Summary
Целью протокола является подготовить гидролизат кератина от куриные перья в щелочной ферментативный гидролиз и проверить ли добавление гидролизат кератина в косметике мазь базовый улучшает барьерные функции кожи (повышение гидратации и снижается трансэпидермальную потерю воды). Испытания проводятся на мужчин и женщина добровольцев.
Abstract
Гидролизаты кератина (KHs) являются установленных стандартных компонентов в Косметика для волос. Понимание увлажняющий эффект KH выгодно для косметики, ухода за кожей. Целями Протокола являются: (1) для обработки куриные перья в KH, щелочные ферментативный гидролиз и очищения методом диализа и (2) для проверки, если добавление KH в базу мазь (OB) повышает гидратацию кожи и улучшает барьерные функции кожи, уменьшение трансэпидермальную потерю воды (TEWL). В щелочной ферментативный гидролиз перья инкубируют при более высокой температуре в щелочной среде, а затем в группе мягких условиях, гидролизуется с протеолитических ферментов. Dialyzed решение KH, вакуумные сушеные и молотые в мелкий порошок. Косметических препаратов, включающий от нефти в водной эмульсии (O/W), содержащий 2, 4 и 6% Вес кН (на основании веса Обь) готовы. Проводится тестирование увлажняющими свойствами KH на 10 мужчин и 10 женщин промежутки времени 1, 2, 3, 4, 24 и 48 ч. протестированных составов распространяются на участках обезжиренной ладонной предплечья. Увлажнение кожи рогового слоя (SC) оценивается путем измерения емкости кожи, которая является одним из наиболее мире используется и простых методов. TEWL основан на измерении количество воды, перевозимых в определенный район и период времени от кожи. Оба метода являются полностью неинвазивной. KH делает отличные окклюзионной; в зависимости от добавления KH в Обь она приносит сокращение на 30% в TEWL после применения. KH также функционирует как увлажнитель, как он связывает воду из нижних слоев эпидермиса к SC; в оптимальное дополнение KH в Обь до 19% рост в гидратации в мужчин и 22% рост женщин происходит.
Introduction
Скотобойни, пищевой промышленности и Кожевенная промышленность ежегодно производят огромное количество твердых кератин побочных продуктов – шерсть, перья, щетина, копыта, когти, рога и тому подобное. Согласно последним статистическим данным общая живой вес кур, индеек, уток и другие убой птицы в США составляет 62,5 миллиарда фунтов за год1; в ЕС это примерно 28,7 млрд фунтов в год. Учитывая, что перья до 8,5% от веса всего птицы, США только ежегодно производит около 5,3 млрд фунтов отходов перья2.
Кератин является белок экспонируется высокая химическая стойкость, потому что это сильно Пенополиолефины с мосты дисульфида, которые затрудняют его обработки. Получения растворимых продуктов требует раскалывание перекрестные ссылки и возможно проведение гидролиза пептидных связей3. Расщепление мосты дисульфида может действовать через реакции анионов тиоловых согласно следующим шаблон4,5:
S– + – SbSc– ↔ – Sb– + – SSc–
С очень высоким рН гидролиз мосты дисульфида также появляется в соответствии с узором6
-SS– + → OH– –– S-Сох
В мягких условиях (рН около 8) даже sulfitolysis проходит по следующей схеме:
-SS – + HSO →3– – ш + – SSO3–
Наиболее экономичным способом унижающего достоинство Кератин является микробных разбивка, который характеризуется мягкая реакция условий во время обработки и высокой разбивка КПД (около 90%)7,8. Keratinases производятся некоторые бактерии, изолированный от почвы и кератин отходов9. Микробной keratinases гидролизуют жесткой и сильно сшитого кератин структур10 и результирующая KH подготовлен богаты растворимые белки, без потери незаменимых аминокислот, обнаруженных в нем11.
Для того, чтобы включать белка в косметических препаратов (например, эмульсии, лосьоны и гели), требования обеспечить, что такие белки, растворимые в воде, данные системы являются прозрачными и что повторное агрегирование пептидов избегать из-за гидрофобных взаимодействий. Таким образом обычной практикой является применение гидролизатов белков, таких как гидролизованный коллаген, эластин и кератина. При добавлении гидролизаты в косметические эмульсии, предпринимаются шаги для обеспечения что гидролизат сначала растворяется в воде. В некоторых случаях желательно, что белок (или гидролизата) растворяется в спирте или других органических растворителей12.
KH обычно характеризуется в шампуни, кондиционеры, лосьоны и Питательная сыворотка для волос, а также туши для ресниц, ногтей и агентов макияж глаз. Эффекты KH, объявил обычно включают в себя, образуя защитную пленку, разглаживание волос или ногтей структуры, повышенной пластичностью и внешний вид обработанной формирования, регулирующих последовательность продуктов и поощрение формирования пены13 , 14. также было доказано, что KH уменьшает поверхностное натяжение, следовательно добавок в косметике могут способствовать сокращение эмульгатор добавляется стабилизировать кремов. KH ограничить последствия раздражения, вызванные моющие средства (ПАВ) кожи, глаз и волос, таким образом уменьшая любые потенциальные побочные эффекты чистящих средств на ткани (например, обезвоживание кожи, твердости и снижение барьерной функции кожи). Высокая буферизации способности гидролизаты также использована для стабилизации рН косметики; пептиды короче длины имеют большую буферизации эффект15,16. Хотя как стандартные компоненты становятся установили KHs в волос и косметика для ногтей, а также используются в продуктах для ухода за кожей, исследования на увлажняющий эффект KH не появляются в современной литературе.
