Summary
Målet med protokollen er at forberede keratin hydrolysat fra kylling fjer ved alkaline-enzymatisk hydrolyse og teste, om tilføjelse af keratin hydrolysat i en kosmetik salve base forbedrer hudens barriere funktion (hvilket øger hydrering og faldende transepidermal vandtab). Tests er udført på mænd og kvinde frivillige.
Abstract
Keratin hydrolysater (KHs) er etableret standardkomponenter i hår kosmetik. Forstå de fugtgivende effekt på KH er fordelagtige for hudpleje kosmetik. Målene for protokollen er: (1) at behandle kylling fjer i KH ved alkaline-enzymatisk hydrolyse og rense det ved dialyse, og (2) hen til overhøre selv tilføje KH i en salve base (OB) øger hydrering af huden og forbedrer hudens barriere funktion ved faldende transepidermal vandtab (TEWL). Under alkaline-enzymatisk hydrolyse inkuberes fjer først ved en højere temperatur i et alkalisk miljø og derefter under milde betingelser, hydrolyseres med proteolytiske enzym. Løsning af KH er dialysebehandling, vakuum tørres og formales til et fint pulver. Kosmetiske formuleringer bestående af olie i vand emulsion (O/W) der indeholder 2, er 4 og 6 vægtprocent af KH (baseret på vægten af OB) forberedt. Test de fugtgivende egenskaber for KH er udført på 10 mænd og 10 kvinder med gang intervaller af 1, 2, 3, 4, 24 og 48 h. testet formuleringer er spredt på affedtede volar underarmen websteder. Huden hydrering af stratum corneum (SC) vurderes ved at måle kapacitans af huden, som er en af de mest verdensomspændende anvendte og enkle metoder. TEWL er baseret på at måle mængden af vandet transporteres pr. et afgrænset område og periode fra huden. Begge metoder er fuldstændig ikke-invasiv. KH gør for en fremragende okklusiv; afhængigt af tilsætning af KH i OB bringer det en 30% reduktion i TEWL efter ansøgning. KH også fungerer som en fugtighedsbevarende middel, da det binder vand fra de lavere lag af epidermis til SC; ved optimal KH tilføjelsen i OB opstår op til 19% stigning i hydrering i mænd og 22% stigning i kvinder.
Introduction
Slagterier, fødevareindustrien og garvning industri producere årligt enorme mængder af solid keratin biprodukter-uld, fjer, børster, klove, kløer, horn og lignende. Ifølge seneste statistiske data er den samlede levende vægt af høns, kalkuner, ænder og andre slagtede fjerkræ i USA 62,5 milliarder pund pr. år1; i EU er det ca. 28,7 milliarder pund om året. I betragtning af at fjer gøre op til 8,5% af den samlede fjerkræ vægt, producerer USA alene årligt ca. 5,3 milliarder pounds af affald fjer2.
Keratin er et protein, udstiller høj kemisk resistens, fordi det er stærkt krydsbundet med disulfidbroer, at gengive dens forarbejdning vanskeligt. At opnå opløselige produkter kræver holde cross-links og eventuelt gennemføre hydrolyse af peptidbindinger3. Spaltning af disulfidbroer kan fortsætte gennem en reaktion af thiol anion efter følgende mønster4,5:
Set- + – SbSc-↔ – Sb- + – SenSc-
Med en meget høj pH-niveau vises hydrolyse af disulfidbroer også, efter mønster6
-SS- + OH- → – S- + – SOH
Under milde forhold (pH ca. 8) sted selv sulfitolysis finder efter følgende mønster:
-SS – + HSO3- → – SH + -SSO3-
Den mest økonomiske måde nedværdigende keratin er mikrobiel nedbrydning, som er karakteriseret ved mild reaktionsbetingelser under forarbejdning og høj opdeling effektivitet (ca. 90%)7,8. Keratinases er produceret af visse bakterier isoleret fra jord og keratin affald9. Mikrobielle keratinases hydrolyserer stive og stærkt krydsbundet keratin strukturer10 og den resulterende KH forberedt er rig på opløselige proteiner, uden tab i essentielle aminosyrer opdaget i det11.
For at indarbejde en protein i kosmetiske præparater (f.eks., emulsioner, cremer og geler), sikre kravet om at at sådanne proteiner er opløseligt i vand, de givne systemer er gennemsigtige, og at re sammenlægning af peptider er undgået grund hydrofobe interaktioner. En fælles praksis er derfor at anvende hydrolysater af proteiner, som hydrolyseret kollagen, elastin og keratin. Når du tilføjer hydrolysater i kosmetiske emulsioner, taget skridt til at sikre, at hydrolysat først opløses i vand. I nogle tilfælde er det ønskeligt, at protein (eller hydrolysat) er opløseligt i alkohol eller andre organiske opløsningsmidler12.
KH er normalt kendetegnet i shampoo, balsam, cremer og nærende serum for hår, samt mascaras, neglelak og eye make-up agenter. KH effekter erklæret normalt omfatter danner en beskyttende film, udglatning hår eller negle struktur, øget plasticitet og udseende af de behandlede formation, regulering af sammenhængen i produkter, og at fremme dannelsen af skum13 , 14. det fremgår også, at KH nedsætter overfladespænding, dermed tilskud i kosmetik kan lette reduktion i mængden af emulgator tilføjet for at stabilisere cremer. KH begrænse virkningerne af irritation udløst af rengøringsmidler (overfladeaktive stoffer) til hud, øjne og hår, hvorved nogen potentielle bivirkninger af rengøringsmidler på væv (f.eks, dehydrering af huden, hårdhed og nedsat barriere funktion af hud). Den høje buffer kapacitet af hydrolysater også udnyttes til at stabilisere pH af kosmetik; peptider af kortere længde har en større Bufferkapacitet virkning15,16. Selvom KHs har blive etableret som standard komponenter i hår og negle kosmetik samt ved at blive udnyttet i produkter til hudpleje, undersøgelser af fugtgivende virkningerne af KH ikke vises i moderne litteratur.
