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Immunology and Infection

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56255
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 2
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.

Abstract

항 원 특정 살인에 대 한 현재 방법은 생체 외에서 사용을 제한 또는 전염병 모델에 활용. 그러나, 감염 없이 항 원 특정 살인을 측정 하기 위한 프로토콜이 아니라 있다. 이 프로토콜은 설계 및 항 원 특정의 검출 함으로써 이러한 한계를 극복 하는 방법을 설명 합니다+ T vivo에서세포 CD8 하 여 목표 셀의 살인. 이 분석 결과 죽이고 전통적인 CFSE 표시 대상 접종 모델을 병합 하 여 수행 됩니다. 이 조합은 분석 결과 감염 또는 종양의 성장에 따라 의존 하지 않습니다 직접 그리고 신속 하 게 항 원 특정 CTL 잠재력을 평가 하는 연구원을 수 있습니다. 또한, 판독 cytometry에 기반 하 고 그래서 대부분 연구자에 게 쉽게 접근할 수 있어야. 연구의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 테스트 중인 가설에 적합 한 식별 됩니다. 항 원 강도 변화와 차동 cytolytic 함수에서 발생할 수 있는 T 세포에 돌연변이 세포 수확 및 평가 대 한 최적의 시간을 결정을 신중 하 게 평가 해야 합니다. 예방 접종에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 맞게 최적화 된 hgp10025-33 , OVA257-264, 하지만 추가 유효성 검사는 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 펩 티 드에 대 한 필요할. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.

Introduction

CD8의 cytolytic (CTL) 잠재력을 평가 하기 위해 존재 하는 여러 프로토콜+ 또는 CD4+ T-셀. 이 평가 생체 외에서 제어 조건1,,23에서 쉽게 할 수 있습니다. 또한, 전염병 모델, LCMV, 고전적인 차동 CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르) 대상 셀을 표시를 사용 하 여 CTL 기능 검사 어디는 CFSE안녕-레이블이 지정 된 셀 펩 티 드 및 CFSElo펄스-레이블이 대상 셀 남아 있다 unpulsed. 셀에 1:1 비율로 주입은 그리고는 CFSE안녕의 손실에 대 한 평가-흐름 cytometry4펄스 대상 이라고 표시 된. 백신 및 제거 모델도 비슷한 전략에 vivo에서 두 CD8 살해의 평가 대 한 사용+ 와 CD4+ T 세포 뿐만 아니라 NK 세포5,6. 이 강력한 분석 결과 이지만 대상 주입 전에 면역 시스템 프라임 전염 성 요원의 사용을 요구 한다.

이 프로토콜을 다른 한편으로, 아무 사전 감염 호스트의를 요구 하 고 대신 예방 접종 전략 대상 주입 전에 면역 체계를 이용 한다. 이 예방 접종 이라고 covax7, 수용 체 통행세 같이 7 (TLR7)의 구성 된 immunostimulatory 칵테일의 제공을 요구 하는 펩타이드 백신의 물 배합의 구성 주 작동 근 (imiquimod 크림), agonistic 안티-CD40 항 체, 그리고 interleukin-2 (일리노이-2) 펩 티 드 관련 못쓰게 하 고 강력한 면역 반응의 도출에 대 한 immunostimulatory 에이전트의 시너지 조합에 지도. 따라서,이 분석 결과 제공 CTL 함수의 빠른 판독 백신 3 일전 주입 대상 셀의 함수의 평가 대 한 셀에 함께 관리 된다. 또한, covax 못쓰게가 강하다 충분히 주입 후 4와 24 h 사이 끝났다 항 원 특정 T 세포의 살해 능력을 볼 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 항 원 및 가설 테스트에 적합 한 대상 살인의 탐지를 위한 식별 됩니다. 주의 깊은 평가 수행 해야 합니다, 유전 변경 뿐 아니라 항 원 강도에 유사로 T-세포에서 테스트 되 고 될 수 있습니다 대상 살인의 다른 타이밍 검출 필요로 하는 차동 CTL 함수. 또한, 예방 접종에 맞게 최적화 된 인간 흑색 종 항 원 glycopeptide 100 (hgp10025-33)에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 동안 ovalbumin (OVA257-264)257-264 8,9 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 항 원 모델의 사용 추가 유효성 검사가 필요한 것 이다. 예상된 한 보조로는 covax와 함께에서 CTL effector 기능을 자극 하는 대상 항 용량 차이, 때문에 일리노이-2 복용량 농도 및 복용량 주파수의 최적화는 원하는 목표를 달성 하기 위해 필수적인 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.

