Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56256

Summary

אנו מתארים שיטה כדי למדוד ההפעלה של פונקציות אפקטור Fc בתיווך על ידי נוגדנים את המטרה hemagglutinin וירוס שפעת. ניתן גם להתאים assay הזה כדי להעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים או polyclonal סרה מיקוד אחרים glycoproteins משטח ויראלי לזירוז חסינות בתיווך Fc.

Abstract

נוגדנים לשחק תפקיד מכריע צימוד את תגובות מערכת החיסון מולדים, גמישים נגד פתוגנים ויראליים דרך שלהם אנטיגן מחייב תחומים ואזורים Fc. כאן, אנו נתאר כיצד למדוד את ההפעלה של Fc אפקטור פונקציות לפי פילוח של hemagglutinin וירוס שפעת עם השימוש של קו תא Jurkat מהונדס גנטית לבטא של הפעלת נוגדנים חד-שבטיים הקלד 1 Fc-FcγR-בשיטה זו, התרומה של אינטראקציות Fc-FcγR ספציפיים שהוענקו immunoglobulins יכול להיקבע תוך שימוש assay במבחנה .

Introduction

חסינות המסופקים על ידי חיסון שפעת עונתית באופן מסורתי העריכו את hemagglutination עיכוב (איץ ' אי) assay1, אשר מודד את נוכחותם של נוגדנים יעד האתר איגוד קולטן של hemagglutinin. נוגדנים אלה HI-פעיל יכול מעניקים חסינות לחיטוי, אך צרים בדרך כלל ב שלהם ולרוחבה של הגנה, מתן חסינות רק זנים נבחרים של וירוס שפעת. בידוד ואפיון של נוגדנים חד-שבטיים בהרחבה תגובתי מזהה את hemagglutinin (HA) מציע שהפיתוח של חיסון שפעת אוניברסלי נמצאת בהישג יד2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. אחת המטרות הגדולות של חיסון שפעת אוניברסלי היא כדי לגרום לתגובה חזקה נוגדן לכיוון האזורים שנשמרת שפעת וירוס9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. בהרחבה נוגדנים תגובתי מזהים אלה epitopes שנשמרת, המורכבת של נטרול והן הלא-נטרול נוגדנים17,18, הוכחו דורשים Fc-FcγR אינטראקציות של האופטימלית הגנה ויוו , המדגישות התרומה של חסינות בתיווך Fc התגובה החיסונית הכוללת שפעת וירוס19,20.

ה"מפה הגנה מכריעים בהערכת חסינות לזיהום. מדדים אלה מאפשרים רופאים ומדענים להעריך את היעילות של חיסונים, המשמעות של הנתונים, על מהלך הטיפול. לתאם הוקמה היחידה של הגנה מפני זיהום בנגיף שפעת היא וזמינותו עיכוב hemagglutination. כייל של 1:40 מזוהה עם הפחתה של 50% הסיכון של המחלה1,21 – ומשקף את הנוכחות של נוגדנים המעכבות התלכדות על ידי מיקוד את קולטן איגוד האתר ממוקם על ראש HA הכדוריים. עם זאת, גם יצוין כי תגובות תא T עשוי להיות עדיף לתאם של הגנה מפני זיהום בנגיף שפעת אצל הקשישים. מעניין, לאחרונה דו ח מצביע על כך neuraminidase עיכוב פעילות עשוי להיות מנבא טוב יותר של חסינות שפעת22. למרבה המזל, טיפוסי במבחנה מבחני כגון מבחני עיכוב ניטרול או neuraminidase יכול למדוד נוגדנים ספציפיים גבעול או neuraminidase HA. רוב אלה מבחני קונבנציונאלי במבחנה , עם זאת, רק לקחת בחשבון את הפונקציה של אזור איגוד אנטיגן הנוגדן ומדידת לא התפקיד של אזור Fc. בנוסף, התרומה של נוגדנים נטרול להגן באמצעות Fc קולטן האירוסין ויוו אינם שזוהו17,18. על מנת למדוד את ההגנה המוענקת על ידי נוגדנים זירוז בתיווך Fc חסינות כמו נוגדנים cytotoxicity מהתא מתווכת (ADCC), נדרשת assay חזקים במבחנה .