Alkaline-enzymatisk teknologi er blevet udviklet til forarbejdning keratin biprodukter til KH og aktive test er i processen om virkningerne af en række kosmetiske additiver17,18,19,20 , 21 , 22. fordelen, at to-trins alkaline-enzymatisk hydrolyse ved hjælp af mikrobielle proteaser for kylling fjer opnår høj effektivitet mild reaktion betingelser og kvaliteten af KH er meget høj i modsætning til hydrolyse ansat i stærke syrer eller baser. I den første fase inkuberes fjer ved en højere temperatur i et alkalisk miljø, som delvist forstyrrer keratin struktur og svulmer fjer; efter justering af pH, er fjer hydrolyseret med et proteolytisk enzym milde betingelser i anden fase. Den dialyzed KH besidder et højt indhold af proteiner.
Anvendelsen af metoden beskrevet her forarbejdning fjerkræfjer til en KH gennem alkaline-enzymatisk hydrolyse og teste effekten af fugtgivende egenskaber af KH anvendes til O/W kosmetiske emulsion. De fugtgivende egenskaber er undersøgt af medvirkende ikke-invasive metoder i vivo. De hyppigste metoder til måling hud hydrering og barriere funktion af SC omfatter måling af elektriske egenskaber af huden (konduktans eller kapacitans). Forskellige metoder for at undersøge SC hydrering omfatter nær infrarød multispektrale at forestille sig metode (NIM), Kernemagnetisk resonans-spektroskopi, optisk kohærens tomografi eller forbigående termotransfer23. Barriere funktion af SC korrelerer til TEWL SC og det er målt ved ventileret kammer metode, unventilated kammer metode og åben kammer metode24.
Egenskaber af model formuleringer bestemmes ved hjælp af Multi sonde adapter MPA 5 med tre typer af sonder. Den først én, corneometer CM 825 foranstaltninger hud hydrering ved at vurdere ændringerne i den elektriske kapacitet på hudens overflade; den måling kondensator viser ændringer i kapacitans af hudens overflade i corneometric enheder. Corneometer giver kun en relativ vurdering af huden hydrering25. For TEWL, der den anden sonde, tewameter TM 300, bruges til måling tæthed farveforløb af vand fordampning (i en åben kammer instrument baseret på Fick's diffusion lov) fra huden indirekte af de to par af følere (temperatur og relativ fugtighed) angiver mængden vand der transporteres pr. et afgrænset område og periode (g/m2h). Denne metode kan registrere selv de mindste forstyrrelser af hud barriere funktion26. Hud pH-værdien er en indikator for barriere og anti-mikrobielle funktion af SC27. Surhedsgraden i huden kappen blev målt af en (tredje) hud PH 905 probe tilsluttet MPA 5 station. Denne specialdesignet sonden består af en flad top glas elektrode til fuld hudkontakt, tilsluttet et voltmeter. Systemet måler potentielle ændringer som følge af aktiviteten af hydrogen kationer omkring den meget tynde lag af halvfaste former målt på toppen af sonden. Ændringer i spænding vises som pH28.
Vi præsenterer forsøg opdelt i tre dele: (1) forberedelse af KH fra kylling fjer af to-trins alkaline-enzymatisk hydrolyse og dets rensning af dialyse (at fjerne salte og lav-Molekylær fraktioner), (2) udarbejdelse af kosmetiske formuleringer, der indeholder 2, 4 og 6% KH, og (3) test egenskaberne for KH ved at måle hud hydrering, TEWL, og hud pH. Test blev udført på 10 kvinder med en gennemsnitlig alder af 27,2 år og 10 mænd med en gennemsnitlig alder af 26,2 år. Metoden til udvælgelse af frivillige og selve testen blev gennemført i overensstemmelse med internationale etiske principper for bio-medicinske forskning udnytte forsøgspersoner29; alle personer, der gav deres informeret samtykke forud for optagelse i undersøgelsen. Før testning påbegyndt, frivillige blev bedt om at udfylde et spørgeskema om deres sundhedsstatus. De frivillige er forpligtet til at undgå at anvende et kosmetisk produkt til forsøgssteder og omkringliggende områder i løbet af 24 timer forud for og under testperioden; Derudover var de kun tilladt korte aften vasker med rindende vand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volontører rekrutteret blandt ansatte og studerende på vores Universitet. Metoden til udvælgelse blev gennemført i henhold til "International etiske retningslinjer for biomedicinsk forskning af forsøgspersoner. Rådet for internationale organisationer af Medical Sciences, Geneve (2002)." KH er en fælles kosmetisk ingrediens bruges i hårpleje produkter (shampoo, Crimper, etc.) og dermed der ikke kræves godkendelse fra de institutionelle review board.
1. proces kylling fjer i KH
- Indsamle kylling fjer fra en kyllingefarm.
- Udviske ethvert uopløselige urenheder og blod resterne fra kylling fjer med et tilstrækkeligt overskud af frisk kører (kolde) vand. Placer fjerene på en flad tallerken og tørre natten over ved 50 ° C.
