Summary
Målet med denne protokol er at give mulighed for detektion af in vivo antigen-specifikke drab af en målcelle i en murine model.
Abstract
Nuværende metoder til antigen-specifikke drab er begrænset til in vitro- brug eller udnyttet i infektionssygdom modeller. Der er imidlertid ikke en protokol, der er specielt beregnet til at måle antigen-specifikke drab uden en infektion. Denne protokol er designet og beskriver metoder til at overvinde disse begrænsninger ved at tillade til påvisning af antigen-specifikke drab af en målcelle ved CD8+ T-celler i vivo. Dette opnås ved at flette en vaccination model med en traditionel CFSE-mærket målet dræbe assay. Denne kombination gør det muligt for forskeren at vurdere antigen-specifikke CTL potentiale direkte og hurtigt som analysen ikke er afhængig af tumorvækst eller infektion. Derudover udlæsningen er baseret på flowcytometri og så skal være let tilgængelige for de fleste forskere. De store begrænsning af undersøgelsen er at identificere den tidslinjen i vivo , der passer til den hypotese at være testet. Variationer i antigen styrke og mutationer i T-celler, der kan resultere i differential cytolytisk funktion skal vurderes omhyggeligt for at fastslå det optimale tidspunkt for celle høst og vurdering. Den passende koncentration af peptid for vaccination er blevet optimeret til hgp10025-33 og æg257-264, men yderligere validering vil være behov for andre peptider, der kan være mere hensigtsmæssigt at en given undersøgelse. Samlet set denne protokol giver mulighed for en hurtig vurdering af dræbe funktion i vivo og kan tilpasses til enhver given antigen.
Introduction
Flere protokoller findes til at vurdere cytolytisk (CTL) af en CD8+ eller CD4+ T-celle. Denne vurdering kan let gøres i vitro under kontrollerede forhold1,2,3. Derudover infektionssygdom modeller, såsom LCMV, klassisk har undersøgt CTL funktion ved hjælp af varierende CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester) mærket målceller hvor CFSEHej-mærket celler er pulserende med en peptid og CFSElo-mærket målet celler er tilbage unpulsed. Cellerne er derefter sprøjtes i forholdet 1:1 og vurderet for tabet af CFSEHej-mærket pulserende mål af flow flowcytometri4. Vaccine og afvisning modeller har også brugt lignende strategier til vurdering af, i vivo drab af begge CD8+ og CD4+ T-celler såvel som NK celler5,6. Dette er en kraftfuld assay, men kræver brug af smitstoffer, der prime immunsystemet inden målet injektionen.
Denne protokol, på den anden side kræver ingen forudgående infektion af værten og i stedet udnytter en vaccinationsstrategi for at prime immunsystemet inden målet injektionen. Denne vaccination består af en vand-baseret formulering af peptid vaccine, som kræver tilvejebringelse af en immunstimulerende cocktail kaldet covax7, bestående af en Toll-lignende receptor 7 (TLR7) agonist (imiquimod creme), en agonistisk anti-CD40 antistof, og interleukin-2 (IL-2) fører til synergistisk kombination af immunstimulerende agenter for udvikling af peptid-specifikke priming og robust immunrespons. Som sådan, giver denne analyse en hurtig udlæsning af listen over Tillidscertifikater funktion som vaccinen er indgive sammen med celler for vurdering af funktion kun tre dage før injektion af target-cellerne. Derudover er covax priming stærke nok, at drab kapacitet af PRIMES antigen-specifikke T-celle kan ses mellem 4 og 24 timer efter injektion.
De store begrænsning af denne protokol er at identificere tidslinjen i vivo til påvisning af target drab, der er egnet til både antigenet og den hypotese at være testet. Omhyggelig vurdering skal udføres, som variationer i antigen styrke samt genetiske ændringer bliver testet i T-celler kan resultere i differential CTL-funktion, som ville kræve en forskellig timing påvisning af target drab. Hertil kommer, mens den passende koncentration af peptid for vaccination er blevet optimeret til menneskelige melanom antigen glycopeptidgruppen 100 (hgp10025-33) og ægalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , brug af en anden antigen model, der kan være mere hensigtsmæssigt at en given undersøgelse ville kræve yderligere validering. På grund af forventede forskelle i en mål antigener evne til at stimulere CTL effektor funktion i kombination med covax som en adjuvant, kan optimering af IL-2 dosis koncentration og dosis frekvens være afgørende for at nå de ønskede mål. Samlet set denne protokol giver mulighed for en hurtig vurdering af dræbe funktion i vivo og kan tilpasses til enhver given antigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. forberedelse af peptid for vaccinen
- Opløse den frysetørrede peptid med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til den passende koncentration og vortex for 30 s.