Щелочная ферментативный технология была разработана для обработки субпродуктов кератин в KH, и активное тестирование в процесс по воздействию целого ряда косметических добавки17,18,19,20 , 21 , 22. преимущество щелочной ферментативный гидролиз два этапа с помощью микробных протеазы для куриные перья достигает высокую эффективность в условиях мягкая реакция и качество KH является очень высоким, в отличие от гидролиза, занятых в сильных кислот или щелочей. На первом этапе перья инкубируют при более высокой температуре в щелочной среде, которая частично разрушает структуру кератина и набухает перья; После корректировки рН, перья гидролизуется с протеолитического фермента мягкая условиях на втором этапе. Dialyzed KH обладает высоким содержанием белков.
В целях метода, описанного здесь переработки птицы перья в KH через щелочные ферментативный гидролиз и тестирование эффект увлажняющими свойствами KH, применяется к косметическая Эмульсия O/W. Увлажняющие свойства расследуются инструментальные неинвазивные методы в естественных условиях. Наиболее частые методы для измерения кожи гидратации и барьер функция SC включают измерения электрических свойств кожи (проводимости или емкости). Различные методы для изучения гидратации SC включают вблизи инфракрасные многоспектральные воображая метод (NIM), спектроскопии ядерного магнитного резонанса, оптическая когерентная томография или переходных термотрансферные23. Барьерная функция SC коррелирует с TEWL SC и она измеряется вентилируемых палата метод, метод непроветриваемой камере и открытой камерой метод24.
Свойства модели составов определяются с помощью зонда Multi адаптера 5 МПа с тремя типами датчиков. Первая, измерялся см 825, увлажнения кожи меры путем оценки изменений в электрическую мощность на поверхности кожи; измерительного конденсатора показывает изменения в емкость поверхности кожи в единицах corneometric. Измерялся дает только относительной оценки гидратации кожи25. Для TEWL второй зонд, tewameter TM 300, используется для измерения градиента плотности испарения воды (в открытой камерой инструмент, основанный на закон Фика диффузии) из кожи косвенно две пары датчиков (температура и относительная влажность) Указывает количество воды, перевозимого в определенный район и период времени (г/м2/ч). Этот метод может обнаружить даже малейшее нарушение функции барьера кожи26. РН кожи является одним из показателей барьера и антимикробная функции SC27. Кислотность кожи мантии измерялась (третий) кожи 905 рН зонд, подключен к станции 5 МПа. Это специально разработанные зонд состоит из стекла с плоской вершиной электрода для контакта с полной кожей, подключенных к вольтметра. Система измеряет потенциальные изменения благодаря деятельности водорода катионов, окружающих очень тонкий слой твердых форм, измеренных в верхней части зонда. Изменения напряжения в отображаются как рН28.
Мы представляем эксперименты, разделены на три категории: (1) подготовка KH из курицы перья-двухступенчатый щелочной ферментативный гидролиз и его очистки методом диализа (удаление солей и низкомолекулярных фракций), (2) подготовка косметических составы, содержащие 2, 4 и 6% KH и (3) тестирование свойств KH, измеряя увлажнения, TEWL, кожи и кожи рН. Тестирование проводилось на 10 женщин, средний возраст 27,2 лет и 10 мужчин, средний возраст 26.2 лет. Метод отбора добровольцев и тестирования самой были проведены международные этические принципы био медицинских исследований, использование человеческих субъектов29; все лица дали их осознанного согласия до включения в исследование. Перед началом тестирования начался, добровольцев было предложено заполнить вопросник о состоянии их здоровья. Добровольцы, обязались избегать применения любых косметических продуктов испытательных участков и прилегающих районах в течение 24 ч до и во время периода испытаний; Кроме того они были лишь краткое вечером автомойки с проточной водой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Добровольцев набирали среди сотрудников и студентов нашего университета. Метод отбора был проведен согласно «международные этические принципы для биомедицинских исследований участие человеческие субъекты. Совет для международных организаций медицинских наук, Женеве (2002 год).» KH-это косметический ингредиент используется в продуктах ухода за волосами (шампуни, кондиционеры и т.д.) и поэтому не требуется одобрение от институциональных Наблюдательный Совет.
1. процесс куриные перья в KH
- Соберите куриные перья от птицефабрики.
- Промойте любой нерастворимых примесей и остатки крови от куриные перья с достаточной излишки пресной воды работает (холодной). Перья на плоской пластине и высохнуть на ночь, на 50 ° C.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - В качестве альтернативы молоть 50 г сушеных перья в режущая мельница (подходит для мягких для средне твердых образцов и волокнистые материалы) в Конечная тонкость 1,0 мм., Конечная тонкость шлифованный перьев может быть выше, но не более 3,0 мм.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. -
Обезжирить перья
Примечание: Метод наиболее эффективного и экономического обезжиривание перо птицы является использование коммерческих липолитических ферментов.- В контейнере 27-L котла из нержавеющей стали с контролем температуры смешайте с водой, подогретым до 40 ± 2 ° C в вес соотношение 1: 75 Черноморское перья. Добавьте липолитических ферментов (активность 100 KLU/g) в дозе 1,5-2,0% (связанные с весил в сухом перьев) и осторожно перемешайте содержимое с накладных мешалкой 5 мин.