Bemærk: Protokollen kan pause her. - Male 50 g tørret fjer i en skæring mill (egnet til blød til medium-hårdt prøvematerialer og fibermaterialer) i en endelig finhed af 1,0 mm. Alternativt, den endelige finheden af slebne fjer kan blive højere, men ikke mere end 3,0 mm.
Bemærk: Protokollen kan pause her. -
Affedt fjer
Bemærk: Den mest effektive og økonomiske metode til affedtning fjerkræ fjer er ved hjælp af en kommerciel lipolytic enzym.- I en rustfri stål blande 27-L kedel container med temperaturkontrol, fjerene med vand forvarmet op til 40 ± 2 ° C i en vægt-forholdet 1:75. Tilføje en lipolytic enzym (aktivitet 100 KLU/g) i en dosis på 1,5-2,0% (relateret til vejes i tørre fjer) og forsigtigt røre indholdet med en overhead omrører i 5 min.
- PH blanding indstilles til 9,0 ± 0,2, den værdi svarer til den maksimale aktivitet af lipolytic enzymer ved at tilføje 1% NaOH eller 1% H3PO4 løsning. Rør blandingen i 5 min. med en overhead omrører, og derefter kontrollere og re-justere pH-niveau ved hjælp af et laboratorium bænk pH/mV meter.
- Blandingen omrøres forsigtigt med en overhead omrører i 24 timer ved 40 ± 0,5 ° C. Alternativt, inkuberes blanding på 40 ± 0,5 ° C, og under de første 6 h inkubation rør indholdet på 1 h intervaller.
- Blandingen filtreres gennem en fin sigte (100 µm størrelse) og vaske de affedtede fjer med en strøm af frisk kører (kolde) vand. Tørre fjer på en flad tallerken ved 50 ° C i en tørring kammer natten over.
Bemærk: Protokollen kan pause her.
- Udføre den første fase af kylling fjer hydrolyse. Bland fjerene med 0,3% KOH vand løsning i en vægt forholdet 1:50 og forsigtigt rør med en overhead omrører på 60 ± 0,5 ° C i 24 timer. PH i blandingen falder fra ca. 12.5 ved starten af inkubation til ca. 11,0 i slutningen af inkubation. Efter at have afsluttet den første fase af hydrolyse, justere pH i blandingen til det niveau, der svarer til den maksimale aktivitet af proteolytisk enzym med 10% H3PO4 (i dette tilfælde, at et niveau på 9,0 ± 0,2) ved at tilføje 1% NaOH.
- Udføre den anden fase af kylling fjer hydrolyse. Føje til blanding, det proteolytiske enzym i en dosis på 5,0% (relateret til mængden af fjer vejes i begyndelsen af den første fase af hydrolyse af tørstofindholdet). Forsigtigt omrøres med en overhead omrører på 60 ± 0,5 ° C til 8 h og derefter varme blanding (i den samme rustfrit stål 27-L kedel beholder) til et kogepunkt (100 ° C) og kog i 10 min. at inaktiverer enzymet.
- Adskille løsning på KH (udarbejdet i trin 1,6) fra den uopløst rest ved at filtrere det gennem low-density filtrerpapir på en Buchner tragt med let vakuum-tryk; Alternativt kan du bruge en centrifuge.
Bemærk: Protokollen kan være pause her i flere dage hvis en løsning på KH er gemt på 5 ± 1 ° C. - Dialyze KH bruger 12 K MWCO membran til at fjerne små peptider og salte i plastikspand (26 cm diameter x 26 cm højde). Hæld 400 mL af opløsningen, KH i dialyse slangen og dialyze det mod 4 L destilleret vand i 80 timer ved stuetemperatur; ændre destilleret vand efter 18, 36 og 60 h.
- Støbt en dialyzed løsning på KH på en anti-selvklæbende plade (fx, silikone) på en ratio på 500 mL, 1.000 cm2 plade område, vakuum tørre det på en tynd film på 40 ± 0,5 ° C for natten, male for at danne et fint pulver, og holde det i en lukket beholder i en ekssikkator.
Bemærk: Protokollen kan være pause her i flere måneder hvis KH pulver opbevares i et tørt sted.
2. klargør kosmetiske formuleringer med KH
Bemærk: OB bruges til at teste var en kommerciel hydrofile O/W creme base og består af aqua, paraffin, paraffin væske, cetearyl alkohol, Laureth 4, natriumhydroxid, carbomer, methylparaben og propylparaben.
- Forberede formuleringer, der indeholder 2, 4 og 6% KH (efter base vægten af salven). Mængden af KH pulver i en polyethylen fartøj (7 cm diameter x 10 cm højde) og tilføje OB på et beløb, der sikrer, at den samlede vægt af formuleringen er lig med 50 g; Se opskrift i tabel 1.
| Kosmetiske udformning | Vægten af salve base [g] | Vægten af keratin hydrolysat [g] | Samlede vægt [g] | |||||
| Salve base | 50 | 0 | 50 | |||||
| Salve base + 2% KH | 49 | 1 | ||||||
| Salve base + 4% KH | 48 | 2 | ||||||
| Salve base + 6% KH | 47 | 3 | ||||||
Tabel 1: Vægt-i mængder af salve base og keratin hydrolysat at forberede kosmetiske formuleringer.