Bemærk: For hgp10025-33, endelige koncentration er 1 mg/mL og for æg257-264, den endelige koncentrationen er 0,5 mg/mL. Rekonstruere peptid inden injektionen. Må ikke opbevares efter rekonstituering.
2. isolation af Splenocytes fra Transgene mus
Bemærk: Celle isolation fra milten skal udføres i en steril måde.
-
Aflive de OT-1 Transgene mus ved hjælp af metoden med godkendte CO2 kvælning og fjerne milten.
Bemærk: Relevante Transgene mus er udnyttet i dette trin, der er specifikke for peptid valg.- Lægge mus på sin højre side. Spray i venstre side af musen med 70% ethanol (EtOH). Træk op i huden ved hjælp af pincet og skære huden ved hjælp af kirurgiske saks; milten vil være synlig i bughulen. Forsigtigt skære åbne bughulen for at få adgang til milten. Fjerne milten ved hjælp af pincet.
-
Disaggregate milten ved at placere det i en 70 µm filter i en petriskål med 2 mL medium A (PBS med 1% føtal bovint serum (FBS)) og smashing milt med udgangen af et stemplet.
- Indsamle splenocytes fra petriskål og sted i en 50 mL konisk slange. Vask petriskål med 5 mL af medium A to gange at indsamle alle celler. Tilføje medium et op til 25 mL og centrifugeres celler i 5 min ved stuetemperatur på 475 x g.
- Opsug cellerne og resuspend i 1 mL pr. milt røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. tilføje 10 mL af medium A og centrifugeres ved stuetemperatur på 475 x g. resuspenderes i 10 mL af medium A og fjerne snavs ved at filtrere cellesuspension gennem en 70 µm filter til en ren 50 mL konisk.
-
Tælle celler benytter trypan blå og en hemocytometer. Resuspend celler i PBS til en slutkoncentration på 106 - 1006 celler/mL. For æg257-264 specifikke drab, resuspend på 106 celler/mL og for hgp10025-33 specifikke drab, resuspend på 1006 celler/mL.
- Spin de resterende cellerne ved stuetemperatur i 5 min på 475 x g. Aspirér supernatanten og resuspend i 15 mL koldt PBS at vaske cellerne. Gentag trinnet vask en gang mere. Spin cellerne ved stuetemperatur i 5 min på 475 x g. Aspirér supernatanten og resuspend i kolde PBS efter det endelige rumfang bestemmes i trin 2.4.
- Overføre enkelt cellesuspension til en 1,5 mL microcentrifuge tube og holde på is indtil injektion i modtagerens C57/BL6 mus.
3. indsprøjtning af Splenocytes fra Transgene mus
- Placere modtageren C57/BL6 mus i en Tilbageholderen med den dorsale side op. Spray injektion hale basisareal med 70% isopropylalkohol. Administrere 100 µL af enkelt cellesuspension (afsnit 2) intravenøst i halen vene ved hjælp af en 27 G kanyle med facet side opad.
4. Covax Administration
Bemærk: Hvis celler injiceres i eftermiddag, covax bør administreres den følgende morgen inden for 18 h af celle indsprøjtning.
- Placere musen i en klar anæstesi boks med 1-3% isofluran. Når musene er fuldt bedøvede, overføre mus til næse kegler knyttet til manifold i anæstesi-afdeling. Holde mus tilbageholdende med den dorsale side op.
Bemærk: Anesthetization er blevet bekræftet af en kort tå knivspids at kontrollere en tilbagetrækning svar ikke er fremkaldte. Føderale lovgivning begrænser isofluran brug om en bevilget veterinarian. - Spray injektion hale basisareal med 70% isopropylalkohol. Indsprøjtes 100 µL af peptid løsning (fra afsnit 1) subcutaneously benytter en 27 G kanyle med sprøjten gennemtrængende 4-5 mm ind i halen base regionen, nål facet side opad.
Bemærk: Mus er vaccineret i en flanke med subkutan injektion i bunden af hale10. - Indsprøjtes 100 µL anti-CD40 antistof (0,5 mg/mL lager) lateral til vaccine indsprøjtning arbejdsplads.
- Omhyggeligt gælde imiquimod creme 50 mg/mus på vaccination websteder. Gnid imiquimod creme på overfladen, indtil cremen er ikke længere synlig og er fuldt absorberet.