- Отрегулируйте смесь рН 9,0 ± 0,2, значение, соответствующее максимальная активность липолитических ферментов, добавив 1% NaOH или 1% H3PO4 решения. Перемешать смесь в течение 5 мин с накладных мешалкой и затем проверить и подрегулировать уровень pH с помощью метр рН/мВ стенде лаборатории.
- Аккуратно перемешать смесь с накладных мешалкой для 24 ч составляет 40 ± 0.5 ° C. Кроме того инкубировать смеси на 40 ± 0,5 ° C и в течение первых 6 ч инкубации перемешайте содержимое интервалом 1 ч.
- Фильтр смесь через частое сито (размер 100 мкм) и мыть обезжиренной перья с потоком свежего запуска (холодной) воды. Перья на пластине при 50 ° C в сушильной камере высушите на ночь.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
- Выполните первый этап куриное перо гидролиза. Смешать перья с 0,3% Кох водного раствора в вес соотношение 1:50 и осторожно перемешать с накладных мешалкой 60 ± 0,5 ° C в течение 24 ч. РН смеси уменьшается от приблизительно 12,5 в начале инкубации до около 11,0 в конце инкубации. После окончания первой стадии гидролиза, скорректировать рН смеси до уровня, соответствующего максимальной активности протеолитических ферментов с 10% H3PO4 (в этом случае, до уровня 9,0 ± 0,2), добавив 1% NaOH.
- Выполните второй этап куриное перо гидролиза. Добавьте в смесь, протеолитических ферментов в дозе 5,0% (связанные с сухого вещества количество перьев весил в начале первого этапа гидролиза). Аккуратно перемешать с накладных мешалкой 60 ± 0,5 ° C в течение 8 ч и затем Нагрейте смесь (в том же контейнере 27-L котла из нержавеющей стали) до точки кипения (100 ° C) и варить 10 мин для инактивации ферментов.
- Отдельные решения KH (подготовленных на шаге 1.6) от нерастворившиеся остатки путем фильтрации через low-density фильтр-бумаги на воронку Buchner с небольшой вакуум давление; Кроме того используйте центрифуги.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь на несколько дней Если раствор KH хранится в 5 ± 1 ° C. - В пластмассовое ведро (26 см диаметр x 26 см высота) dialyze KH, используя 12 K MWCO мембраны для удаления мелких пептидов и соли. Залить 400 мл раствора KH в диализе труб и dialyze против 4 Л дистиллированной воды для 80 ч при комнатной температуре; после 18, 36 и 60 h измените дистиллированной воды.
- Приведение dialyzed раствор KH на плите антиадгезионные (например, силиконовые) на соотношении 500 мл до 1000 см пластины район2 , пылесос сухой на тонкой пленки на 40 ± 0,5 ° C для ночь, растереть в форме мелкого порошка и держать его в закрытом сосуде в эксикатор.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь несколько месяцев если KH порошок хранится в сухом месте.
2. подготовить косметических препаратов с KH
Примечание: Обь, используемые для тестирования был коммерческий гидрофильные O/W крем базы и состоит из aqua, парафин, парафин жидкий, цетеариловый спирт, лаурет 4, гидроксид натрия, карбомер, метилпарабен и пропилпарабен.
- Приготовить составы, содержащие 2, 4 и 6% х (в соответствии с базовый вес мазь). Взвесить количество KH порошка в сосуд из полиэтилена (см Высота 7 см диаметр x 10) и добавить, Обь на сумму, которая обеспечивает общий вес формулировки равен 50 г; Смотрите рецепт в таблице 1.
| Косметические разработки | Вес мазь базы [g] | Вес гидролизат кератина [g] | Общий вес [g] | |||||
| Мазь база | 50 | 0 | 50 | |||||
| Базовый + 2% мазь KH | 49 | 1 | ||||||
| Базовый + 4% мазь KH | 48 | 2 | ||||||
| Базовый + 6% мазь KH | 47 | 3 | ||||||
Таблица 1: Вес в количествах, мазь базы и кератин гидролизат подготовить косметических препаратов.
- Гомогенизации смеси с 3-лопастной Лаборатория блендер для 10 мин на 134.16 x g и перемешайте с помощью механической мешалкой накладных. Поддерживать подготовленный составов на 5 ± 1 ° C и согреть их при комнатной температуре за 2 ч до использования.
Примечание: Гомогенизации смеси Обь с KH может быть сделано с не цифровых мешалкой также. На не цифровых мешалкой есть также весы с приблизительной скоростью (в об/мин). Нежное перемешивании будет работать лучше для этого шага.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь до 5 месяцев если формулировки хранятся в 5 ± 1 ° C.
3. Проверьте свойства KH измерения гидратации кожи, TEWL и рН
Примечание: Выполните все измерения в комнату с кондиционером на 23 ± 2 ° C и относительной влажности до 56 ± 3%.