- Rystes blandingen med en 3-bladet laboratorium blender i 10 min på 134.16 x g og bland ved hjælp af en mekanisk overhead omrører. Opretholde de forberedte formuleringer på 5 ± 1 ° C og varm dem ved stuetemperatur for 2 h før brug.
Bemærk: Homogenisering blanding af OB med KH kan gøres med en ikke-digitale omrører så godt. På en ikke-digitale omrører er der skalaer med den omtrentlige hastighed (i rpm) samt. Blid omrøring vil fungere bedst for dette trin.
Bemærk: Protokollen kan stå i pause her i op til 5 måneder hvis formuleringer er gemt på 5 ± 1 ° C.
3. test egenskaber KH ved måling af huden hydrering, TEWL og pH
Bemærk: Udfør alle målinger i en aircondition værelse på 23 ± 2 ° C og relative luftfugtigheden 56 ± 3%.
- Sted 5 strimler filtrerpapir (størrelse 2 x 4 cm) i den fysiologiske løsning (0,90% NaCl) og lade dem for ca 1 min i løsningen.
- Anvende to strimler på den indvendige side af den højre underarm, og tre til den indvendige side af den venstre underarm, og løse dem for 4 h med hæfteplastre. Dette trin er at affedte huden og fjerne individuelle egenskaber af huden på webstedet. Efter 4 h, Fjern stripsene og Danmark i områder med en permanent pen, se figur 1.
Figur 1: metode til placering af test formuleringer på underarmen til venstre og højre øvre lemmer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Anvende 0,1 mL af de testede formuleringer på hver plet af affedtede underarmen websteder ved hjælp af sprøjter og sprede det over hele mærket overfladen. På den venstre underarm, ikke gælder noget for det første websted (det er kontrol), anvende OB til det andet sted, og OB + 2% KH til tredje. Anvende OB + 4% KH og OB + 6% KH til højre arm.
- Måler hver prøve på hvert sted og hvert interval (1, 2, 3, 4, 24 og 48 h) og tage 5 behandlinger med hud hydrering meter sonden for huden hydrering, 15 aflæsninger med TEWL meter sonden for hud TEWL og 1 læsning med hud pH meter sondens hudens pH. Tillad ikke frivillige til at anvende et kosmetisk produkt til forsøgssteder og de omkringliggende områder i løbet af testperioden; de er ret korte aften vasker med rindende vand.
Bemærk: Protokollen kan pause her. - Behandle de deraf følgende aflæsninger af grundlæggende numeriske egenskaber af den beskrivende statistik, ved hjælp af regneark software. Fra de 5 hydrering aflæsninger måles for hver enkelt prøve, ignorere den laveste og de højeste aflæsninger og beregne kun 3 aflæsninger for den aritmetiske middelværdi og standardafvigelse. Fra 15 TEWL aflæsninger måles for hver enkelt prøve, ignorere de første 5 og beregne kun 10 aflæsninger for middelværdien og standardafvigelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KH tilberedt efter procedure præsenteres her (Se figur 2) er gul i farven, let opløseligt i vand med højt proteinindhold (uorganiske legemer repræsenterer < 2,0%); pH-værdien på 1,0% opløsning af KH er 5.3, og opfylder kravene til kosmetik-grade hydrolysater. KH udbytte fra råvarer til 50 g er ca. 30%. Molekylvægt distribution af KH var bestemt af SDS-PAGE og er vist i figur 3.
Figur 2: repræsentativt billede af keratin hydrolysat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: SDS-PAGE keratin hydrolysat og protein standarder. Lane 1: ultra-lav Molekylær vægt tidsrumsmarkøren (3,5-26,6 kDa). Baner 2, 3 og 4: keratin hydrolysater fremstillet i 3 partier. 120 µg KH re suspenderet i 20 µL loading bufferen var lagt i hver brønd. Lane 5: bred vifte molekylvægt markør (6,5-200 kDa)
Hydrering og TEWL værdier blev afgrænset i forskellige frivillige, og kunne således ikke sammenlignes med hinanden. Derfor, værdierne er udtrykt som ændring i procent i forhold til OB på webstedet behandlet med formuleringer, de sidstnævnte indeholder 2, 4 og 6% tillæg på KH med intervaller for måling af 1, 2, 3, 4, 24 og 48 timer. PH-værdier for hud er udtrykt som den aritmetiske middelværdi af de registrerede værdier af hud pH for alle frivillige. Resultater for ændring i hydrering og TEWL i procent, i forhold til OB, og pH niveauer af huden er givet i tabel 2 til 10 mænd og tabel 3 for 10 kvinde frivillige.
