Summary
Syftet med protokollet är att förbereda keratin hydrolysat från kyckling fjädrar av alkaliska-enzymatisk hydrolys och testa om att lägga till keratin hydrolysat in en kosmetika salva bas förbättrar hudens barriär (skärper återfuktning och minskande transepidermal vattenförlust). Tester utförs på män och kvinna volontärer.
Abstract
Keratin hydrolysat (KHs) är etablerad standard komponenter i kosmetik för hår. Det är fördelaktigt för hudvård kosmetika att förstå mjukgörande effekterna av KH. Målen i protokollet är: (1) att behandla kyckling fjädrar till KH alkaliska-enzymatisk hydrolys och rena det genom dialys, och (2) för att testa om att lägga till KH i en salva bas (OB) ökar återfuktning av huden och förbättrar hudens barriär av minskande Transepidermal vattenförlust (TEWL). Under alkaliska-enzymatisk hydrolys inkuberas fjädrar först vid en högre temperatur i alkalisk miljö och sedan, under milda förhållanden, hydrolyseras med proteolytiska enzym. Lösningen av KH är dialyseras, vakuum torkas och mals till ett fint pulver. Kosmetiska formuleringar bestående av olja i vatten emulsion (O/W) innehållande 2, tillagas 4 och 6 vikt % av KH (baserat på vikt OB). Testa de fuktgivande egenskaperna hos KH utförs på 10 män och 10 kvinnor med intervall på 1, 2, 3, 4, 24 och 48 h. testad beredningar sprids på avfettade volar underarmen platser. Återfuktningen av hornlagrets (stratum Corneum) bedöms genom att mäta kapacitans i huden, som är en av de mest world-wide används och enkla metoderna. TEWL bygger på att mäta mängden vatten som transporteras per ett definierat område och tid från huden. Båda metoderna är helt icke-invasiv. KH gör för en utmärkt ocklusiv; beroende på tillägg av KH i OB medför det en minskning med 30 procent av TEWL efter applicering. KH fungerar även som ett Fuktighetsbevarande medel, eftersom det binder vatten från de lägre skikten av epidermis till SC; vid optimal KH tillägg i OB inträffar upp till 19% ökning av återfuktning i män och 22% ökning av kvinnor.
Introduction
Slakterier, livsmedelsindustrin och garveriindustrin producerar årligen enorma mängder av solid keratin biprodukter – ull, fjädrar, borst, hovar, klor, horn och liknande. Enligt de senaste statistiska uppgifterna är den totala levande vikten av kycklingar, kalkoner, ankor och andra slaktade fjäderfän i USA 62,5 miljarder pounds per år1; i EU är det cirka 28,7 miljarder pounds per år. Med tanke på att fjädrar upp till 8,5% av totala fjäderfä vikt, producerar USA ensam årligen ca 5,3 miljarder pounds av avfall fjädrar2.
Keratin är ett protein som uppvisar hög kemisk resistens eftersom det är starkt korslänkad med disulfidbryggor som återger dess bearbetning svårt. Att erhålla vattenlösliga produkter kräver klyva tvärbindningar och eventuellt utföra hydrolys av peptidbindningar3. Klyvning av disulfide broar kan fortsätta genom en reaktion av tiol anjon enligt följande mönster4,5:
Sen– + – SbSc– ↔ – Sb– + – SenSc–
Med ett mycket högt pH-nivå visas hydrolys av disulfide broar också, enligt det mönster6
– SS– , OH– → – S- + – SOH
Under milda förhållanden (pH ca 8) rum även sulfitolysis äger enligt följande mönster:
– SS – + HSO3– → – SH + – SSO3–
Det mest ekonomiska sättet att förnedrande keratin är mikrobiell nedbrytning, som kännetecknas av mild reaktion villkor under bearbetning och höga nedbrytningen effektivitet (ca 90%)7,8. Keratinases produceras av vissa bakterier som isolerats från jord och keratin avfall9. Mikrobiella keratinases hydrolyserar styvt och starkt korslänkad keratin strukturer10 och den resulterande KH beredd är rik på lösliga proteiner, utan förlust i essentiella aminosyror som upptäckts i det11.
För att införliva ett protein i kosmetiska preparat (t.ex., emulsioner, krämer och geler), kraven se till att sådana proteiner är lösliga i vatten, de givna system är transparent och att åter aggregering av peptiderna undviks tack vare hydrofoba interaktioner. Därför är en gemensam praxis att tillämpa hydrolysat av proteiner, såsom hydrolyserat kollagen, elastin och keratin. När du lägger hydrolysat i kosmetiska emulsioner, åtgärder för att säkerställa att Hydrolysatet löses först i vatten. I vissa fall är det önskvärt att proteinet (eller Hydrolysatet) är lösliga i alkohol eller andra organiska lösningsmedel12.
KH är normalt med i schampo, balsam, lotion och närande serum för hår, samt mascara, nagellack och eye make-up agenter. KH effekterna förklarat brukar inkludera bildar en skyddande film, jämna ut håret eller nail struktur, ökad plasticitet och utseende av behandlade bildandet, reglera konsistensen av produkter, och att uppmuntra bildandet av skum13 , 14. det har också visat att KH minskar ytspänningen, därav tillskott i kosmetika kan underlätta nedsättning av emulgeringsmedel lagt till att stabilisera krämer. KH begränsa effekterna av irritation som utlöses av rengöringsmedel (tensider) till hud, ögon och hår, vilket minskar eventuella biverkningar av rengöringsmedel på vävnad (t.ex., det uttorkning av huden, hårdhet, och nedsatt barriärfunktion av huden). Den höga buffring kapaciteten av hydrolysat utnyttjas också för att stabilisera pH-värdet i kosmetika; peptider av kortare längd har en större buffert effekt15,16. Även om KHs har etablerat sig som standardkomponenter i hår och Nagel kosmetika samt utnyttjades i produkter för hudvård, studier av återfuktande effekten av KH inte visas i samtida litteratur.
