, נותרה רמה גבוהה (~ 75%), מספר תאים מוגברת 145% יחסית לאחר 7 ימים בתרבות של הידרוג, המציין כי הכוח ההטיה במהלך ההזרקה יש נצפות מוגבל השפעה שלילית על התפשטות תאים.
אנו המתואר הליך טיפוסי של יישום זה הידרוג אבל חוקרים יכולים לשנות את פרוטוקול מחקר ספציפי לדרישות. פולימר gelators יש השפעות משמעותיות על הידרוג והם בקלות לשינוי. לדוגמה, הנוקשות של הידרוג הזה שאפשר לשלוט בקלות על ידי יחסים שונים של גליקול משקם, DF פג gelator. בינתיים, השימוש DF יתד של משקולות מולקולרית אחרים גם להגשים יעד זה. השתמשנו פג 4K בפרוטוקול זה, אך תיתכן גם עבודה פג 2K כדי 10K. כשמשתמשים אחרים יתדות, חשוב לנטר את gelation והזמן נוקשות במיוחד. Gelators פולימר פונקציונליים אחרים יפעלו גם אם החוקרים יש כישורים סינתזה כדי להכין ספציפיות תפקודית פולימרים המסתיימת benzaldehyde17.
פרוטוקול זה יש מספר מגבלות. ראשית, בשל מבנה דינמי, הנוקשות של הידרוג הזה הוא מוגבל לעומת הידרוג תפור קשר קוולנטי. אחד ייתכן שתיתקל בכשלים להכין hydrogels עם גבוה מדי של עיצוב מודול. שנית, זו הידרוג הוא ביו-מתכלים, ובכך יגביל את התרבות תאים לטווח ארוך בתוך הידרוג. שלישית, הידרוג מציע סביבת הטיפוח תפור תלת-ממדית הכוללת דיפוזיה חששות. נכון להיום, רוב הניתוחים הביו מבוססים על תרבות 2D. המבנה התלת-ממד עלול לעכב תאים נוספים הקשורים בלימודי vivo.
בעת שימוש בפרוטוקול זה, ישנם מספר שלבים קריטיים לעקוב. ראשית, במהלך הסינתזה של gelator הפולימר DF פג, התייבשות היא חשובה מאוד. שנית, בעת ביצוע הליכים הקשורים תא, מבצע סטרילי היא קריטית. שלישית, הפעם מכתימים צריכה להיות טוב נשלטת ב hydrogels כדי לקבל תמונות קונאפוקלית נחמד.
לסיכום, הפרוטוקול הציג הכנת נתיישב מבוססי משקם hydrogels להזרקה, אשר מוחלות כפלטפורמה ליצירת תרבית תאים 3D יכול להציע רמזים מכני מתכוונן על מחקרים שונים. זה כבר הוחל באזורים לגבי תרופות, טיפול בתאי הגידול כימותרפיה, אשר לא רק מעיד הביצועים שלו, אלא גם מגביר את הפוטנציאל עבור ap ביוplications.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הלאומי למדע קרן של סין (21474057 ו- 21604076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