| Mænd | ||||||
| Tid | 1 h | 2 h | 3 h | 4 h | 24 h | 48 h |
| Hydrering (ændring i % vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Salve base + 2% KH | + 16 ±15 | + 14 ±16 | + 12 ±9 | + 19 ±14 | + 11 ±18 | + 15 ±9 |
| Salve base + 4% KH | + 6 ±19 | + 1 ±18 | + 5 ±10 | + 7 ±16 | + 11 ±9 | + 14 ±15 |
| Salve base + 6% KH | -3 ±25 | -4 ±14 | -7 ±18 | -4 ±17 | + 11 ±14 | -17 ±14 |
| TEWL (ændring i % vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Salve base + 2% KH | -20 ±15 | -20 ±22 | -11 ±21 | -20 ±21 | -23 ±20 | -21±17 |
| Salve base + 4% KH | -28 ±12 | -29 ±20 | -28 ±20 | -28 ±24 | -47 ±20 | -36 ±20 |
| Salve base + 6% KH | -36 ±16 | -41 ±21 | -31 ±17 | -36 ±17 | -53 ±20 | -54 ±17 |
| pH | ||||||
| Kontrol | 4.7 ±0, 5 | 5.1 ±0.4 | 4.9 ±0.4 | 5.1 ±0.3 | 4.6 ±0, 5 | 4.8 ±0.7 |
| Salve base | 4.8 ±0, 5 | 5.1 ±0.3 | 4.9 ±0.3 | 5.0 ±0.4 | 4.6 ±0.4 | 5.0 ±0.6 |
| Salve base + 2% KH | 5.0 ±0.6 | 4.8 ±0.4 | 4.9 ±0, 5 | 4.9 ±0, 5 | 4.7 ±0.3 | 5.0 ±0.6 |
| Salve base + 4% KH | 4.8 ±0, 5 | 4.9 ±0.3 | 4.8 ±0.4 | 4.8 ±0.3 | 4.7 ±0, 5 | 4.8 ±0, 5 |
| Salve base + 6% KH | 4.7 ±0, 5 | 5.0 ±0.2 | 4.9 ±0.4 | 4.8 ±0.4 | 4.8 ±0.6 | 5.0 ±0.6 |
Tabel 2: Resultater for ændring i hydrering, TEWL og pH i huden af 10 mænd frivillige på måling intervaller af 1, 2, 3, 4, 24 og 48 timer.
| Kvinder | ||||||
| Tid | 1 h | 2 h | 3 h | 4 h | 24 h | 48 h |
| Hydrering (ændring i % vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Salve base + 2% KH | + 22 ±7 | + 15 ±6 | + 15 ±8 | + 12 ±9 | + 14 ±14 | + 18 ±9 |
| Salve base + 4% KH | 0 ±4 | -6 ±5 | -2 ±5 | + 1 ±7 | + 10 ±13 | + 15 ±10 |
| Salve base + 6% KH | -12 ±5 | -14 ±2 | -9 ±7 | -5 ±9 | + 8 ±12 | + 10 ±9 |
| TEWL (ændring i % vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Salve base + 2% KH | -32 ±1.6 | -16 ±3.0 | -12 ±1.3 | -20 ±0.9 | -35 ±1.9 | -38 ±1.6 |
| Salve base + 4% KH | -41 ±1.1 | -37 ±2.7 | -24 ±0.8 | -34 ±0.9 | -44 ±1.5 | -38 ±1.9 |
| Salve base + 6% KH | -50 ±1.4 | -39 ±2.2 | -29 ±0.7 | -39 ±0.9 | -16 ±2.4 | -33 ±2.1 |
| pH | ||||||
| Kontrol | 5.0 ±0.7 | 5.3 ±0.3 | 4.9 ±0.7 | 5.0 ±0, 5 | 5.0 ±0.8 | 4.7 ±0.7 |
| Salve base | 5.2 ±0.6 | 5.3 ±0.3 | 5.2 ±0.7 | 5.0 ±0.4 | 5.1 ±0.8 | 4.8 ±0.7 |
| Salve base + 2% KH | 5.4 ±0.7 | 5.1 ±0.4 | 4.9 ±0.4 | 5.1 ±0.7 | 4.9 ±0.7 | 5.0 ±1.0 |
| Salve base + 4% KH | 5.2 ±0.7 | 5.1 ±0.3 | 5.0 ±0.4 | 4.9 ±0.4 | 5.1 ±0.6 | 5.1 ±0.2 |
| Salve base + 6% KH | 5.2 ±07 | 5.2 ±0.2 | 5.0 ±0.4 | 5.0 ±0.3 | 5.4 ±0.6 | 5.2 ±0.4 |
Tabel 3: Resultater for ændring i hydrering, TEWL og pH i huden på 10 kvinder frivillige på måling intervaller af 1, 2, 3, 4, 24 og 48 timer.
Hydrering af SC for mænd frivillige:
Med korte intervaller af måling (1-4 h), de højeste stigninger i hydrering af huden (12-19%) blev registreret for formuleringer supplere OB med 2% af KH; tilsætning af 4% KH viste en mindre stigning (1-7%) i hydrering. Omvendt, KH på 6% afspejles negativt på værdier for SC hydrering (et fald på 3-7%). Efter 24 h målemetoder, var en stigning på 11% i SC hydrering skimtes for alle tilføjelser på KH til OB testet. Den samme tendens fortsatte selv efter 48 timer, efter med en svag stigning i hydrering, som stadig forblev: en stigning på 15% for KH på 2%, en stigning på 14% til 4% tilsætning af KH og fald på 17% for KH på 6%.
Hydrering af SC for kvinder frivillige:
Det er observerbare, der supplerer OB med 2% KH forårsager en omtrentlig 22% stigning i SC hydrering, i forhold til OB alene, så tidligt som i 1 h på akkordlønnede en 4% tillæg på KH til OB har faktisk ingen effekt på hydrering; mens omvendt, tilsætning af 6% KH til OB afspejles i en omtrentlig 12% fald i hydrering, som sammenlignet med ren OB. lignende tendenser ses efter 2, 3 og 4 h af måling, ved hvilke hydrering stiger med 12-15% for tilskud med 2% KH; for større tilføjelser på KH, hydrering enten forbliver den samme eller mindskes. Efter 24 h målemetoder, blev hydrering registreret som højere end for OB for alle de testede KH tilføjelser; den største stigning (14%) i hydrering opstod for tilsætning af 2% KH, mens den laveste stigning (8%) blev set for tilskud på 6% på KH. Lignende resultater er opnået efter 48 h målemetoder, hvori større hydrering end for ren OB blev indspillet for alle prøver med tilføjelser af KH; den største stigning (18%) i hydrering opstod for 2% KH tilsætning, mens den laveste stigning (10%) blev bemærket for KH tilskud på 6%.