Alkaline-enzymatisk teknik har utvecklats för bearbetning keratin biprodukter till KH och aktiv testning pågår på effekterna av ett antal kosmetiska tillsatsämnen17,18,19,20 , 21 , 22. fördelen med tvåstegs alkaliska-enzymatisk hydrolys med mikrobiell proteaser för kyckling fjädrar uppnår hög effektivitet under mild reaktion villkor och kvaliteten på KH är mycket hög i motsats till hydrolys sysselsatt i starka syror eller alkalier. I den första etappen inkuberas fjädrar vid en högre temperatur i alkalisk miljö, som delvis stör strukturen keratin och sväller fjädrar; efter justering pH, är fjädrarna hydrolyserat med ett proteolytiskt enzym under milda förhållanden i den andra etappen. Dialyzed KH besitter en hög halt av proteiner.
Tillämpningen av den metod som beskrivs här är bearbetning fjäderfä fjädrar till en KH genom alkaliska-enzymatisk hydrolys och testa effekten av återfuktande egenskaper hos KH tillämpas på O/W kosmetiska emulsion. De fuktgivande egenskaperna utreds av instrumental icke-invasiva metoder i vivo. De vanligaste metoderna för att mäta hudens återfuktning och barriär-funktion för SC inkluderar mätning av elektriska egenskaper hos huden (konduktans eller kapacitans). Olika metoder för att undersöka SC återfuktning inkluderar nära infraröd Multispektrala föreställa metod (NIM), kärnmagnetisk resonans, optisk koherenstomografi eller övergående termotransfer23. Barriär-funktion för SC korrelerar till TEWL av SC och mätas det av ventilerade kammare metod, ovädrade chamber metoden och öppen kammare metod24.
Egenskaper av modell formuleringar bestäms med Multi sonden adapter MPA 5 med tre typer av sonder. Den första corneometer CM 825, åtgärder hud återfuktning genom att bedöma förändringar i den elektriska kapaciteten av hudens yta; mäta kondensatorn visar förändringar i kapacitans av hudytan i corneometric enheter. Corneometer ger endast en relativ bedömning av huden återfuktning25. För TEWL används andra sonden, Tewametern TM 300, för att mäta täthetlutningen av vattenavdunstning (i en öppen kammare instrument baserat på Ficks diffusion lag) från huden indirekt av de två par av sensorer (temperatur och relativ fuktighet) som anger mängden vatten som transporteras per ett definierat område och tidsperiod (g/m2/h). Denna metod kan upptäcka även de minsta störningar av hudens barriär funktion26. Huden pH är en indikator av barriären och anti-mikrobiella funktion för SC27. Surhetsgraden i huden manteln mättes genom en (tredje) hud PH 905 sond ansluten till MPA 5 station. Detta specialdesignade sonden består av en platt-topped glaselektrod för fullständig hudkontakt, ansluten till en voltmeter. Systemet mäter potentiella förändringar på grund av aktiviteten av väte katjoner kring det mycket tunna lagret av halvfast former mätt överst i sonden. Förändringar i spänning visas som pH28.
Vi presenterar experiment uppdelad i tre delar: (1) förberedelse av KH från kyckling fjädrar av tvåstegs alkaliska-enzymatisk hydrolys och dess rening genom dialys (ta bort salter och low-molecular fraktioner), (2) förberedelse av kosmetiska beredningar innehållande 2, 4 och 6% KH, och (3) provning egenskaperna för KH genom att mäta hudens återfuktning, TEWL, och huden pH. Tester genomfördes på 10 kvinnor med medelålder 27,2 år och 10 män med en medelålder på 26,2 år. Metoden för att välja frivilliga och själva Testerna genomfördes i enlighet med internationella etiska principer för biomedicinsk forskning utnyttja mänskliga försökspersoner29; alla personer gav sitt samtycke före införandet i studien. Före testning påbörjades, ombads frivilliga fylla i ett frågeformulär på deras hälsostatus. De frivilliga som åtagit sig för att undvika att tillämpa någon kosmetisk produkt till provplatser och omgivande regioner under 24 h före och under testperioden; Dessutom tilläts de endast kort kväll tvättar med rinnande vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Frivilliga rekryterades bland anställda och studenter vid vårt universitet. Metoden för att välja genomfördes enligt ”internationella etiska riktlinjer för medicinsk forskning involvera försökspersoner. Rådet för internationella organisationer för medicinska vetenskaper, Geneva (2002) ”. KH är en vanlig kosmetisk ingrediens som används i hårvård produkter (schampo, balsam, etc.) och därmed krävs inte godkännande från den institutionella Granskningsnämnden.
1. processen kyckling fjädrar till KH
- Samla kyckling fjädrar från ett Hönseri.