- 5 место-полоски фильтровальной бумаги (размер 2 x 4 см) в физиологическом растворе (0,90% NaCl) и оставить их в течение приблизительно 1 мин в решении.
- Применяются две полоски на внутренней стороне правого предплечья, и три на внутренней стороне левого предплечья и исправить их для 4 h с лейкопластырей. Этот шаг является обезжиривают кожу и устранения индивидуальных особенностей кожи на месте. После 4 ч удалить полоски и Демарк области постоянного ручкой, Рисунок1.
Рисунок 1: метод для местоположения составов тест на предплечье левой и правой верхней конечностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Применить 0,1 мл протестированных составов на каждом месте обезжиренной предплечья сайтов, использующих шприцы и распространить его по всей поверхности заметно. На левом предплечье, не применять ничего на первый сайт (это элемент управления), применять Обь на второй сайт и Обь + 2% KH на третий. Применить Обь + 4% KH и OB + 6% KH на правой руке.
- Измерить каждый образец на каждом сайте и каждого интервала (1, 2, 3, 4, 24 и 48 ч) и принимать 5 чтений с зонда метр гидратации кожи для увлажнения кожи, 15 чтений с TEWL метр зонд для кожи TEWL и 1 чтение с зонда метр рН кожи для рН кожи. Не позволяют добровольцев, чтобы применить любой косметической продукции для испытательных участков и прилегающих районах в течение испытательного периода; они разрешены моет краткий вечер с проточной водой.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - Обработать результирующее чтений, основные численные характеристики описательной статистики, используя программное обеспечение электронной таблицы. От 5 чтений гидратации, измеренная для каждого образца игнорировать низкие и высокие показания и рассчитать только 3 чтения для арифметическое среднее и стандартное отклонение. От 15 TEWL чтений, измеренная для каждого образца игнорировать первые 5 и рассчитать только 10 чтений арифметическое среднее и стандартное отклонение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KH, подготовленный в соответствии с процедурой, представленные здесь (см. рис. 2) желтого цвета, легко растворим в воде с высоким содержанием белка (неорганические твердые вещества представляют < 2,0%); рН 1,0% раствора KH 5.3 и удовлетворяет требованиям для гидролизаты косметики класс. Урожайность КХ с 50 г сырья составляет около 30%. Распределение молекулярного веса KH определяется SDS-PAGE и показано на рисунке 3.
Рисунок 2: представитель картину гидролизат кератина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: SDS-PAGE стандартов гидролизат и белка кератина. Переулок 1: Ультра низкий диапазон молекулярный вес маркер (3,5-26,6 кДа). Полосы, 2, 3 и 4: гидролизаты кератина, подготовленный в 3 серий. 120 мкг KH, вновь приостановлено в 20 мкл загрузки буфер был загружен в каждой скважине. Лэйн 5: широкий ассортимент молекулярный вес маркер (6,5-200 кДа)
Увлажнение и TEWL значения были определены в различных добровольцев и таким образом не могут быть сопоставлены друг с другом. Таким образом значения выражаются как изменение в процентах по сравнению с Обь на сайте относиться с формулировки, последний содержащий 2, 4 и 6% дополнения KH интервалы для измерения 1, 2, 3, 4, 24 и 48 ч. Значения рН кожи выражаются как среднего арифметического зарегистрированных значений рН кожи для всех добровольцев. В таблице 2 для 10 мужчин и таблице 3 для 10 женщина добровольцев, приведены результаты для изменения в гидратации и TEWL в процентах по отношению к Оби и для уровня pH кожи.
| Мужчины | ||||||
| Время | 1 ч | 2 h | 3 h | 4 h | 24 h | 48 ч |
| Гидратация (изменение в % против база Oitment) ± SD | ||||||
| Базовый + 2% мазь KH | + 16 ±15 | + 14 ±16 | + 12 ±9 | + 19 ±14 | + 11 ±18 | + 15 ±9 |
| Базовый + 4% мазь KH | + 6 ±19 | + 1 ±18 | + 5 ±10 | + 7 ±16 | + 11 ±9 | + 14 ±15 |
| Базовый + 6% мазь KH | -3 ±25 | -4 ±14 | -7 ±18 | -4 зонда | + 11 ±14 | -17 ±14 |
| TEWL (изменение в % против база Oitment) ± SD | ||||||
| Базовый + 2% мазь KH | -20 ±15 | -20 ±22 | -11 ±21 | -20 ±21 | -23 ±20 | -21±17 |
| Базовый + 4% мазь KH | -28 ±12 | -29 ±20 | -28 ±20 | -28 ±24 | -47 ±20 | -36 ±20 |
| Базовый + 6% мазь KH | -36 ±16 | -41 ±21 | -31 зонда | -36 зонда | -53 ±20 | -54 зонда |
| pH | ||||||
| Управления | 4.7 ±0, 5 | 5.1 ±0, 4 | 4.9 ±0, 4 | 5.1 ±0, 3 | 4.6 ±0, 5 | 4.8 ±0, 7 |
| Мазь база | 4,8 ± 0,5 | 5.1 ±0, 3 | 4.9 ±0, 3 | 5,0 ±0, 4 | 4.6 ±0, 4 | 5.0 ±0.6 |
| Базовый + 2% мазь KH | 5.0 ±0.6 | ±0, 4 4,8 | 4.9 ±0, 5 | 4.9 ±0, 5 | 4.7 ±0, 3 | 5.0 ±0.6 |
| Базовый + 4% мазь KH | 4,8 ± 0,5 | 4.9 ±0, 3 | ±0, 4 4,8 | 4.8 ±0, 3 | 4.7 ±0, 5 | 4,8 ± 0,5 |
| Базовый + 6% мазь KH | 4.7 ±0, 5 | 5,0 ±0, 2 | 4.9 ±0, 4 | ±0, 4 4,8 | 4.8-±0.6 | 5.0 ±0.6 |
Таблица 2: Результаты для изменения рН кожи 10 мужчин добровольцев, TEWL и гидратации интервалами измерения 1, 2, 3, 4, 24 и 48 ч.