TEWL for mænd frivillige:
Resultaterne af TEWL gør det klart, at formuleringer suppleret med KH mindske TEWL, når de anvendes på huden, i forhold til ren OB. En øget mængde af KH udøvede en positiv effekt på lavere værdier af TEWL. Efter 1 time efter anvender formuleringer, TEWL blev registreret som 20% lavere end for den rene OB, vedrører en formulering med 2% KH; mens KH på 4% faldt 28% i TEWL; der henviser til, at KH på 6% resulterede i en dramatisk 36% fald i TEWL. Faktisk, de formindsket TEWL værdier blev også observeret på 2, 3 og 4 h til måling af formuleringer suppleret med KH. Efter 24 og 48 h, var TEWL endda betydeligt sænket på websteder behandlet med KH formuleringer. Efter 24 h var TEWL observeret på huden 23% lavere for OB med 2% tilsætning af KH end på webstedet for ren OB; KH på 4% faldt med ca. 47% TEWL, mens KH på 6% udløst TEWL falde med 53%. En tilsvarende tendens ses selv efter 48 h: TEWL for huden behandlet med OB indeholdende 2% KH var 21% lavere end på webstedet for ren OB; KH på 4% viste en TEWL på 36% lavere; og KH på 6% medførte et fald på 54%.
TEWL for kvinder frivillige:
Det er indlysende, at alle de overvågede tilføjelser på KH til OB skal afspejles i reduceret TEWL, som ses i mænd frivillige. Efter 1 time fra programmet, blev en betydelig nedgang i TEWL indspillet for OB prøver indeholdende alle tilføjelser på KH; om en 32% reduktion i TEWL blev set 2% tilføjelse af KH, omkring et fald på 41% til 4% KH og endda 50% fald i TEWL for 6% tilskud på KH. Efter 2, 3 og 4 h måling intervaller, situationen forbliver lignende, dvs.er der et fald i TEWL på sådanne tidspunkter; den mindste dråbe i TEWL opstår 2% KH, mens den største er set 6% KH. Efter 2 h, TEWL falder med 16% for KH på 2%, 37% for KH på 4% og 39% for KH på 6%. På 3 h, TEWL mindskes yderligere med 12% for KH på 2%, 24% for KH på 4% og 29% for KH på 6%. På 4 h, TEWL yderligere falder med 20% til 2% KH, 34% til 4% KH og 39% til 6% KH. Efter 24 h, den mindste reduktion af TEWL (16%) opstod for 6% tilsætning af KH, mens den største (44%) var set 4% tilskud på KH; KH på 2% blev observeret for at forårsage et fald på 35% i TEWL. I 48 h, resultaterne forbliver lignende og relativt afbalanceret, med den mindste fald i TEWL (33%) for 6% tilsætning af KH, den største (38%) til 4% KH og 2% KH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordelen ved alkaline-enzymatisk hydrolyse er, at det kan blive ændret efter fremtidige anvendelser af KH. For eksempel, i hårpleje kosmetik applikationer, hvor en let brunlig farve af et produkt ikke er en hindring, kan en højere temperatur i hydrolyse anvendes fører til et højere udbytte af KH. Derudover den længere behandlingstid i begge faser af proceduren for teknologiske væsentligt påvirker den overordnede proces effektivitet – udbytte af KH stiger til 85%.
Resultater for hydrering måling gør det klart, at under det overvågede interval af måling (1-48 h), tilsætning af 2% KH til OB er optimal, da det medfører en stigning på 11-19% i SC hydrering for mænd frivillige, og en 12-22% stigning for kvinde frivillige. KH, der er tilføjet besidder en bred distribution af Molekylær vægt. Vi foreslår, at en del af lav molekylvægt fraktioner (MW < 20 kDa) trænger epidermis efter applikation på huden. Øget hydrering af huden efter at sætte på en formulering, suppleret med KH er forklaret gennem KH bindende vand fra lavere epidermis lag struktur af SC, fører til dannelsen af H-broer mellem KH molekyler og vand. Denne virkningsmekanisme er også omfavnet af nogle forfattere30. Den fugtgivende effekt på KH er sammenlignelige med konventionelle fugtighedscreme (fx, glycerol, urinstof og hyaluronsyre), der blev testet i emulsion og gel formuleringer22.