- Tvätta ut några olösliga orenheter och blodet resterna från kyckling fjädrar med en tillräckligt överskott av färska kör (kallt) vatten. Placera fjädrarna på en flat tallrik och torka över natten vid 50 ° C.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Mala 50 g torkade fjädrar i en skärande kvarn (lämplig för mjukt till medelhårt provmaterial och fibrösa material) till en slutlig finhalt av 1,0 mm. Alternativt, den slutliga finhalten av slipade fjädrar kan vara högre, men inte mer än 3,0 mm.
Obs: Protokollet kan pausas här. -
Avfetta fjädrar
Obs: Effektivaste och mest ekonomiska metoden för avfettning fjäderfä fjäder är med en kommersiell lipolytisk enzym.- I ett rostfritt stål 27-L panna behållare med temperaturkontroll, blanda fjädrar med vatten förvärms upp till 40 ± 2 ° C i en vikt baserat 1:75. Lägg en lipolytisk enzym (aktivitet 100 KLU/g) i en dos på 1,5-2,0% (relaterat till vägde-i torr fjädrar) och försiktigt rör innehållet med en överliggande omrörare för 5 min.
- Justera blandningen pH 9,0 ± 0,2, värdet som motsvarar maximal aktiviteten av enzymet lipolytisk genom att lägga till 1% NaOH eller 1% H3PO4 lösning. Rör blandningen för 5 min med en överliggande omrörare, och sedan kontrollera och justera pH-värdet med en laboratorium bänk pH/mV mätare.
- Försiktigt rör blandningen med en överliggande omrörare för 24 h vid 40 ± 0,5 ° C. Alternativt, inkubera blandningen på 40 ± 0,5 ° C och under de första 6 h inkubation rör innehållet 1 h mellanrum.
- Filtrera blandningen genom en fin sil (100 µm storlek) och tvätta avfettade fjädrar med en ström av färska kör (kallt) vatten. Torka fjädrarna på en platta vid 50 ° C i en kammare som torkning över natten.
Obs: Protokollet kan pausas här.
- Utföra den första etappen av kyckling fjäder hydrolys. Blanda fjädrar med 0,3% KOH vattenlösning i vikt baserat på 1:50 och rör varsamt med en överliggande omrörare på 60 ± 0,5 ° C under 24 h. PH-värdet i blandningen minskar från ca 12,5 i början av inkubation till ca 11,0 slutet av inkubation. Efter avslutad första etappen av hydrolys, justera pH-värdet i blandningen till den nivå som motsvarar den maximala aktiviteten av proteolytiska enzymet med 10% H3PO4 (i detta fall till en nivå av 9,0 ± 0,2) genom att lägga till 1% NaOH.
- Utför det andra steget i kyckling fjäder hydrolys. Tillsätt till blandningen, proteolytiska enzymet i en dos av 5,0% (relaterat till torrsubstans mängd fjädrar vägde-i början av den första etappen av hydrolys). Försiktigt rör med en överliggande omrörare på 60 ± 0,5 ° C för 8 h och sedan Värm blandningen (i samma rostfritt stål 27-L panna behållare) till en kokpunkt (100 ° C) och koka i 10 min till inaktivera enzymet.
- Separata lösningen av KH (bereddes i steg 1,6) från oupplösta kvarlevan genom att filtrera det genom låg densitet filtrerpapper på en Buchner tratt med lätt vakuum-tryck; alternativt använda en centrifug.
Obs: Protokollet kan pausas här i flera dagar om en lösning av KH lagras på 5 ± 1 ° C. - Dialyze KH med 12 K MWCO membran för att ta bort små peptider och salter i plast hink (26 cm diameter x 26 cm höjd). Häll 400 mL av KH lösningen i dialys slangar och dialyze det mot 4 L destillerat vatten för 80 h i rumstemperatur; ändra det destillerat vattnet efter 18, 36 och 60 h.
- Kasta en dialyzed lösning av KH på en anti självhäftande platta (t.ex., silikon) på ett förhållande av 500 mL till 1000 cm2 plattan område, vakuum torr den på en tunn film på 40 ± 0,5 ° C för övernattning, slipa för att bilda ett fint pulver och hålla den i slutna kärl i en exsickator.
Obs: Protokollet kan pausas här i flera månader om KH pulvret förvaras på en torr plats.
2. Förbered kosmetiska formuleringar med KH
Obs: OB används för att testa var en kommersiell hydrofil O/W kräm bas och består av aqua, paraffin, paraffin flytande, cetearyl alkohol, Laureth 4, natriumhydroxid, carbomer, metylparaben och propylparaben.
- Förbereda beredningar innehållande 2, 4 och 6% KH (i enlighet med salvan bas vikt). Väg mängden KH pulver i ett polyeten fartyg (7 cm diameter x 10 cm höjd) och tillsätt OB på ett belopp som säkerställer den totala vikten av formulering motsvarar 50 g; Se recept i tabell 1.
| Kosmetiska formulering | Vikt av salva bas [g] | Vikt av keratin hydrolysat [g] | Total vikt [g] | |||||
| Salva som bas | 50 | 0 | 50 | |||||
| Salva bas + 2% KH | 49 | 1 | ||||||
| Salva bas + 4% KH | 48 | 2 | ||||||
| Salva bas + 6% KH | 47 | 3 | ||||||
Tabell 1: Vikt-i mängder av salva base och keratin hydrolysat att förbereda kosmetiska formuleringar.