בשיטה המתוארת להלן מעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים מאתר לזירוז בתיווך Fc פונקציות באמצעות קו תא Jurkat מהונדסים לבטא של הפעלת הקלד מאתר ה-FcR 1, FcγRIV. נוגדן האירוסין של FcγR transduces הזה גורמים מפעילים גרעיני גורם לפעילות לוציפראז T תאים-בתיווך מופעל איתות תאיים. הבדיקה יש כמה יתרונות על פני שיטות מסורתיות הדורשים בידוד ואת התרבות של תאים אפקטור העיקרי ושימוש של cytometry זרימה כדי לזהות הפעלה של אפקטור בתיווך Fc פונקציות19,23,24 25, ,26. ראשית, הפרוטוקול המתואר כאן בקלות ניתן להתאים לשלב מטרות ויראליות שונות, FcγRs ונוגדנים ממינים שונים (מאתר ואנושי). שנית, השימוש תא Jurkat ששונה קו לבטא FcγR עם גנים כתב לוציפראז תחת מקדם הגרעין של תא T מופעל (NFAT) מאפשר assay בפורמט גדול מסוגל בקלות לנתח שימוש בקורא צלחת מדידה הפריה חוץ גופית. כאן, הפעלת המסורתי של תאים אפקטור העיקרי מוחלף על אינדוקציה של NFAT-לוציפראז על נוגדן האירוסין של FcγR על פני השטח של התא Jurkat. Assay תבנית זו צלחת 96-ובכן מאפשר המדידה של עד ארבע דוגמאות שונות triplicates עם שבע דילולים – מספר דוגמאות שיכול להיות מסורבלת בטכניקות מסורתיות. ישנן נקודות נוספות לשקול עם זה וזמינותו שעשויים להשפיע על העיצוב של ניסויים ופרשנות של נתונים. המטרה ויראלי חייב להתבטא על פני התא על מנת ל'זיהוי נוגדן. כדי להמתיק את זה, המטרה אנטיגן (למשל חלבון נגיפי פנימי) עשוי להיות ישירות מצופה על פני השטח של צלחת. עם זאת, זה לא עוד בקפדנות נבדקו. בנוסף, הקו תא Jurkat ששונה מבטא רק סוג אחד של הפעלת FcγR, ואינה מבטאת כל FcγRs מעכבות, ואילו התא הראשי קווי אקספרס קולטנים כל בהקשר פיזיולוגיים.

השתמשנו בעבר assay הזה כדי להדגים ירידה לפרטים epitope בהקשר polyclonal משחקת תפקיד חשוב בוויסות אפקטור בתיווך Fc פונקציות הפעלה מיטבית של תגובה תאית נוגדנים תלויי דורש שתי נקודות צור קשר עם27,28. כאן, אנו מתארים שיטה הבודק את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים גבעול ספציפית לעסוק ולהפעיל מאתר את הפעלת FcγRIV. למרות שיש חריגים29,30, מספר גדול של נוגדנים בהרחבה תגובתי למקד אזור גבעול שנשמרת antigenically hemagglutinin, וכך לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות שפעת אוניברסלי חיסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים שהופעתם בהם כתב יד זה נעשו מוסדיים קוד של הבאים Icahn לרפואה של אתיקה ותקנות.