TEWL målinger fremhæve, at i den observerede tid af måling (1-48 h) for mænd frivillige, alle formuleringer med KH tilskud forårsaget TEWL at falde efter ansøgning. 2% tilsætning af KH til OB forårsaget en reduktion i TEWL 11-23%, sammenlignet med ren OB. Når OB blev suppleret med 4% KH, TEWL faldet med 28-47%; mens for KH på 6% det faldet med 31-54%. For kvinde frivillige, supplere OB med 4% KH repræsenterer den bedste løsning, da der var et fald på SC TEWL 24-44%. Den markant lavere TEWL for formuleringer suppleret med KH kan forklares ved processen med højere molekylvægt brøkdele af KH danner en beskyttende film en gang anvendt til epidermis, derved forhindre den epidermale vandtab. I virkeligheden, de yderst positive virkninger på KH TEWL er sammenlignelige eller overstiger endda, af hensyn til sammenligning værdier af TEWL indspillet for kosmetiske geler eller emulsioner suppleret med 5-10% glycerol og 1-5% af sericin. På samme måde, når man sammenligner KH med konventionelle mineralolier, KH formindsket TEWL af ca 25-30%31. Derudover er barriereegenskaber på KH bedre end, for eksempel dem for urinstof og hyaluronsyre22.
pH af hudens overflade:
For reference, pH 3,5 til 4.3 er et surt hudoverfladen, pH 4,4 til 5.5 er neutral i denne henseende og pH 5.6 til 6.5 repræsenterer en grundlæggende hud overflade32. Vi fandt, at ingen væsentlige ændringer blev observeret i pH i hudens overflade efter at sætte på alle de testede formuleringer (OB + 2, 4 og 6% KH); pH i 4.6 til 5.0 (mænd frivillige) og 4,9 til 5.4 (kvinde frivillige) svarer til en normal hudoverflade. Den langsigtede analyse (mere end 2 dage) blev ikke gennemført.
Ændringer og fejlfinding:
Forarbejdning af kylling fjer til KH er meget let, og løber under atmosfærisk tryk og milde temperaturer. Processen kan blive positivt omdannet fra et laboratorium skala til en pilot plant skala og industriel skala. I afsnit 2 i protokollen, hvor KH er homogeniseret med (O/W) emulsion base, er nogle ændringer mulige. I industriel praksis, O/W og W/O emulsioner fremstilles ved at blande vand (W) (vand + kosmetiske ingredienser opløseligt i vand) og olie (O)-fase (olie + kosmetiske ingredienser opløselig i olie). KH er opløseligt i vand, så det er gunstigt at blande det direkte ind i vand-fase af systemet.
Begrænsninger af teknikken:
Lokalisering af hver plet for måling hydrering og TEWL og hamret tryk måles med hud hydrering meter, hvilket er dyrt.
Kritiske trin i protokollen er for det meste i afsnit 3. Helbredstilstand, individuelle forskelle, rygere/ikke-rygere, køn, alder forskelle, menstruation og mentale tilstand kan påvirke måling hud hydrering og TEWL. For at opnå repræsentative resultater, bør den samme person anvender testet formuleringer på underarmene og foranstaltning hydrering og TEWL værdier. Det er vigtigt at udføre alle målinger i en aircondition værelse med en stabil temperatur og relativ luftfugtighed. Ved måling af værdier i intervaller på 24 og 48 h, er akklimatisering af frivillige i en aircondition værelse i mindst 30 min. før målingen nødvendige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne artikel blev skrevet med støtte til projektet IGA/FT/2017/007 af Tomas Bata University i Zlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material or chemicals | |||
| LIPEX 100T | Novozymes | LJP30020 | Lipex - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g |
| Savinase Ultra 16L | Novozymes | PXN40001 | Savinase - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g |
| Potassium hydroxide, KOH | Sigma-Aldrich | 302510289 | Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11 |
| Phosphoric acid solution, H3PO4 | Sigma-Aldrich | W290017 | Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00 |
| Sodium chloride physiological solution | Sigma-Aldrich | 52455 | Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl |
| Sodium hydroxide, NaOH | Penta s.r.o. | 40216 | Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00 |
| AmiFarm (Cremor base-A) | Fagron | 608425 | Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers | IKA-labortechnik | Z404020 | Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs |
| IKA Propeller stirrer, 3-bladed | IKA-labortechnik | R 1381 | Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm |
| Dialysis tubing closures | Sigma-Aldrich | Z371017-10EA | Dialysis tubing closures, red, size 110 mm |
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma-Aldrich | D9402-100FT | Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.) |
| DOMO Pot with stailess, LCD | DOMO Elektronic | DO42325PC | Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display |
| Hettich zentrifugen Universal 32 | Gemini bv | 2770 GS1R | Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm |
| LT 3 shaking device | Fischer Scientific | 6470.0002 | Orbital shaking device |
| KERN 440-47N | Kern | 440-47N | Laboratory balance |
| KERN 770 | Kern | 770 -N | Laboratory analytical balance |
| VENTICELL 222 - Komfort | BMT, MMM Group | C 131749 | Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control |
| Vacucell 55 - EVO | BMT, MMM Group | B 050328 | Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C |
| PULVERISETTE 19 | Fritsch | 19.1030.00 | Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives |
| Multi Probe Adapter System MPA 5 | Courage & Kazaka Electronic | 10225237 | MPA 5 Station - equipment for measurement hydratation, TEWL and pH |
| Skin pH-meter PH 905 probe | Courage & Kazaka Electronic | Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp | |
| Corneometer CM 825 probe | Courage & Kazaka Electronic | Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum). | |
| Tewameter TM 300 | Courage & Kazaka Electronic | Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL) | |
| Heidolph RZR 2020 | Heidolph | 13-225-007-03-1 | Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm |
| Heidolph mechanical stirrer BR 10 | Heidolph | Z336688-1EA | Blade impeller crossed stirrer |
| Fagor FS 12 | Fagor | BTT-138 | Laboratory refrigerator with freezer space |
| WTW bench pH/mV meter | WTW | Z313165 | High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories |
| Container | RPC Superfos | 13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microsoft Office 2010 | Microsoft | ||
| C+K software | Courage and Khazaka Electronic GmbH | MPA 5 station operating software |
References
- United States Department of Agriculture - National Agricultural Statistics Services. Poultry Slaughter, 2016 Summary. , (2016).