- Indsprøjtes 100 µL af 100.000 IE/mL rhIL-2 protein intraperitoneal (i.p.) på den lavere abdominal region. Observere mus i 5 min, efter at de fuldt ud at genvinde fra anæstesi.
Bemærk: Eksperiment er standset på dette punkt i 3 dage.
5. isolering af mål Splenocytes for mærkning med CFSE
Bemærk: Celle isolation fra milten skal udføres i en steril måde.
- Aflive C57BL/6 mus efter godkendte CO2 kvælning metode. Fjerne spleen(s) som i trin 2.1.1. Disaggregate milten og vaske splenocytes som i trin 2.2.1 - 2.2.3. Lyse røde blodlegemer som i trin 2.3 - 2.3.2.
- Fjerne celler til optælling ved hjælp af en hemocytometer og beregne for en endelig koncentration på celler på 106 celler/mL i CFSE-mærkning løsning (beskrevet taktfast 7). Spin resterende cellerne ved stuetemperatur i 5 min på 475 x g. aspirat supernatanten.
6. peptid pulserende af Target Splenocytes
Bemærk: Peptid pulserende skal udføres i en steril måde.
- Resuspend celler på 106 celler/mL i komplet media (RPMI 1640 medier med 10% FBS, 1% L-glutamin (L-Localisation), 1% penicillin/streptomycin (Pen/Strep)). Opdele celler i 2 rør (15 mL conicals). Label hver tube som pulserende eller unpulsed.
-
Tilføje peptid til røret mærket pulserende. OVA257-264 pulserende, tilsættes 1 µg/mL og hgp10025-33 pulserende, tilsættes 2 µg/mL.
Bemærk: De unpulsed celler underkastes den samme inkubation som pulserende cellerne bare uden tilsætning af peptid.- Inkuber celler + peptid ved 37 ° C i 1 time.
- Der tilsættes 10 mL af komplette medier (RPMI 1640 medier med 10% FBS, 1% L-glutamin (L-Localisation), 1% penicillin/streptomycin (Pen/Strep)) til hver tube at vaske både pulserende og unpulsed target-cellerne. Spin resterende cellerne ved stuetemperatur i 5 min på 475 x g. aspirat supernatanten.
7. forberedelse af CFSE til mærkning mål Splenocytes
-
Forberede CFSE-mærkning løsning under cellen vask i trin 6.3; de pulserende celler vil være mærket som CFSEHej og de unpulsed som CFSElo. Forberede 106 celler 1 mL af CFSE-mærkning løsning.
Bemærk: CFSE er lysfølsomt og skal beskyttes mod lys på alle tidspunkter.- Forberede CFSEHej -mærkning medier ved at tilføje 1 uL/mL CFSE (5 mM stamopløsning) til en endelig koncentration på 5 µM/mL i RPMI medier 1640 med 2% FBS.
- Forberede CFSElo -mærkning medier ved at tilføje 1 uL/mL CFSE (0,5 mM stamopløsning) til en endelig koncentration på 0,5 µM/mL RPMI media 1640 med 2% FBS.
8. mærkning af Target Splenocytes med CFSE
Bemærk: CFSE mærkning skal foretages i et sterilt måde.
- Resuspend pulserende og unpulsed target-cellerne (fra trin 6.3) på 106 celler/mL CFSE-mærkning medier. Resuspend de pulserende celler med forberedt CFSEHej-mærkning medier og de unpulsed celler med forberedt CFSElo-mærkning medier.
- Bland celler og mærkning af CFSE media af blid inversion eller hvirvlende. Bland ikke af vortexing. Inkuber celler og mærkning af CFSE media ved 37 ° C i 15 min. Remix cellerne hvert 5 min.
- Der tilsættes 10 mL af komplette medier til hver celle suspension og spin cellerne ved stuetemperatur i 5 min på 475 x g.
- Opsug supernatanten og resuspend celler i 10 mL koldt PBS. Spin celler ved 4 ° C i 5 min på 475 x g.
- Gentag trin 8,4.
- Tælle celler og mix peptid-pulserende, CFSEHej-mærket med unpulsed, CFSElo-mærket celler i forholdet 1:1 til injektion i modtagerens mus. Holde en alikvot af 1 x 106 blandet cellerne til at bruge en baseline flow flowcytometri vurdering (afsnit 11).
NOTE: Den endelige mængden til injektion er 100 µL pr. mus. Den endelige celletal er 10e6 celler. Tabet af volumen i sprøjte og kanyle skal tages i betragtning og bør være anslået til 500 µL.