- Homogenisera blandningen med en 3-bladig laboratorium mixer för 10 min vid 134.16 x g och blanda med hjälp av en mekanisk overhead omrörare. Upprätthålla de beredda formuleringarna på 5 ± 1 ° C och värma dem i rumstemperatur i 2 h före användning.
Obs: Homogenisering blandningen av OB med KH kan göras med en icke-digitala-omrörare samt. Det finns skalor med den ungefärliga hastigheten (i rpm) samt på en icke-digitala omrörare. Skonsam omrörning fungerar bäst för detta steg.
Obs: Protokollet kan pausas här för upp till 5 månader om formuleringar lagras på 5 ± 1 ° C.
3. testa boenden av KH genom att mäta hudens återfuktning, TEWL och pH
Obs: Utföra alla mätningar i ett luftkonditionerade rum på 23 ± 2 ° C och den relativa fuktigheten på 56 ± 3%.
- Placera 5 remsor av filterpapper (storlek 2 x 4 cm) i fysiologisk lösning (0,90% NaCl) och lämna dem i ca 1 min i lösningen.
- Applicera två remsor på insidan av den högra underarmen, och tre på insidan av den vänstra underarmen, och fixa dem för 4 h med självhäftande plåster. Detta steg är att avfetta huden och eliminera individkännetecknen av huden vid platsen. Efter 4 h, ta bort remsorna och demark områdena med en permanent penna, se figur 1.
Figur 1: metod för placering av test formuleringar på underarmen i de vänstra och högra övre extremiteterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Tillämpa 0,1 mL av de testade formuleringarna på varje plats av avfettade underarmen webbplatser som använder sprutor och sprida den över hela markerade ytan. På vänstra underarmen, inte gälla något till första platsen (det är kontroll), tillämpa OB till andra plats, och OB + 2% KH till tredje. Använd OB + 4% KH och OB + 6% KH till höger arm.
- Mät varje prov på varje plats och varje intervall (1, 2, 3, 4, 24 och 48 timmar) och 5 mätningar med hud återfuktning mätaren sond för återfuktning, 15 avläsningar med TEWL mätaren sond för hud TEWL och 1 läsning med huden pH mätare sond för huden pH. Tillåt inte frivilliga att tillämpa någon kosmetisk produkt till provplatser och omgivande områden under testperioden; de tillåts kort kväll tvättar med rinnande vatten.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Bearbeta de resulterande avläsningarna av grundläggande numeriska egenskaper av beskrivande statistik, använda kalkylprogram. Från 5 återfuktning avläsningarna mäts för varje prov, ignorera de lägsta och de högsta avläsningarna, och beräkna endast 3 avläsningar för det aritmetiska medelvärdet och standardavvikelsen. Från 15 TEWL avläsningarna mäts för varje prov, ignorera de första 5, och beräkna endast 10 avläsningar för aritmetiska medelvärdet och standardavvikelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KH upprättad enligt proceduren presenteras här (se figur 2) är gul i färgen, lättlösligt i vatten med hög proteinhalt (oorganiska fasta ämnen representerar < 2,0%), 1,0% lösning av KH pH är 5.3 och uppfyller kraven för kosmetiska-grade hydrolysat. Utbytet av KH från 50 g råvara är ca 30%. Molekylvikt distribution av KH bestämdes av SDS-PAGE och visas i figur 3.
Figur 2: representativ bild av keratin hydrolysat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: SDS-PAGE keratin hydrolysat och protein standarder. Lane 1: ultra-låg molekylvikt intervallmarkörerna (3.5-26,6 kDa). Körfält 2, 3 och 4: keratin hydrolysat beredd i 3 omgångar. 120 µg KH re upphängd i 20 µL lastning buffert lastades i varje brunn. Lane 5: brett utbud molekylvikt markör (6,5-200 kDa)
Den återfuktning TEWL värden var avgränsad i olika frivilliga och kunde således inte jämföras med varandra. Värdena uttrycks därför som förändring i procent jämfört med OB på webbplatsen behandlas med formuleringar, den senare innehållande 2, 4 och 6% tillägg av KH mellanrum för mätning av 1, 2, 3, 4, 24 och 48 h. PH-värdena för hud uttrycks som det aritmetiska medelvärdet av huden pH inspelade värden för alla volontärer. Resultaten för förändring i vätskebalans och TEWL i procent, i förhållande till OB, och pH-nivåer i huden ges i tabell 2 för 10 män och i tabell 3 för 10 kvinna volontärer.