- McGovern, V. Recycling poultry feathers: more bang for the cluck. Environ.Health Perspect. 108 (8), A336-A339 (2000).
- Gousterova, A., et al. Degradation of keratin and collagen containing wastes by newly isolated thermoactinomycetes or by alkaline hydrolysis. Lett. Appl. Microbiol. 40 (5), 335-340 (2005).
- Yamauchi, K., Yamauchi, A., Kusunoki, T., Khoda, A., Konishi, Y. Preparation of stable aqueous solution of keratins, and physiochemical and biodegradational properties of films. Biomed. Mater. Res. 31 (4), 439-444 (1996).
- Schrooyen, P. M. M., Dijkstra, P. J., Oberthur, R. C., Bantjes, A., Feijen, J. Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J. Agric. Food Chem. 49 (1), 221-230 (2001).
- Mark, H. F., Gaylord, N. G., Bikales, N. M. Encyclopedia of Polymer Science Technology: vol. 8: Keratin to Modacrylic Fibers. , Wiley-Interscience. New York. (1968).
- Bertsch, A., Cello, N. A biotechnological process for treatment and recycling poultry feathers as a feed ingredient. Bioresour. Technol. 96 (15), 1703-1708 (2005).
- Grazziotin, A., Pimentel, F. A., de Jong, E. V., Brandelli, A. Nutritional improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase. Animal Feed Sci. Technol. 126 (1-2), 135-144 (2006).
- Brandelli, A. Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond. Food Bioprocess Technol. 1 (2), 105-116 (2008).
- Gusta, R., Ramnani, P. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl.Microbiol. Biotechnol. 70 (1), 21-33 (2006).
- Vasileva-Tonkova, E., Gousterova, A., Neshev, G. Ecologically safe method for improved feather wastes biodegradation. International Biodeterior & Biodegradation. 63 (8), 1008-1012 (2009).
- Lodén, M. Hydrating Substance. Handbook of Cosmetic Science and Technology. Barel, A. O., Paye, M., Maibach, H. I. , Informa, Healthcare. New York. 107-119 (2009).
- Teglia, A., Secchi, G. Chapter 9: Proteins in Cosmetics. Principles of Polymer Science and Technology in Cosmetics and Personal Care. Goddard, E. D., Gruber, J. V. , Marcel Dekker. New York. (1999).
- Magdassi, S. Delivery systems in cosmetics. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 123-124, 671-679 (1997).
- Method for producing a protein hydrolysate. U.S. Patent. Dahms, G., Jung, A. , 20140323702 (2014).
- Pons, R., Carrera, I., Erra, P., Kunieda, G., Solans, C. Novel preparation methods for highly concentrated water-in-oil emulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 91 (3), 259-266 (1994).
- Mokrejs, P., Hrncirik, J., Janacova, D., Svoboda, P. Processing of keratin waste of meat industry. Asian J. Chem. 24 (4), 1489-1494 (2012).
- Mokrejs, P., Svoboda, P., Hrncirik, J. Processing poultry feathers into keratin hydrolysate through alkaline-enzymatic hydrolysis. Waste Manage. Res. 29 (3), 260-267 (2011).
- Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P. Producing keratin hydrolysates from sheep wool. Orient. J. Chem. 27 (4), 1303-1309 (2011).
- Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P., Vasek, V. Modeling technological conditions for breakdown of waste sheep wool. Rasayan J. Chem. 4 (4), 728-735 (2011).
- Polaskova, J., Pavlackova, J., Vltavska, P., Mokrejs, P., Janis, R. Moisturizing effect of topical cosmetic products applied to dry skin. J. Cosmet. Sci. 64 (5), 329-340 (2013).
- Polaskova, J., Pavlackova, J., Egner, P. Effect of vehicle on the performance of active moisturizing substances. Skin Res. Technol. 21 (4), 403-412 (2015).
- Verdier-Sévrain, S., Bonté, F. Skin hydration: a review on its molecular mechanisms. J. Cosmet. Dermatol. 6 (2), 75-82 (2007).
- Darlenski, R., Sassning, S., Tsankov, N., Fluhr, J. W. Non-invasive in vivo methods for investigation of the skin barrier physical properties. Eur. J. Pharm. Biopharm. 72 (2), 295-303 (2009).
- Berardesca, E. EEMCO guidance for assessment of stratum corneum hydration: electrical methods. Skin Res. Technol. 3 (2), 126-132 (1997).
- Rogiers, V. EEMCO guidance for the assessment of transepidermal water loss in cosmetic sciences. Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 14 (2), 117-128 (2001).
- Ali, S. M., Yosipovitch, G. Skin pH: from basic science to basic skin care. Acta Derm. Venereol. 93 (3), 261-267 (2013).
- Agache, P., Humbert, P. Measuring the Skin. , Springer-Verlag. Berlin. (2004).
- Council for International Organizations of Medical Sciences. International Ethical Guidelines for Biomedical Research Involving Human Subjects. , Geneva. (2002).
- Ruland, J. K. Transdermal permeability and skin accumulation of amino acids. Int. J. Pharm. 72 (2), 149-155 (1991).
- Draelos, Z. D. Therapeutic moisturizers. Dermatol. Clin. 18 (4), 597-607 (2000).
- Courage and Khazaka Electronic GmbH, Technical Charges. Information and Operating Instructions for the Multi probe Adapter MPA and its Probe. , (2013).