| Женщины | ||||||
| Время | 1 ч | 2 h | 3 h | 4 h | 24 h | 48 ч |
| Гидратация (изменение в % против база Oitment) ± SD | ||||||
| Базовый + 2% мазь KH | + 22 ±7 | + 15 ±6 | + 15 ±8 | + 12 ±9 | + 14 ±14 | + 18 ±9 |
| Базовый + 4% мазь KH | 0 ±4 | -6 ±5 | -2 ±5 | + 1 ±7 | + 10 ±13 | + 15 ±10 |
| Базовый + 6% мазь KH | -12 ±5 | -14 ± 2 | -9 ±7 | -5 ±9 | + 8 ±12 | + 10 ±9 |
| TEWL (изменение в % против база Oitment) ± SD | ||||||
| Базовый + 2% мазь KH | -32 ±1.6 | -16 ±3.0 | -12 ±1.3 | -20 ±0.9 | -35 ± 1,9 | -38 ±1.6 |
| Базовый + 4% мазь KH | -41 ±1.1 | -37 ±2.7 | -24 ±0.8 | -34 ±0.9 | -±1, 5 44 | -38 ± 1,9 |
| Базовый + 6% мазь KH | -50 ±1.4 | -39 ±2.2 | -±0, 7 29 | -39 ±0.9 | -16 ±2.4 | -33 ±2.1 |
| pH | ||||||
| Управления | 5,0 ±0, 7 | 5.3 ±0, 3 | 4.9 ±0, 7 | 5,0 ±0, 5 | 5.0 ±0.8 | 4.7 ±0, 7 |
| Мазь база | 5.2 ±0.6 | 5.3 ±0, 3 | 5.2 ±0, 7 | 5,0 ±0, 4 | 5.1 ±0.8 | 4.8 ±0, 7 |
| Базовый + 2% мазь KH | 5.4 ±0, 7 | 5.1 ±0, 4 | 4.9 ±0, 4 | 5.1 ±0, 7 | 4.9 ±0, 7 | 5,0 ± 1.0 |
| Базовый + 4% мазь KH | 5.2 ±0, 7 | 5.1 ±0, 3 | 5,0 ±0, 4 | 4.9 ±0, 4 | 5.1 ±0.6 | 5.1 ±0, 2 |
| Базовый + 6% мазь KH | 5.2 ±07 | 5.2 ±0, 2 | 5,0 ±0, 4 | 5,0 ±0, 3 | 5.4 ±0.6 | 5.2 ±0, 4 |
Таблица 3: Результаты для изменения рН кожи 10 женщин-добровольцев, TEWL и гидратации интервалами измерения 1, 2, 3, 4, 24 и 48 ч.
Гидратация SC для мужчин добровольцев:
Короткие интервалы измерения (1-4 h) наибольший прирост в гидратации кожи (12-19%) были записаны для составов, дополняющего Обь с 2% KH; добавление 4% KH показали меньше увеличение гидратации (1-7%). И наоборот KH на 6%, негативно отразилось на значения для SC гидратации (уменьшение на 3-7%). После 24 ч измерения увеличение на 11% в SC гидратации был выделить для всех дополнений KH на Обь испытания. Та же тенденция продолжались даже после 48 ч, с небольшим увеличением гидратации, что по-прежнему: 15% повышение для KH на 2%, рост 14% 4% добавлением KH, и падение 17% для KH на 6%.
Гидратация SC для женщин-добровольцев:
Это наблюдать, дополняющего Обь с 2% причин KH приблизительно 22% увеличение SC гидратации, по отношению к НК только, как раньше на 1 ч измерения; Добавление 4% KH на Обь, в самом деле, не влияет на увлажнение; При этом наоборот, добавление 6% KH на Обь отражается в приблизительно 12% снижением гидратации, как по сравнению с чисто OB. Аналогичные тенденции видны после 2, 3 и 4 h измерения, на котором гидратации увеличивается на 12-15% для добавок с 2% KH; для более крупных дополнений KH гидратации остается прежним или уменьшается. После 24 ч измерения гидратации был записан как выше, чем для Оби для всех протестированных KH дополнений; для добавления 2% KH, а наименьший рост (8%) был замечен для добавок на 6% KH произошло наибольшее увеличение гидратации (14%). Аналогичные результаты достигаются через 48 ч измерения, в котором больше гидратации чем для чистая Обь был записан для всех образцов с дополнениями KH; большой рост гидратации (18%) произошла для добавления 2% KH, наименьший рост (10%) было отмечено для KH добавок на 6%.