| Män | ||||||
| Tid | 1 h | 2 h | 3 h | 4 h | 24 h | 48 h |
| Hydrering (% förändring vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Salva bas + 2% KH | + 16 ±15 | + 14 ±16 | + 12 ±9 | + 19 ±14 | + 11 ±18 | + 15 ±9 |
| Salva bas + 4% KH | + 6 ±19 | + 1 ±18 | + 5 ±10 | + 7 ±16 | + 11 ±9 | + 14 ±15 |
| Salva bas + 6% KH | -3 ±25 | -4 ±14 | -7 ±18 | -4 ±17 | + 11 ±14 | -17 ±14 |
| TEWL (% förändring vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Salva bas + 2% KH | -20 ±15 | -20 ±22 | -11 ±21 | -20 ±21 | -23 ±20 | -21±17 |
| Salva bas + 4% KH | -28 ±12 | -29 ±20 | -28 ±20 | -28 ±24 | -47 ±20 | -36 ±20 |
| Salva bas + 6% KH | -36 ±16 | -41 ±21 | -31 ±17 | -36 ±17 | -53 ±20 | -54 ±17 |
| pH | ||||||
| Kontroll | 4.7 ±0, 5 | 5.1 0,4 | 4.9 0,4 | 5.1 ±0.3 | 4.6 ±0, 5 | 4.8 ±0.7 |
| Salva som bas | 4.8 ±0, 5 | 5.1 ±0.3 | 4.9 ±0.3 | 5.0 0,4 | 4.6 0,4 | 5.0 ±0.6 |
| Salva bas + 2% KH | 5.0 ±0.6 | 4,8 0,4 | 4.9 ±0, 5 | 4.9 ±0, 5 | 4.7 ±0.3 | 5.0 ±0.6 |
| Salva bas + 4% KH | 4.8 ±0, 5 | 4.9 ±0.3 | 4,8 0,4 | 4.8 ±0.3 | 4.7 ±0, 5 | 4.8 ±0, 5 |
| Salva bas + 6% KH | 4.7 ±0, 5 | 5.0 ±0.2 | 4.9 0,4 | 4,8 0,4 | 4.8 ±0.6 | 5.0 ±0.6 |
Tabell 2: Resultat för förändring i vätskebalans, TEWL och pH-värdet i huden av 10 män volontärer på mätning intervall om 1, 2, 3, 4, 24 och 48 h.
| Kvinnor | ||||||
| Tid | 1 h | 2 h | 3 h | 4 h | 24 h | 48 h |
| Hydrering (% förändring vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Salva bas + 2% KH | + 22 ±7 | + 15 ±6 | + 15 ±8 | + 12 ±9 | + 14 ±14 | + 18 ±9 |
| Salva bas + 4% KH | 0 ±4 | -6 ±5 | -2 ±5 | + 1 ±7 | + 10 ±13 | + 15 ±10 |
| Salva bas + 6% KH | -12 ±5 | -14 ±2 | -9 ±7 | -5 ±9 | + 8 ±12 | + 10 ±9 |
| TEWL (% förändring vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Salva bas + 2% KH | -32 ±1.6 | -16 ±3.0 | -12 ±1.3 | -20 ±0.9 | -35 ±1.9 | -38 ±1.6 |
| Salva bas + 4% KH | -41 ±1.1 | -37 ±2.7 | -24 ±0.8 | -34 ±0.9 | -44 ±1, 5 | -38 ±1.9 |
| Salva bas + 6% KH | -50 ±1.4 | -39 ±2.2 | -29 ±0.7 | -39 ±0.9 | -16 ±2.4 | -33 ±2.1 |
| pH | ||||||
| Kontroll | 5.0 ±0.7 | 5.3 ±0.3 | 4.9 ±0.7 | 5.0 ±0, 5 | 5.0 ±0.8 | 4.7 ±0.7 |
| Salva som bas | 5.2 ±0.6 | 5.3 ±0.3 | 5.2 ±0.7 | 5.0 0,4 | 5.1 ±0.8 | 4.8 ±0.7 |
| Salva bas + 2% KH | 5.4 ±0.7 | 5.1 0,4 | 4.9 0,4 | 5.1 ±0.7 | 4.9 ±0.7 | 5.0 ±1.0 |
| Salva bas + 4% KH | 5.2 ±0.7 | 5.1 ±0.3 | 5.0 0,4 | 4.9 0,4 | 5.1 ±0.6 | 5.1 ±0.2 |
| Salva bas + 6% KH | 5.2 ±07 | 5.2 ±0.2 | 5.0 0,4 | 5.0 ±0.3 | 5.4 ±0.6 | 5,2 0,4 |
Tabell 3: Resultat för förändring i vätskebalans, TEWL och pH-värdet i huden av 10 kvinnor volontärer på mätning intervall om 1, 2, 3, 4, 24 och 48 h.
Hydrering av SC för män volontärer:
Korta mellanrum mätning (1-4 h), de största ökningarna i återfuktning av huden (12-19%) spelades in för formuleringar komplettera OB med 2% av KH; tillägg av 4% KH visade en mindre ökning (1-7%) i fukt. Omvänt, KH på 6% reflekteras negativt på värden för SC hydrering (en minskning med 3-7%). Efter 24 h mätmetoder förekom en ökning med 11% i SC återfuktning för alla tillägg av KH till OB testade. Samma utveckling fortsatte även efter 48 h, följande med en liten ökning i återfuktning som fortfarande återstod: en 15% ökning för KH på 2%, en ökning med 14% för 4% tillägg av KH och släpp av 17% för KH på 6%.
Hydrering av SC för kvinnor volontärer:
Det är observerbara som kompletterar OB med 2% KH orsakar en ungefärlig 22% öka i SC återfuktning, i förhållande till OB ensam, så tidigt som på 1 h av mätmetoderna. en 4% tillägg av KH till OB har, i själva verket ingen effekt på återfuktning; medan däremot lägga till 6% KH till OB återspeglas i en ungefärlig 12% minskning av återfuktning, jämfört med ren OB. liknande tendenser ses efter 2, 3 och 4 h i mätningen, på vilket återfuktning ökar med 12-15% för tillskott med 2% KH; för större tillägg av KH, hydratisering antingen är densamma eller minskar. Efter 24 h mätmetoder spelades hydratisering som högre än för OB för alla testade KH tillägg; den största ökningen (14%) i återfuktning uppstod för tillsats av 2% KH, medan den lägsta ökningen (8%) sågs för tillskott på 6% av KH. Liknande resultat uppnås efter 48 h mätmetoder, vari större återfuktning än för ren OB spelades för alla prover med tillägg av KH; den största ökningen (18%) återfuktning uppstod för 2% KH tillägg, medan den lägsta ökningen (10%) noterades för KH tillskott på 6%.