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Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 텍사스 대학 MD 앤더슨 암 센터의에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 백신에 대 한 펩 티 드의 준비

  1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 적절 한 농도와 30에 대 한 소용돌이와 동결 건조 된 펩 티 드를 분해 s.
    참고: hgp10025-33, 최종 농도 1 mg/mL 및 OVA257-264, 최종 농도 0.5 mg/mL입니다. 주입 전에 펩타이드 reconstitute 재구성 후 저장 하지 마십시오.

2입니다. 유전자 변형 마우스에서 Splenocytes의 격리

참고: 셀 별개로 비장의 살 균 방식으로 수행 되어야 합니다.

  1. 승인 된 CO2 질 메서드를 사용 하 여 OT-1 유전자 변형 마우스를 안락사 하 고 비장을 제거 합니다.
    참고: 적절 한 유전자 변형 마우스는 선택의 펩 티 드에 대 한 특정이 단계에서 이용 된다.
    1. 그것의 오른쪽에 마우스를 놓는다. 스프레이 70% 에탄올 (EtOH) 마우스의 왼쪽. 집게를 사용 하 여 피부를 끌어와 수술가 위;를 사용 하 여 피부를 잘라 비장은 복 강 내 표시 되지 것입니다. 부드럽게 잘라 오픈 액세스 비장 하 복 막 구멍. 집게를 사용 하 여 비장을 제거 합니다.
  2. (1% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 PBS) 2 mL 매체 A와 페 트리 접시에 70 µ m 필터에 그것을 배치 하는 플런저의 끝으로 비장을 스매싱 하 여 비장을 세분화.
    1. 페 트리 접시를 50 mL 원뿔 튜브에 장소는 splenocytes를 수집 합니다. 매체 수집 하는 모든 셀을 두 번 A의 5 mL를 페 트리 접시를 씻어. 매체는 최대 25 mL를 추가 하 고 셀 475 x g에 실 온에서 5 분 동안 원심.
  3. 셀을 발음 하 고 1 ml에서 / 비장 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼를 resuspend. 품 어 5 분에 대 한 실 온에서 매체 A의 추가 10 mL와 475 x g.에 상 온에서 원심 분리기 Resuspend 매체 A의 10 mL에 펠 릿 및 셀 서 스 펜 션 깨끗 한 50 mL 원뿔형으로 70 µ m 필터를 통해 필터링 하 여 파편을 제거.
  4. Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 10의 최종 농도에 PBS에 셀 resuspend6 -6 셀/100ml. OVA257-에 대 한 특정264 106 셀/mL에서 resuspend, 및 hgp100에 대 한25-33 특정 1006 셀/mL에서 resuspend.
    1. 스핀 475 x g.에서 5 분 동안 실내 온도에 남아 있는 세포는 상쾌한 발음 하 고 세포를 씻어 15 mL 차가운 PBS에 resuspend. 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다. 스핀 475 x g.에서 5 분 동안 실내 온도에 세포는 상쾌한 발음 하 고 최종 볼륨 단계 2.4에서에서 결정에 따라 차가운 PBS에 resuspend.
    2. 단일 세포 현 탁 액 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 받는 사람 C57/BL6 마우스에 주사까지 얼음에 계속.

3입니다. 유전자 변형 쥐에서 Splenocytes의 주입

  1. 등 쪽으로 restrainer에서 받는 사람 C57/BL6 마우스를 놓습니다. 스프레이 분사 꼬리 기본 영역 70% 이소프로필 알콜. 경사 면 27 G 바늘을 사용 하 여 꼬리 정 맥에 정 맥의 단일 세포 현 탁 액 (제 2) 100 µ L를 관리할 수 있습니다.

4. Covax 관리

참고: 셀 오후에 주입 하는 경우 covax 해야 관리할 수 세포 주입의 18 h 이내 다음 아침.