TEWL для мужчин добровольцев:
Результаты TEWL сделать ясно, что формулировки дополнена KH уменьшить TEWL, когда наносится на кожу, по сравнению с чисто OB. Повышенное количество KH оказали позитивное влияние на более низкие значения TEWL. Через 1 ч после применения формулировки, TEWL был записан как 20% ниже, чем для чистого Обь, относящихся к разработке с 2% KH; в то время как упал на KH на 4% 28% в TEWL; KH на 6% привело к драматическим 36%, в то время как сокращение TEWL. Действительно снижение значения TEWL также наблюдались в 2, 3 и 4 h измерения для составов с KH. После 24-48 ч TEWL даже значительно снижен на сайтах, относились с KH составов. После 24 часов TEWL, наблюдается на коже был 23% ниже для Обь с добавлением 2% KH чем на сайте для чистая Обь; KH на 4%, снизился примерно на 47% TEWL, а KH на 6% вызвало TEWL падать на 53%. Аналогичная тенденция очевидна даже после 48 h: TEWL для кожи лечение с Обь содержащий 2% KH составил 21% ниже, чем на сайте для чистая Обь; KH на 4% показал TEWL на 36% ниже; капля 54% и KH на 6%.
TEWL для женщин-добровольцев:
Очевидно, отразить всех отслеживаемых дополнения KH на Обь в снижение TEWL, как показано в мужчин-добровольцев. После 1 час от приложения значительное снижение в TEWL был записан для OB образцы, содержащие все дополнения KH; около 32% снижение в TEWL был замечен для добавления 2% KH, около 41% снижение на 4% KH и даже 50% падение TEWL 6% добавки KH. После 2, 3 и 4 h интервалы измерений, ситуация остается аналогичные, то естьнаблюдается снижение в TEWL такие промежутки времени; наименьший падения в TEWL происходит на 2% KH, в то время как величайший рассматривается для 6% KH. После 2 h, TEWL уменьшается на 16% для KH на 2%, 37% для KH на 4% и 39% для KH на 6%. В 3 ч, далее уменьшается TEWL на 12% для KH на 2%, 24% для KH на 4% и 29% для KH на 6%. В 4 ч, далее TEWL уменьшается на 20% на 2% KH, 34% 4% KH и 39% 6% KH. После 24 часов наименее сокращение в TEWL (16%), произошло для добавления 6% KH, в то время как величайший (44%) был замечен 4% добавки KH; KH на 2% было отмечено вызвать снижение 35% TEWL. На 48 ч, результаты остаются аналогичными и относительно сбалансированный, с наименее снижением TEWL (33%), для добавления 6% KH, величайший (38%), 4% KH и 2% KH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимуществом щелочных ферментативный гидролиз является, что он может быть изменен согласно будущих приложений KH. Например в приложениях Косметика Уход за волосами, где слегка коричневого цвета продукта не является препятствием, более высокую температуру в гидролиза могут быть применены приводит к более высокую урожайность КХ. Кроме того, больше время обработки во время обоих этапов технологического процедуры существенно влияет на общий процесс эффективности – доходность KH возрастает до 85%.
Выводы для гидратации измерения делают очевидным, что, во время мониторинга интервала измерения (1-48 h), добавлением 2% KH на Обь оптимальной так как он вызывает увеличение 11-19% гидратации SC для мужчин добровольцев и увеличение на 12-22% для женщины добровольцев. KH, которая добавляется имеет широкое распределение молекулярного веса. Мы предполагаем, что часть низкий молекулярный вес дроби (МВт < 20 кДа) проникает в эпидермис, после нанесения на кожу. Увеличение гидратации кожи после нанесения на формулировку с KH объясняется через KH привязки воду из нижних слоев эпидермиса в структуре SC, приводит к образованию H-моста между молекулами KH и воды. Этот механизм действия также поддержана некоторые авторы30. Увлажняющий эффект KH сопоставимо с обычными увлажнители (например, глицерин, мочевина и гиалуроновой кислоты), которые были протестированы в эмульсии и гель формулировки22.
Измерения TEWL подчеркнуть, что наблюдаемое время измерения (1-48 h) для мужчин добровольцев, все составы с KH добавок вызвало TEWL снижаться после применения. Добавление 2% KH на Обь вызвала сокращение в TEWL 11-23%, по сравнению с чисто OB. Когда Обь была дополнена 4% KH, TEWL, на 28-47%; Хотя для KH на 6%, она уменьшилась на 31-54%. Для женщины добровольцев, дополняющего Обь с 4% KH представляет самый лучший вариант, как там было 24-44% снижение SC TEWL. Значительно ниже TEWL для составов с KH можно объяснить процесс выше молекулярный вес дроби KH, образуя защитную пленку, когда применяется к эпидермис, таким образом предотвращая потерю эпидермальный воды. В самом деле весьма положительный эффект KH на TEWL сопоставимых или даже превышает, ради сравнения, значения TEWL, записанная для косметических гелей или эмульсии с 5-10% глицерина и 1-5% серицина. Аналогично при сравнении KH с обычными минеральными маслами, KH подрываются TEWL примерно 25-30%31. Кроме того барьерные свойства KH лучше, чем, например, для22мочевины и гиалуроновой кислоты.
pH поверхности кожи:
Для справки рН 3,5 до 4,3 поверхность кислой кожи, рН 4,4 до 5,5 нейтральную позицию в этом отношении, и рН 5,6-6,5 представляет основные кожи поверхности32. Мы обнаружили, что существенных изменений не были замечены в pH поверхности кожи после нанесения на всех протестированных составов (OB + 2, 4 и 6% KH); pH 4.6 до 5.0 (мужчины добровольцы), и 4,9 до 5,4 (женщины-добровольцы) соответствует нормальной кожи поверхности. Анализ долгосрочных (более чем 2 дней) не была выполнена.