TEWL för män volontärer:
Resultaten av TEWL gör det klart att formuleringar kompletteras med KH minska TEWL, när de appliceras på huden, i jämförelse med ren OB. En ökad mängd KH utövade en positiv effekt på lägre värden av TEWL. Efter 1 h efter applicering formuleringar, TEWL spelades som 20% lägre än för ren OB, som hänför sig till en formulering med 2% KH; medan KH på 4% tappade 28% i TEWL; medan KH på 6% resulterade i en dramatisk 36% minskning av TEWL. Faktiskt observerades minskat TEWL värdena också vid 2, 3 och 4 h för mätning av formuleringar som kompletteras med KH. Efter 24 och 48 timmar sänktes även betydligt TEWL på platser som behandlats med KH formuleringar. Efter 24 h var TEWL observerats på huden 23% lägre för OB med 2% tillägg av KH än på webbplatsen för ren OB; KH på 4% minskade med cirka 47% TEWL, medan KH på 6% utlöste TEWL falla med 53%. En liknande trend märks även efter 48 h: TEWL för hud behandlad med OB innehållande 2% KH var 21% lägre än på webbplatsen för ren OB; KH på 4% visade en TEWL 36% lägre; och KH på 6% en minskning med 54%.
TEWL för kvinnor volontärer:
Det är uppenbart att alla övervakade tillägg av KH till OB skall avspeglas i minskad TEWL, som sett i män frivilliga. Efter 1 h från applicering spelades en signifikant minskning TEWL för OB prover som innehåller alla tillägg av KH; ca 32% TEWL observerades för 2% tillsats av KH, runt en 41% minskning för 4% KH, och även en 50% nedgång i TEWL för 6% tillskott av KH. Efter 2, 3 och 4 h mätning intervaller, situationen fortfarande liknande, dvsär det en minskning i TEWL vid sådana tidpunkter; den minsta droppe i TEWL uppstår för 2% KH, medan den största ses för 6% KH. Efter 2 h, TEWL minskar med 16% för KH på 2%, 37% för KH på 4% och 39% för KH på 6%. På 3 h, TEWL minskar ytterligare med 12% för KH på 2%, med 24% för KH på 4% och 29% för KH på 6%. På 4 h, TEWL ytterligare minskar med 20% 2% KH, 34% för 4 KH, och 39% för 6% KH. Efter 24 h, den minsta minskningen TEWL (16%) uppstod för 6% tillsats av KH, medan den största (44%) sågs för 4% tillskott av KH; KH på 2% observerades för att orsaka en minskning på 35% av TEWL. På 48 h, resultaten återstår liknande och relativt balanserat, med minst minskningen TEWL (33%) för 6% tillsats av KH, den största (38%) för 4% KH och 2% KH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelen med alkaliska-enzymatisk hydrolys är att det kan modifieras enligt framtida tillämpningar av KH. Till exempel i hårvård kosmetika applikationer där en lätt brunaktig färg på en produkt inte är ett hinder, kan en högre temperatur i hydrolys tillämpas leder till en högre avkastning av KH. Dessutom längre handläggningstiden under båda stadier av det tekniska förfarandet väsentligt påverkar den övergripande processen effektivitet – avkastningen av KH stiger till 85%.
Resultaten för återfuktning mätning gör det uppenbart att, under övervakade intervallet för mätning 1-48 h, tillsats av 2% KH till OB är optimal eftersom det orsakar en 11-19% ökning i SC återfuktning för män volontärer och en 12-22% ökning för kvinna volontärer. De KH som läggs besitter en bred fördelning av molekylvikt. Vi föreslår att en del av låg molekylär vikt fraktioner (MW < 20 kDa) tränger igenom epidermis efter applicering på huden. Ökad återfuktning av huden efter att sätta på en formulering som kompletteras med KH förklaras genom KH bindande vattnet från nedre epidermis lager av strukturen i SC, leder till bildandet av H-broar mellan KH molekyler och vatten. Denna verkningsmekanism är också omfamnas av vissa författare30. Den fuktgivande effekten av KH är jämförbar med konventionella moisturizers (t.ex., glycerol, urea och hyaluronsyra) som testades i emulsion och gel formuleringar22.
TEWL mätningar markera att alla formuleringar med KH tillskott under observerade tiden för mätning (1-48 h) för män volontärer, orsakade TEWL avta efter applicering. 2% tillägg av KH till OB orsakade en minskning i TEWL 11-23%, jämfört med ren OB. När OB kompletterades med 4% KH, TEWL sjönk 28-47%. medan för KH på 6% minskade det med så mycket som 31-54%. För kvinna volontärer, komplettera OB med 4% KH representerar det bästa alternativet, eftersom det var en minskning med 24-44% av SC TEWL. Den betydligt lägre TEWL för formuleringar kompletteras med KH kan förklaras genom processen med högre molekylvikt fraktioner av KH bildar en skyddande film en gång tillämpas på epidermis, därmed förhindra förlusten av epidermal vatten. I själva verket mycket positiva effekten av KH på TEWL är jämförbara eller överstiger ens, i jämförelsesyfte, TEWL registreras för kosmetiska geler eller emulsioner kompletteras med 5-10% glycerol och 1-5% av sericin värden. På samma sätt när man jämför KH med konventionella mineraloljor, minskade KH TEWL med cirka 25-30%31. Dessutom är barriäregenskaper KH bättre än, exempelvis för urea och hyaluronsyra22.