9. indsprøjtning af Target-cellerne
Bemærk: Holder CFSE-mærket celler beskyttet mod lys forud for og under injektion så meget som muligt.
- Placere modtageren C57BL/6 mus i en Tilbageholderen med den dorsale side op. Spray injektion hale basisareal med 70% isopropylalkohol. Administrere 100 µL af enkelt cellesuspension intravenøst i halen vene med facet side opad.
10. ny isolering af Target-cellerne
Bemærk: Timingen af dette trin er kritisk og afhængig af CTL cytotoksicitet og styrken af antigen for stimulation. For vurdering af dræbe et æg257-264 pulserende mål, skal cellerne være høstet 4-6 h efter injektion. Da CFSE mærkede celler er lys følsom, proces milt i mørke.
- Aflive de modtagende C57BL/6 mus efter metoden med godkendte CO2 kvælning.
- Fjerne spleen(s) som i trin 2.1.1. Disaggregate milten og vaske splenocytes som i trin 2.2.1 - 2.2.3. Lyse røde blodlegemer som i trin 2.3 - 2.3.2.
- Resuspend celler i 1 mL fluorescens aktiveret celle sortering (FACs) buffer (1% BSA + PBS) for vurdering ved flowcytometri.
11. gating logik til at bestemme CTL aktivitet ved flowcytometri
-
Udføre vurdering af CTL aktivitet ved hjælp af en standard flow flowcytometri protokol. Erhverve celler ved hjælp af FITC-kanal på en flow Flowcytometret med en 488 nm laser for excitation11.
- Gate på live lymfocytter ved hjælp af parametrene forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC). Subgate inden for den levende lymfocyt gate til befolkningens samlede CFSE-positive.
Bemærk: De injicerede CFSE-mærket celler vil gøre op en lille delmængde af de samlede lymfocytter i milten. CSFE-positive celler skal vises som to adskilte populationer på log skala. - Brug et histogram format til at bestemme procentdelen af den unpulsed (venstre peak, CFSElo) og pulserende (højre peak, CFSEHej) populationer. Tab af CFSEHej celler angiver antigen-specifikke CTL aktivitet.
- Gate på live lymfocytter ved hjælp af parametrene forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC). Subgate inden for den levende lymfocyt gate til befolkningens samlede CFSE-positive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inden injektion af CFSE-mærket target-cellerne køres 1:1 celle blandingen på en flow forskellige til at bestemme baseline frekvenser af både den CFSEHej og CFSElo target-cellerne. Figur 1 A viser den gating strategi til at opdage ændringer i CFSE populationer, en indledende gate er lavet ved hjælp af FSC og SSC parametre. De samlede CFSE-positive celler er derefter subgated forud for vurdering af ændringer i hyppighed, da denne population er relativt lille sammenlignet med den umærkede endogene splenocytes. Den relative hyppighed af de CFSEHej og CFSElo populationer er den beregnede ved at angive den samlede CFSE-positive befolkning på 100%. Denne analyse kan gøres ved hjælp af et histogram eller dot plot format. Et eksempel på den relative hyppighed af CFSE befolkningerne inden injektionen er vist i figur 1B. Dette forhold bliver sjældent præcis 1:1, men bør være nogenlunde tæt. Nødvendigheden af at covax priming er vist i figur 1C hvor ingen drab af antigenet pulserende, CFSEHej target-cellerne er observeret på 24 h post injektion. Figur 1 D viser effektivt drab af antigenet pulserende, CFSEHej-mærket target-cellerne som den top, der var observeret inden injektionen er næsten uopdaget og forholdet er dramatisk flyttet fra 50% til 1% detektion. Figuren viser også kinetik af antigen pulserende, CFSEHej-mærket mål celle drab ved at vurdere tab af denne befolkning på både 6 h og 24 h post injektion.