  1. 1-3 %isoflurane 분명 마 취 상자에 마우스를 놓습니다. 후 마우스는 완전히 마 취, 마 취 실에서 매니폴드에 연결 된 코 콘 쥐 전송. 마우스를 등 쪽 사이드와 절제 된 유지.
    참고: Anesthetization 철수 반응 elicited 하지 확인 하려면 간단한 발가락 핀치에 의해 확인 된다. 연방 법률 허가 수 의사 순서 isoflurane 사용을 제한합니다.
  2. 스프레이 분사 꼬리 기본 영역 70% 이소프로필 알콜. (단면도 1)에서 펩 티 드 솔루션의 100 µ L를 피하 주사 꼬리 기본 지역 위로 향하도록 바늘 경사 쪽으로 4-5 밀리미터를 관통 하는 주사기 27 G 바늘을 사용 하 여.
    참고: 쥐 꼬리10의 기지에서 피하 주사와 함께 하나의 측면에서 예방 접종.
  3. 백신 주사 사이트를 100 µ L 안티-CD40 항 체 (주식 0.5 mg/mL) 측면을 주입.
  4. 예방 접종 사이트에 imiquimod 크림 50 mg/마우스를 신중 하 게 적용 됩니다. 크림은 더 이상 볼 수 하 고 완전히 흡수 될 때까지 imiquimod 크림 표면에 문질러.
  5. Intraperitoneally 100000 IU/mL rhIL-2 단백질의 100 µ L를 주사 (i.p.) 더 낮은 복 부 지역에. 그들은 완전히 마 취에서 회복 후 5 분 동안 쥐를 관찰 합니다.
    참고: 실험은 일시 중지이 시점에서 3 일 동안.

5. 격리의 대상 Splenocytes CFSE와 라벨에 대 한

참고: 셀 별개로 비장의 살 균 방식으로 수행 되어야 합니다.

  1. 승인 된 CO2 질 방법 C57BL/6 마우스 안락사 2.1.1 단계에서 spleen(s)를 제거 합니다. 비장을 세분화 하 고 세척 단계 2.2.1-2.2.3에서와 같이 splenocytes. 붉은 혈액 세포 단계 2.3-2.3.2에서 lyse
  2. hemocytometer를 사용 하 여 계산에 대 한 셀을 제거 하 고6 셀/10ml CFSE 라벨 솔루션 (7 단계에서 설명)에서 세포의 최종 농도 대 한 계산. G. Aspirate 상쾌한 x 475에 5 분 동안 실내 온도에 남아 있는 세포를 스핀.

6. 펩 티 드 대상 Splenocytes의 펄스

참고: 펩 티 드 펄스 살 균 방식으로 수행 합니다.

  1. 완전 한 미디어에 106 셀/mL에서 셀 resuspend (RPMI 1640 미디어 10 %FBS, 1 %L-글루타민 (L-Gln), 1% 페니실린/스 (펜/Strep)). 2 튜브 (15 mL conicals)로 셀을 나눕니다. 각 튜브 펄스 또는 unpulsed 레이블.
  2. 펩 티 드 라는 튜브에 펄스를 추가 합니다. OVA257-264 펄스에 대 한 1 µ g/mL을 추가 하 고 hgp10025-33 펄스, 2 µ g/mL를 추가 합니다.
    참고: unpulsed 셀 펩 티 드의 추가 없이 그냥 펄스 셀 같은 외피를 받 다.
    1. 셀 + 1 시간 동안 37 ° C에서 펩 티 드를 품 어.
  3. 완전 한 미디어의 10 mL을 추가 (RPMI 1640 미디어 10 %FBS, 1 %L-글루타민 (L-Gln), 1% 페니실린/스 (펜/Strep)) 씻어 각 관 모두 펄스를 대상 셀 unpulsed. G. Aspirate 상쾌한 x 475에 5 분 동안 실내 온도에 남아 있는 세포를 스핀.

7. 준비 CFSE의 대상 Splenocytes 라벨에 대 한

  1. 세척 단계 6.3;에서 셀 동안 CFSE 라벨 솔루션을 준비 펄스 셀으로 CFSEloCFSE안녕 하 고는 unpulsed로 표시 됩니다. 106 셀 CFSE 라벨 솔루션의 1 mL를 준비 합니다.
    참고: CFSE 빛에 민감한 이며 항상 빛 으로부터 보호 되어야 한다.
    1. CFSE안녕 준비-미디어 RPMI 1640 2%에서에서 5 µ M/mL의 최종 농도 대 한 1 uL/mL CFSE (5 m m 재고 솔루션)를 추가 하 여 라벨 미디어 FBS.
    2. CFSElo 준비-1 uL/mL CFSE (0.5 m m 재고 솔루션) 2%와 0.5 µ M/mL RPMI 미디어 1640의 최종 농도 대 한 추가 하 여 라벨 미디어 FBS.