1. ביטוי שפעת וירוס Hemagglutinin באמצעות תרביות תאים או זיהום

תרביות תאים:

  1. . תן לזה לנוח במשך 4 שעות בחממה 37 °C (עם 5% CO2), ובא 96-ובכן צלחת צלחת תאים כליה אנושית עובריים (HEK 293T) על צפיפות של 2 x 104 תאים/היטב בתרבות הלבנה רקמות.
  2. Transfect תאים עם 100 ננוגרם של קידוד גנטי hemagglutinin ויראלי, μL 0.2 של תרביות תאים מגיב לכל באר הנפח הכולל של 50 μL.
    הערה: שניהם ריאגנט פלסמיד ו- transfectant הם מדולל 1 x Opti-מינימום הכרחי מדיה (מאמ) מופחת סרום בינוני.
  3. לאחר המקננת הצלחות חממה 37 °C עם 5% CO2 עבור 18 h, להסיר מדיה תרביות תאים.

2. זיהום

  1. תאי הכליה הכלבים A549 צלחת או מדין דארבי-צפיפות של 2 x 104 תאים/היטב בתרבות הלבנה רקמות טיפול צלחת 96-ובכן ולגדול לפחות 18 h ב- 37 °C חממה עם 5% CO2.
  2. וירוס שתדללו 1 x MEM להדביק תאים על ריבוי של זיהום של 3, 1 או 0.33 עבור 1 h בחממה 37 °C עם 5% CO2. הנפח הכולל צריך להיות שווה 100 μL.
    הערה: x 10 MEM מדולל עם מים כדי ליצור 1 x MEM מלאי עבודה עבור וירוס דילול שהוזכרו לעיל.
  3. לאחר ההדבקה, להסיר את inoculum ולהוסיף μL 100 1 x MEM המשקולת בהיעדרו של טריפסין.
  4. לגדל תאים נגועים עבור 18 עד 24 h בחממה 37 °C עם 5% CO2.

3. הערכת הפעלת FcRg/NFAT-מתווכת לוציפראז פעילות על ידי נוגדנים חד-שבטיים או סרה

  1. ראשית, החלף מדיה צמיחה של תאים נגועים או transfected 25 µL assay מדיה (1 x RPMI 1640 בתוספת 4% (vol/כרך) נמוך IgG עובריות שור sera).
  2. בצלחת נפרדת 96-ובכן, ביצוע דילולים ארבעה קיפולים של הנוגדנים עניין החל מ- 30 μg/mL באמצעות התקשורת וזמינותו. ביצוע דילולים ב- triplicates, פריסה צלחת של דוגמה מאויר באיורים איור 1A. הקפד לכלול פקד שתואמות נוגדנים (אין שליטה נוגדנים) כמו גם פקד רקע (assay מאגר לבד).
    הערה: עבור שני 'לא הנוגדן' ועל רקע פקדים, להוסיף 25 µL assay מאגר במקום נוגדן.
  3. העברה μL 25 של נוגדנים באופן סדרתי מדולל-3.2 שלב ולס המתאימות בצלחת של תאים transfected או תאים נגועים.
  4. דגירה צלחת חממה 37 °C (עם 5% CO2) למשך 15 דקות.
  5. להוסיף 25 μL של התא Jurkat אפקטור הולם המתוקנת מאתר FcgRIV או FcgRIIIa האנושית (75,000 תאים/הבאר). הנפח הכולל עבור כל אחד צריך להיות 75 µL, הריכוז הסופי ההתחלתי של הנוגדן ב 10 µg/mL (איור 1B).
    הערה: עבור הפקד רקע, להוסיף 25 µL assay מאגר במקום אפקטור תאים. לבדוק נוגדנים תלויי תאית phagocytosis, תא Jurkat ששונה לבטא את FcgRIIa האנושית יכולה לשמש.
  6. דגירה צלחת חממה 37 ° C עם 5% CO2 עבור 6-אייץ '.
  7. הפשרה ומאגר לוציפראז חמים המצע במים 37 °C למשך כ 1 h לפני השימוש.
    הערה: כדי להפוך את המאגר המצע לוציפראז, לשקם לוציפראז lyophilized assay המצע במאגר assay מסופקים. ניתן לאחסן את המאגר המצע משוקם ב-30 °C עד-10 °C עד שישה שבועות.
  8. להוסיף μL 75/טוב של מאגר המצע לוציפראז בארות כל פרט רקע הפקד.
  9. המשך לקרוא luminometer.
  10. לחשב את הקיפול אינדוקציה עם המשוואה הבאה: מקפלים אינדוקציה = (המושרה ערך-רקע ערך) / (אין ערך ערך-רקע mAb).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