pH av hudytan:
För referens, pH 3,5 till 4.3 är en sura hudytan, pH 4.4 till 5,5 är neutral i detta avseende och pH 5,6 till 6.5 representerar en grundläggande hud yta32. Vi hittade att inga signifikanta förändringar observerades i pH-värdet i huden efter att sätta på alla av de testa formuleringarna (OB + 2, 4 och 6% KH); pH 4,6 till 5.0 (män volontärer) och 4,9 till 5,4 (kvinna volontärer) motsvarar en normal hudyta. Den långsiktiga analysen (mer än 2 dagar) var inte fulländat.
Modifieringar och felsökning:
Bearbetning av kyckling fjädrar till KH är mycket lätt, och körs i atmosfärstryck och mild temperatur. Processen kan vara gynnsamt förvandlas från en laboratorieskala till en pilotanläggning skala och industriell skala. I avsnitt 2 i protokollet där KH är homogeniserad med (O/W) emulsionen bas, är några ändringar möjliga. I industriell praxis, O/W och W/O emulsioner är beredd genom att blanda vatten (W) (vatten + kosmetiska ingredienser lösligt i vatten) och olja (O) fas (olja + kosmetiska ingredienser lösligt i olja). KH är lösligt i vatten, så det är gynnsamt att blanda in det direkt i vattenfasen i systemet.
Begränsningar av tekniken:
Lokalisering av varje plats för mäta återfuktning och TEWL och hamrade trycket mäts med hud återfuktning mätare som är dyrt.
Kritiska steg inom protokollet är oftast i avsnitt 3. Den hälsotillståndet, individuella skillnader, rökare/icke-rökare, kön, åldersskillnader, menstruation och mentala tillstånd kan påverka mätning återfuktning och TEWL. För att förvärva representativa resultat, bör samma person gälla testade formuleringar på underarmar och åtgärd återfuktning och TEWL värden. Det är viktigt att utföra alla mätningar i ett luftkonditionerade rum med en stabil temperatur och relativ luftfuktighet. Vid mäta värden i intervall om 24 och 48 h, är acklimatisering av frivilliga i konditionerat utrymme för minst 30 min före mätning nödvändigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna artikel skrevs med stöd av projektet IGA/FT/2017/007 av Tomas Bata University i Zlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material or chemicals | |||
| LIPEX 100T | Novozymes | LJP30020 | Lipex - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g |
| Savinase Ultra 16L | Novozymes | PXN40001 | Savinase - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g |
| Potassium hydroxide, KOH | Sigma-Aldrich | 302510289 | Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11 |
| Phosphoric acid solution, H3PO4 | Sigma-Aldrich | W290017 | Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00 |
| Sodium chloride physiological solution | Sigma-Aldrich | 52455 | Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl |
| Sodium hydroxide, NaOH | Penta s.r.o. | 40216 | Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00 |
| AmiFarm (Cremor base-A) | Fagron | 608425 | Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers | IKA-labortechnik | Z404020 | Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs |
| IKA Propeller stirrer, 3-bladed | IKA-labortechnik | R 1381 | Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm |
| Dialysis tubing closures | Sigma-Aldrich | Z371017-10EA | Dialysis tubing closures, red, size 110 mm |
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma-Aldrich | D9402-100FT | Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.) |
| DOMO Pot with stailess, LCD | DOMO Elektronic | DO42325PC | Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display |
| Hettich zentrifugen Universal 32 | Gemini bv | 2770 GS1R | Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm |
| LT 3 shaking device | Fischer Scientific | 6470.0002 | Orbital shaking device |
| KERN 440-47N | Kern | 440-47N | Laboratory balance |
| KERN 770 | Kern | 770 -N | Laboratory analytical balance |
| VENTICELL 222 - Komfort | BMT, MMM Group | C 131749 | Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control |
| Vacucell 55 - EVO | BMT, MMM Group | B 050328 | Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C |
| PULVERISETTE 19 | Fritsch | 19.1030.00 | Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives |
| Multi Probe Adapter System MPA 5 | Courage & Kazaka Electronic | 10225237 | MPA 5 Station - equipment for measurement hydratation, TEWL and pH |
| Skin pH-meter PH 905 probe | Courage & Kazaka Electronic | Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp | |
| Corneometer CM 825 probe | Courage & Kazaka Electronic | Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum). | |
| Tewameter TM 300 | Courage & Kazaka Electronic | Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL) | |
| Heidolph RZR 2020 | Heidolph | 13-225-007-03-1 | Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm |
| Heidolph mechanical stirrer BR 10 | Heidolph | Z336688-1EA | Blade impeller crossed stirrer |
| Fagor FS 12 | Fagor | BTT-138 | Laboratory refrigerator with freezer space |
| WTW bench pH/mV meter | WTW | Z313165 | High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories |
| Container | RPC Superfos | 13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microsoft Office 2010 | Microsoft | ||
| C+K software | Courage and Khazaka Electronic GmbH | MPA 5 station operating software |
References
- United States Department of Agriculture - National Agricultural Statistics Services. Poultry Slaughter, 2016 Summary. , (2016).