8. 라벨링 CFSE와 대상 Splenocytes

참고: CFSE 라벨 살 균 방식으로 수행 해야 합니다.

  1. 106 셀/mL CFSE 라벨 미디어에서 (에서 단계 6.3) 펄스와 unpulsed 대상 셀 resuspend Resuspend 펄스 셀 준비 CFSE안녕-미디어와 함께 unpulsed 셀 라벨 준비 CFSElo-라벨 미디어.
  2. 세포와 부드러운 반전 또는 소용돌이 CFSE 라벨 미디어 믹스. Vortexing에 의해 혼합 하지 마십시오. 셀을 품 어 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 미디어 CFSE 라벨 리믹스 셀 마다 5 분.
  3. 475 x g에 5 분 동안 실 온에서 각 셀 서 스 펜 션 및 스핀 세포를 완전 한 미디어의 10 mL를 추가 합니다.
  4. 상쾌한 발음 하 고 10 mL 차가운 PBS에 셀 resuspend. 475 x g에 5 분 동안 4 ° C에서 세포를 스핀.
  5. 8.4 단계를 반복 합니다.
  6. 계산 셀과 믹스 펩 티 드-펄스, CFSE안녕-표시 unpulsed, CFSElo-셀 받는 쥐로 주입에 대 한 1:1 비율로 표시. 1 x 106 초기 흐름 cytometry 평가 (11 단원)를 사용 하 여 셀을 혼합 한 약 수를 유지 합니다.
    참고: 주입에 대 한 최종 볼륨 마우스 당 100 µ L입니다. 마지막 셀 수 10e6 셀입니다. 주사기와 바늘에 볼륨의 손실 고려 되어야 하 고 500 µ L에서 추정 한다.

9입니다. 대상 세포의 주입

참고: 계속 하기 전에 가능한 만큼 많이 주입 하는 동안 빛에서 보호 CFSE 표시 셀.

  1. 등 쪽으로 restrainer에서 받는 사람 C57BL/6 마우스를 놓습니다. 스프레이 분사 꼬리 기본 영역 70% 이소프로필 알콜. 관리 100 µ L 단일 세포 현 탁 액의 정 맥 꼬리 정 맥에 베벨 면이 위로 향하도록 합니다.

10입니다. 다시 격리 대상 셀의

참고:이 단계의 타이밍은 중요 하 고 CTL 세포 독성과 자극에 대 한 항 원의 강도 의존. 죽이 OVA257-264 펄스 대상의 평가, 대 한 세포를 주입 후 수확된 4-6 h을 있이 필요가 있다. CFSE 표시 된 셀은 어둠 속에서 빛, 민감한 프로세스 spleens 이후.

  1. 승인 된 CO2 질 방법 받는 사람 C57BL/6 마우스 안락사
  2. 2.1.1 단계에서 spleen(s)를 제거 합니다. 비장을 세분화 하 고 세척 단계 2.2.1-2.2.3에서와 같이 splenocytes. 붉은 혈액 세포 단계 2.3-2.3.2에서 lyse
  3. Cytometry에 의해 평가 대 한 정렬 (FACs) 버퍼 (1 %BSA + PBS) 1 mL 형광 활성화 된 세포에 세포를 resuspend.

11. 제어 논리 Cytometry CTL 활동을 결정 하

  1. 표준 교류 cytometry 프로토콜을 사용 하 여 CTL 활동의 평가 수행 합니다. 여기11488 nm 레이저와 교류 cytometer에 FITC 채널을 사용 하 여 셀을 획득 합니다.
    1. 게이트 앞으로 분산형 (FSC) vs 측면 살포 (SSC) 매개 변수를 사용 하 여 라이브 세포에. CFSE 긍정적인 총인구에 대 한 라이브 림프 구 게이트 내에서 subgate.
      참고: 삽입 된 CFSE 표시 셀 비장에 총 림프 톨의 작은 하위 집합을 만들 것입니다. CSFE-긍정적인 세포는 로그 눈금에 두 개의 뚜렷한 인구로 표시 되어야 합니다.
    2. 히스토그램 형식을 사용 하 여 unpulsed (왼쪽된 피크, CFSElo) 및 펄스 (오른쪽 피크, CFSE안녕)의 비율을 결정 인구. CFSE안녕하세요 셀의 손실 항 원 특정 CTL 활동을 나타냅니다.