Модификации и устранения неполадок:
Переработка куриные перья в KH очень легко и работает при атмосферном давлении и температуре мягкая. Процесс может быть выгодно преобразован от лабораторных в опытном масштабе и промышленного масштаба. В разделе 2 протокола где KH гомогенизированные базы эмульсией (O/W) возможны некоторые изменения. В промышленной практике, O/W и W/O эмульсии готовят путем смешивания воды (W) этап (вода + косметических ингредиентов, растворимые в воде) и нефти (O) этап (масло + косметических ингредиентов растворимые в масле). KH-растворим в воде, так что это выгодные смесь непосредственно в водной фазе системы.
Ограничения метода:
Локализация каждого местом для измерения гидратации и TEWL и кованые давления измеряются с метр гидратации кожи, которая является дорогостоящей.
Важнейшие шаги в рамках протокола в основном в разделе 3. Состояние здоровья, индивидуальные различия, курящих/некурящих, гендерные, возрастные различия, менструации и психического состояния могут влиять измерения увлажнению кожи и TEWL. Для получения представительной результаты, то же лицо следует применять протестированных составов на предплечьях и мера гидратации и TEWL значения. Это имеет жизненно важное значение для выполнения всех измерений в кондиционированном номере с стабильной температуры и относительной влажности воздуха. В случае измерения значений интервалом 24 и 48 ч, необходим акклиматизации добровольцев в комнате с кондиционером для по крайней мере 30 минут перед измерением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта статья была написана с поддержкой проекта IGA/FT/2017/007 Томас Бата университета в Злине.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material or chemicals | |||
| LIPEX 100T | Novozymes | LJP30020 | Lipex - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g |
| Savinase Ultra 16L | Novozymes | PXN40001 | Savinase - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g |
| Potassium hydroxide, KOH | Sigma-Aldrich | 302510289 | Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11 |
| Phosphoric acid solution, H3PO4 | Sigma-Aldrich | W290017 | Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00 |
| Sodium chloride physiological solution | Sigma-Aldrich | 52455 | Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl |
| Sodium hydroxide, NaOH | Penta s.r.o. | 40216 | Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00 |
| AmiFarm (Cremor base-A) | Fagron | 608425 | Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers | IKA-labortechnik | Z404020 | Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs |
| IKA Propeller stirrer, 3-bladed | IKA-labortechnik | R 1381 | Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm |
| Dialysis tubing closures | Sigma-Aldrich | Z371017-10EA | Dialysis tubing closures, red, size 110 mm |
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma-Aldrich | D9402-100FT | Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.) |
| DOMO Pot with stailess, LCD | DOMO Elektronic | DO42325PC | Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display |
| Hettich zentrifugen Universal 32 | Gemini bv | 2770 GS1R | Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm |
| LT 3 shaking device | Fischer Scientific | 6470.0002 | Orbital shaking device |
| KERN 440-47N | Kern | 440-47N | Laboratory balance |
| KERN 770 | Kern | 770 -N | Laboratory analytical balance |
| VENTICELL 222 - Komfort | BMT, MMM Group | C 131749 | Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control |
| Vacucell 55 - EVO | BMT, MMM Group | B 050328 | Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C |
| PULVERISETTE 19 | Fritsch | 19.1030.00 | Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives |
| Multi Probe Adapter System MPA 5 | Courage & Kazaka Electronic | 10225237 | MPA 5 Station - equipment for measurement hydratation, TEWL and pH |
| Skin pH-meter PH 905 probe | Courage & Kazaka Electronic | Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp | |
| Corneometer CM 825 probe | Courage & Kazaka Electronic | Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum). | |
| Tewameter TM 300 | Courage & Kazaka Electronic | Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL) | |
| Heidolph RZR 2020 | Heidolph | 13-225-007-03-1 | Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm |
| Heidolph mechanical stirrer BR 10 | Heidolph | Z336688-1EA | Blade impeller crossed stirrer |
| Fagor FS 12 | Fagor | BTT-138 | Laboratory refrigerator with freezer space |
| WTW bench pH/mV meter | WTW | Z313165 | High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories |
| Container | RPC Superfos | 13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microsoft Office 2010 | Microsoft | ||
| C+K software | Courage and Khazaka Electronic GmbH | MPA 5 station operating software |
References
- United States Department of Agriculture - National Agricultural Statistics Services. Poultry Slaughter, 2016 Summary. , (2016).
- McGovern, V. Recycling poultry feathers: more bang for the cluck. Environ.Health Perspect. 108 (8), A336-A339 (2000).