- McGovern, V. Recycling poultry feathers: more bang for the cluck. Environ.Health Perspect. 108 (8), A336-A339 (2000).
- Gousterova, A., et al. Degradation of keratin and collagen containing wastes by newly isolated thermoactinomycetes or by alkaline hydrolysis. Lett. Appl. Microbiol. 40 (5), 335-340 (2005).
- Yamauchi, K., Yamauchi, A., Kusunoki, T., Khoda, A., Konishi, Y. Preparation of stable aqueous solution of keratins, and physiochemical and biodegradational properties of films. Biomed. Mater. Res. 31 (4), 439-444 (1996).
- Schrooyen, P. M. M., Dijkstra, P. J., Oberthur, R. C., Bantjes, A., Feijen, J. Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J. Agric. Food Chem. 49 (1), 221-230 (2001).
- Mark, H. F., Gaylord, N. G., Bikales, N. M. Encyclopedia of Polymer Science Technology: vol. 8: Keratin to Modacrylic Fibers. , Wiley-Interscience. New York. (1968).
- Bertsch, A., Cello, N. A biotechnological process for treatment and recycling poultry feathers as a feed ingredient. Bioresour. Technol. 96 (15), 1703-1708 (2005).
- Grazziotin, A., Pimentel, F. A., de Jong, E. V., Brandelli, A. Nutritional improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase. Animal Feed Sci. Technol. 126 (1-2), 135-144 (2006).
- Brandelli, A. Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond. Food Bioprocess Technol. 1 (2), 105-116 (2008).
- Gusta, R., Ramnani, P. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl.Microbiol. Biotechnol. 70 (1), 21-33 (2006).
- Vasileva-Tonkova, E., Gousterova, A., Neshev, G. Ecologically safe method for improved feather wastes biodegradation. International Biodeterior & Biodegradation. 63 (8), 1008-1012 (2009).
- Lodén, M. Hydrating Substance. Handbook of Cosmetic Science and Technology. Barel, A. O., Paye, M., Maibach, H. I. , Informa, Healthcare. New York. 107-119 (2009).
- Teglia, A., Secchi, G. Chapter 9: Proteins in Cosmetics. Principles of Polymer Science and Technology in Cosmetics and Personal Care. Goddard, E. D., Gruber, J. V. , Marcel Dekker. New York. (1999).
- Magdassi, S. Delivery systems in cosmetics. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 123-124, 671-679 (1997).
- Method for producing a protein hydrolysate. U.S. Patent. Dahms, G., Jung, A. , 20140323702 (2014).
- Pons, R., Carrera, I., Erra, P., Kunieda, G., Solans, C. Novel preparation methods for highly concentrated water-in-oil emulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 91 (3), 259-266 (1994).
- Mokrejs, P., Hrncirik, J., Janacova, D., Svoboda, P. Processing of keratin waste of meat industry. Asian J. Chem. 24 (4), 1489-1494 (2012).
- Mokrejs, P., Svoboda, P., Hrncirik, J. Processing poultry feathers into keratin hydrolysate through alkaline-enzymatic hydrolysis. Waste Manage. Res. 29 (3), 260-267 (2011).
- Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P. Producing keratin hydrolysates from sheep wool. Orient. J. Chem. 27 (4), 1303-1309 (2011).
- Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P., Vasek, V. Modeling technological conditions for breakdown of waste sheep wool. Rasayan J. Chem. 4 (4), 728-735 (2011).
- Polaskova, J., Pavlackova, J., Vltavska, P., Mokrejs, P., Janis, R. Moisturizing effect of topical cosmetic products applied to dry skin. J. Cosmet. Sci. 64 (5), 329-340 (2013).
- Polaskova, J., Pavlackova, J., Egner, P. Effect of vehicle on the performance of active moisturizing substances. Skin Res. Technol. 21 (4), 403-412 (2015).
- Verdier-Sévrain, S., Bonté, F. Skin hydration: a review on its molecular mechanisms. J. Cosmet. Dermatol. 6 (2), 75-82 (2007).
- Darlenski, R., Sassning, S., Tsankov, N., Fluhr, J. W. Non-invasive in vivo methods for investigation of the skin barrier physical properties. Eur. J. Pharm. Biopharm. 72 (2), 295-303 (2009).
- Berardesca, E. EEMCO guidance for assessment of stratum corneum hydration: electrical methods. Skin Res. Technol. 3 (2), 126-132 (1997).
- Rogiers, V. EEMCO guidance for the assessment of transepidermal water loss in cosmetic sciences. Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 14 (2), 117-128 (2001).
- Ali, S. M., Yosipovitch, G. Skin pH: from basic science to basic skin care. Acta Derm. Venereol. 93 (3), 261-267 (2013).
- Agache, P., Humbert, P. Measuring the Skin. , Springer-Verlag. Berlin. (2004).
- Council for International Organizations of Medical Sciences. International Ethical Guidelines for Biomedical Research Involving Human Subjects. , Geneva. (2002).
- Ruland, J. K. Transdermal permeability and skin accumulation of amino acids. Int. J. Pharm. 72 (2), 149-155 (1991).
- Draelos, Z. D. Therapeutic moisturizers. Dermatol. Clin. 18 (4), 597-607 (2000).
- Courage and Khazaka Electronic GmbH, Technical Charges. Information and Operating Instructions for the Multi probe Adapter MPA and its Probe. , (2013).