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Representative Results

CFSE 표시 대상 셀의 주입, 전에 1:1 셀 혼합 CFSE안녕 와 CFSE소호 대상 셀의 기준 주파수를 결정 하는 흐름 cytometer에서 실행 됩니다. 그림 1 A CFSE 인구에 있는 변화를 검출 하는 제어 전략, 초기 게이트 FSC 그리고 SSC 매개 변수를 사용 하 여 이루어집니다. 이 인구는 레이블 없는 생 splenocytes에 비해 상대적으로 작은 총 CFSE 긍정적인 세포는 주파수에 있는 변화를 평가 하기 전에 subgated 다음. CFSE안녕하세요 고 CFSElo 인구의 상대 주파수 100% 총 CFSE 양성 인구를 설정 하 여 계산 이다. 이 분석을 할 수 있는 히스토그램 또는 점 작의 형식을 사용 하 여. 주입 전에 CFSE 인구의 상대 주파수의 예를 들어 그림 1B에 표시 됩니다. 이 비율은 거의 정확 하 게 1: 1을 있을 것입니다 하지만 합리적으로 가까이 있어야 합니다. Covax 못쓰게의 필요성 CFSE안녕하세요 대상 셀 24 h 포스트 주입에서 관찰 그림 1C 어디 항 원의 아무 살인 펄스에 표시 됩니다. 그림 1 D 항 원의 효과적인 살인 펄스, CFSE안녕보여줍니다-주입 전에 관찰 되었다 피크 거의 감지와 비율은 극적으로 1% 검출을 50%에서 이동 대상 셀을 표시. 또한 그림 항 원의 활동 펄스, CFSE안녕-6 h와 24 h 포스트 주입이 인구의 감소를 평가 하 여 목표 셀 죽이 표시.

Figure 1
그림 1: 기준 및 주입 CFSE 표시 대상 셀의 다음 레이블이 지정 된 셀의 비교. (A) CTL 함수의 평가 대 한 제어 전략 표시 됩니다. 간단히, 라이브 세포 앞으로 분산형 (FSC) vs 측면 살포 (SSC) 매개 변수를 사용 하 여 문이 있다. 총 CSFE 양성 세포는 라이브 셀 게이트 내에서 subgated. CFSE안녕 및 CFSElo 의 비율 총 CFSE 양성 인구 내의 그들의 각각 주파수를 기반으로 합니다. (B) 다음 CFSE 라벨, 대상 셀은 1:1 혼합 하 고 cytometry CFSE안녕 과 CFSElo 셀의 비율에 대 한 평가. 숫자 (왼쪽) 히스토그램 형식과 CFSE vs SSC 점 플롯 (오른쪽)에 각각 봉우리의 주파수를 나타냅니다. (C)이 covax 처방 사전 예방 접종 없이 죽이 대상 셀의 부족을 보여 줍니다. Splenocytes 주입 후 수확된 24 h를 했다. (D)이 항 원 펄스 CFSE안녕하세요 대상 셀 6 h (상단 그래프)에서 살인을 설명 하 고 24 h (하단 그래프) 게시 주입. 숫자는 히스토그램 (왼쪽)와 CFSE vs SSC 점 플롯 (오른쪽) 형식에 CFSE 표시 된 봉우리의 주파수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 간단 하 고, 신중 하 게 수행 해야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 다음 테스트 되 고 항 원 특정 T 세포의 주입 covax 못쓰게 펄스 목표의 모든 살인을 볼 필요가 있다. 물 기반 covax 예방 접종 급성 염증 상태, 만성 염증 성 단계에 대 한 만듭니다 수 있지만 더 나은 생산할 수 있습니다 느린 원 출시 석유 기반의 접근 방식으로 단기 물에 기초를 둔 배합을 대체 결과7,12.