- Gousterova, A., et al. Degradation of keratin and collagen containing wastes by newly isolated thermoactinomycetes or by alkaline hydrolysis. Lett. Appl. Microbiol. 40 (5), 335-340 (2005).
- Yamauchi, K., Yamauchi, A., Kusunoki, T., Khoda, A., Konishi, Y. Preparation of stable aqueous solution of keratins, and physiochemical and biodegradational properties of films. Biomed. Mater. Res. 31 (4), 439-444 (1996).
- Schrooyen, P. M. M., Dijkstra, P. J., Oberthur, R. C., Bantjes, A., Feijen, J. Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J. Agric. Food Chem. 49 (1), 221-230 (2001).
- Mark, H. F., Gaylord, N. G., Bikales, N. M. Encyclopedia of Polymer Science Technology: vol. 8: Keratin to Modacrylic Fibers. , Wiley-Interscience. New York. (1968).
- Bertsch, A., Cello, N. A biotechnological process for treatment and recycling poultry feathers as a feed ingredient. Bioresour. Technol. 96 (15), 1703-1708 (2005).
- Grazziotin, A., Pimentel, F. A., de Jong, E. V., Brandelli, A. Nutritional improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase. Animal Feed Sci. Technol. 126 (1-2), 135-144 (2006).
- Brandelli, A. Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond. Food Bioprocess Technol. 1 (2), 105-116 (2008).
- Gusta, R., Ramnani, P. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl.Microbiol. Biotechnol. 70 (1), 21-33 (2006).
- Vasileva-Tonkova, E., Gousterova, A., Neshev, G. Ecologically safe method for improved feather wastes biodegradation. International Biodeterior & Biodegradation. 63 (8), 1008-1012 (2009).
- Lodén, M. Hydrating Substance. Handbook of Cosmetic Science and Technology. Barel, A. O., Paye, M., Maibach, H. I. , Informa, Healthcare. New York. 107-119 (2009).
- Teglia, A., Secchi, G. Chapter 9: Proteins in Cosmetics. Principles of Polymer Science and Technology in Cosmetics and Personal Care. Goddard, E. D., Gruber, J. V. , Marcel Dekker. New York. (1999).
- Magdassi, S. Delivery systems in cosmetics. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 123-124, 671-679 (1997).
- Method for producing a protein hydrolysate. U.S. Patent. Dahms, G., Jung, A. , 20140323702 (2014).
- Pons, R., Carrera, I., Erra, P., Kunieda, G., Solans, C. Novel preparation methods for highly concentrated water-in-oil emulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 91 (3), 259-266 (1994).
- Mokrejs, P., Hrncirik, J., Janacova, D., Svoboda, P. Processing of keratin waste of meat industry. Asian J. Chem. 24 (4), 1489-1494 (2012).
- Mokrejs, P., Svoboda, P., Hrncirik, J. Processing poultry feathers into keratin hydrolysate through alkaline-enzymatic hydrolysis. Waste Manage. Res. 29 (3), 260-267 (2011).
- Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P. Producing keratin hydrolysates from sheep wool. Orient. J. Chem. 27 (4), 1303-1309 (2011).
- Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P., Vasek, V. Modeling technological conditions for breakdown of waste sheep wool. Rasayan J. Chem. 4 (4), 728-735 (2011).
- Polaskova, J., Pavlackova, J., Vltavska, P., Mokrejs, P., Janis, R. Moisturizing effect of topical cosmetic products applied to dry skin. J. Cosmet. Sci. 64 (5), 329-340 (2013).
- Polaskova, J., Pavlackova, J., Egner, P. Effect of vehicle on the performance of active moisturizing substances. Skin Res. Technol. 21 (4), 403-412 (2015).
- Verdier-Sévrain, S., Bonté, F. Skin hydration: a review on its molecular mechanisms. J. Cosmet. Dermatol. 6 (2), 75-82 (2007).
- Darlenski, R., Sassning, S., Tsankov, N., Fluhr, J. W. Non-invasive in vivo methods for investigation of the skin barrier physical properties. Eur. J. Pharm. Biopharm. 72 (2), 295-303 (2009).
- Berardesca, E. EEMCO guidance for assessment of stratum corneum hydration: electrical methods. Skin Res. Technol. 3 (2), 126-132 (1997).
- Rogiers, V. EEMCO guidance for the assessment of transepidermal water loss in cosmetic sciences. Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 14 (2), 117-128 (2001).
- Ali, S. M., Yosipovitch, G. Skin pH: from basic science to basic skin care. Acta Derm. Venereol. 93 (3), 261-267 (2013).
- Agache, P., Humbert, P. Measuring the Skin. , Springer-Verlag. Berlin. (2004).
- Council for International Organizations of Medical Sciences. International Ethical Guidelines for Biomedical Research Involving Human Subjects. , Geneva. (2002).
- Ruland, J. K. Transdermal permeability and skin accumulation of amino acids. Int. J. Pharm. 72 (2), 149-155 (1991).
- Draelos, Z. D. Therapeutic moisturizers. Dermatol. Clin. 18 (4), 597-607 (2000).
- Courage and Khazaka Electronic GmbH, Technical Charges. Information and Operating Instructions for the Multi probe Adapter MPA and its Probe. , (2013).