Figur 1: Sammenligning af mærket celler ved baseline og efter injektion af CFSE-mærket målceller. (A) den gating strategi for vurdering af CTL funktion er vist. Kort, live lymfocytter er gated ved hjælp af forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC) parametre. Samlede CSFE-positive celler er subgated i den levende celle gate. Forholdet mellem CFSEHej og CFSElo er baseret på deres respektive frekvens inden for den samlede CFSE-positive befolkning. (B) følgende CFSE mærkning, target-cellerne blandes 1:1 og vurderet for forholdet mellem CFSEHej og CFSElo celler ved flowcytometri. Tallene angiver hyppigheden af de respektive toppe på både et histogram (venstre) og CFSE vs SSC dot plot (højre) formater. (C) det viser manglen på target-cellerne aflivning uden forudgående vaccination med covax regime. Splenocytes blev høstet 24 timer efter injektion. (D) Dette viser aflivning af antigen-pulserende CFSEHej målcellerne på 6 h (top grafer) og 24 h (bunden grafer) post injektion. Tallene angiver hyppigheden af de CFSE-mærket toppe på både et histogram (venstre) og CFSE vs SSC dot plot (højre) format. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er ligetil, er der et par kritiske trin, der skal udføres omhyggeligt. Covax priming efter injektion af antigen-specifikke T-celle bliver testet er nødvendige for at se alle drab på de pulserende mål. Mens det er muligt at vandbaseret covax vaccination skaber en akut inflammatorisk tilstand, for de kronisk inflammatoriske fase, kan erstatter den kortlivede vand-baseret formulering med en langsom-antigen release olie-baserede tilgang producere en bedre resultat7,12.
Endvidere er CFSE-mærkning af target-cellerne efter antigen pulserende behov at være ensartet for en ideel flow flowcytometri udlæsning. Mærkning af CFSEHej med 5 µM og CFSElo med 0,5 µM blev fundet for at være ideel i dette system til at give en log forskel i de befolkninger, der let kunne adskilles.
Denne protokol er enkle at redigere til specifikke antigen-systemet bliver testet. Først, koncentrationen af peptid administreret som en del af covax bør bekræftes. En simpel måde at bestemme den passende koncentration er at vaccinere og spore en udvidelse af de injicerede, antigen-specifikke T-celler i blodet. I dette tilfælde kræver en svag antigen (hgp10025-33) dobbelt så meget peptid som en stærk antigen (OVA257-264). Validerede koncentrationerne anvendes i denne protokol vil være et fornuftigt udgangspunkt for afprøvning andre antigener baseret på styrken af stimulation. Et punkt af ændring ville være, at blot immunisere wild-type mus med et antigen af interesse efterfulgt af peptid pulserende mål for vurdering af CTL-funktion. Men denne ændring ville stole på aktivering og udvidelse af endogene antigen-specifikke svar og så timingen af target celle overførsel vil sandsynligvis nødt til at forekomme 7-14 dage efter vaccination. Derudover kan niveau af antigen-specifikke drab være stærkt reduceret i forhold til den konstaterede ved overførsel af transgene T celler. En advarsel med denne ændring er, at niveauet af CTL svar til målet kan være for lav til at blive opdaget.
Ud over mængden antigen kræves for T-celle priming, skal timingen af ny isoleringen af CFSE-mærket target-cellerne være optimeret til en given hypotese. Ændringer af T-celle bliver testet dette resultat i differential dræbe kapaciteter kan kræve justeringer i timingen af ny isoleringen. En T-celle med en forbedret drab funktion skal have mål vurderes meget hurtigere end dens vildtype modstykke. Denne kinetiske profil bør undersøges nøje for at fastslå det optimale tidspunkt at tage fat på de testede hypotesen. Generelt har vi fundet at variere mellem 4 og 24 timer efter injektion af target-cellerne.
En begrænsning af analysen er at effektor cellerne ikke har været kronisk stimuleres til at fremkalde en udmattet tilstand. CTL funktion er derfor begrænset til nyligt aktiverede effektor celler. Det er muligt, at denne metode kunne være ændret til at vurdere hjemkalde funktion af hukommelseskapacitet befolkning eller drab af en kronisk aktiveret antigen-specifikke T-celle delmængde, som ville være interessant for fremtidige ansøgninger.
Denne metode til testning CTL funktion i vivo giver mulighed for hurtig påvisning af i vivo drab der overvinder nogle af begrænsningerne ved en in vitro- indstilling. Et intakt immunsystem er på plads og priming af de overførte T-celler via covax metoden bygger på peptid-præsentation og co stimulation af endogene antigen-præsenterer celler. I modsætning til andre i vivo dræbe assays, kræver denne metode ikke en infektion eller tilstedeværelsen af en tumor mål. Men tilsætning af en tumor mål ville give en ekstra Komparator og kunne føjes til analysen inden injektion af antigen-specifikke T-celler og covax administration for fremtidige anvendelser af denne metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af NIH forskning (A1R03AI120027 (RN) og 1R21AI20012 (RN)), institutionelle forskning tilskud (RN), start-up tilskud (RN), og MD Anderson CIC frø yde (RN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12 week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