또한, antigen pulsing 해야 이상적인 흐름 cytometry 판독에 대 한 균일 한 다음 대상 셀의 CFSE 라벨. CFSE안녕 5 µ M와와는 CFSElo 0.5 µ M와 라벨이 제공 하는이 시스템 로그 차이 쉽게 구별 될 수 있는 인구에에서 적합 하 발견 되었다.

이 프로토콜은 간단 하 게 테스트 되 고 특정 항 원 시스템에 대 한 수정입니다. 첫째, 펩타이드는 covax의 일환으로 관리의 농도 확인 한다. 이 적절 한 농도 결정 하는 간단한 방법 예방 접종 하 여 혈액에 주입, 항 원 특정 T 세포의 확장을 추적입니다. 이 경우에, 약한 항 원 (hgp10025-33) 강한 항 원 (OVA257-264)로 배의 펩 티 드를 요구 한다. 이 프로토콜에 사용 되는 유효한 농도 다른 항 원 자극의 강도에 따라 테스트를 위한 적당 한 일 것입니다. 수정에의 한 지점 단순히 야생-타입 마우스 뒤에 펩 티 드의 항 원 가진 면역에 펄스 CTL-기능을 평가 하기 위한 목표 것입니다. 그러나,이 수정 활성화 및 내 인 성 항 원 특정 응답의 확장에 의존 것이 고 그래서 대상 세포 이동의 타이밍 가능성이 필요 예방 접종 후 7-14 일 발생. 또한, 항 원 특정 살인의 수준을 줄일 수 있습니다 크게에 비해 유전자 변형 T 세포를 전송할 때 관찰. 이 수정 경고는 CTL 응답 대상의 수준 너무 낮게 검출 될 수 있습니다.

항 원에 T 세포 프라이 밍에 필요한 금액 뿐만 아니라 CFSE 표시 대상 셀의 다시 격리의 타이밍 특정된 가설을 위해 낙관 되어야 한다. T-세포에 수정 차동에 그 결과 테스트 기능을 죽이고 다시 격리의 타이밍에서 조정 필요할 수 있습니다. T 세포는 죽이 향상 된 기능을 가진 야생-타입 보다 훨씬 빠르게 평가 하는 목표를가지고 해야 합니다. 이 운동 프로 파일 시험된 가설을 해결 하기 위해 최적의 timepoint 결정을 신중 하 게 탐험 한다. 일반적으로, 우리는이 대상 셀의 주입 후 24 h 4 사이 다를 발견.

분석 결과의 한 가지 한계는 효과 기 세포는 하지 만성 자극 소진된 상태를 유도 하는 것입니다. 따라서, CTL 함수는 최근 활성화 효과 기 세포로 제한 합니다. 이 메서드는 미래의 어플리케이션을 위해 재미 있을 것 이다 만성 활성화 항 원 특정 T 세포 부분 집합의 메모리 인구 또는 죽이 능력의 리콜 기능을 평가 하기 위해 수정할 수 수 가능 하다.

CTL 기능에서 vivo에서 시험의이 방법은 수 비보에 죽이 그의 빠른 검출 극복 한 생체 외에서 설정의 제한 사항 중 일부에 대 한. 그대로 면역 체계가 자리에는 고의 covax 메서드를 통해 전송 된 T 세포 프라이 밍 펩 티 드 프레 젠 테이 션 및 내 인 성 항 원 선물 세포에 의해 공동 자극 한다. 다른 비보에 살인 분석 실험와 달리이 메서드는 감염 또는 종양 대상의 존재 필요 하지 않습니다. 그러나, 종양 대상의 추가 추가 비교 기 제공 하는 것 하 고 항 원 특정 T 세포 및이 방법의 미래 응용 프로그램에 대 한 covax 관리의 주입에 앞서 분석 결과를 추가할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH 연구에 의해 지원 (A1R03AI120027 (RN)와 1R21AI20012 (RN)), 제도적 연구 그랜트 (RN), 시작 (RN) 부여, 그리고 MD 앤더슨 CIC 시드 부여 (RN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
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면역학 문제 129 Cytolytic 기능 CD8+ T 세포 vivo에서 분석 결과 펩타이드 백신 CFSE 라벨 급성 반응
<em>Vivo에서</em> 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과
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Haymaker, C. L., Hailemichael, Y.,… More

Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

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