להדגים זאת mAb גבעול ספציפי, 6F12, אבל לא ספציפית ראש בראש-ספציפי mAb, PY102, היה מסוגל להפעיל תאים הרוצח הטבעי העיקרי על-ידי upregulating קולטני γ של CD107a ואינטרפרון-19. כדי לעצב את היכולת של נוגדנים ספציפיים גבעול כדי להפעיל את תאי NK אדם ראשי, אנו מראים mAb גבעול ספציפי, 6F12, robustly יכול להפעיל את התא Jurkat ששונה לבטא את FcγRIV מאתר על ידי ~ 14-fold. מצד שני, mAb הראש ספציפי, PY102, הפקד IgG לעשות לא (איור 2)28.

כדי לחקור אם הריבוי של זיהום (MOI) יכול להשפיע על אינדוקציה של תאים Jurkat לבטא את FcγRIV מאתר, אנחנו נדבקנו MDCK תאים X31 (reassortant שפעת וירוס לבטא את hemagglutinin ואת neuraminidase פלדה של שקופה A/Hong קונג/1/68 (H3N2) וירוס עם המקטעים פנימי פלדה של שקופה A/Puerto ריקו/8/34 (H1N1)) עם MOI 3, 1 או 0.33. עשרים וארבע שעות מאוחר יותר, Jurkat תאים המבטאים מאתר FcγRIV, mAb 9H 10 נוספו אל התאים MDCK נגוע. איור 3, אנו מראים כי תאים נגועים MOI של 3 יכול לגרום בסביבות מקופלים ל- 3 גבוה יותר MDCK תאים נגועים MOI של 0.33 של הפריה חוץ גופית.

Figure 1
איור 1 : שרטוט של פריסה צלחת מדגם ו קומפוזיציה של קבוצות ניסיוני. (א) הריכוז ההתחלתי עבור כל דגימה הנוגדן נמצא 10 µg/mL, באופן סדרתי מדולל על פני המשטח (עמודה 1 לעמודה 12) 4-fold. כל מדגם נעשית triplicates. שורה ג'י שמור עבור הפקד mAb לא, בשורה H רקע. אחסון הסופי (B) עבור כל קבוצת הניסוי לפני חיבור לוציפראז המצע המאגר הוא 75 µL. ראוי לציין, לדוגמה 'אין קבוצות mAb' יש 25 µL של תאים אפקטור נוסף, בעוד קבוצות שליטה רקע יש 75 µL assay המדיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : אינדוקציה של Jurkat ששונה תאים לבטא FcgR על ידי נוגדן חד שבטי גבעול. תאים A549 נדבקו עם A/Puerto ריקו/8/34 (H1N1) עם MOI של 3. ב 24 שעות פוסט זיהום, מאתר לבטא FcγRIV Jurkat תאים בשילוב עם PY102, 6F12 או פקד IgG נוספו. אינדוקציה של תאים Jurkat היו מוערך על ידי הפריה חוץ גופית אות הנוצר על ידי גחלילית לוציפראז תחת הרכיב התגובה NFAT. קווי שגיאה = סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הריבוי של זיהום משפיע על אינדוקציה של נוגדנים ספציפיים גבעול. תאים MDCK נדבקו בנגיף X31 (H3N2) עם MOI 3, 1 או 0.33. ב 24 שעות פוסט זיהום, תאים Jurkat לבטא FcgR בשילוב עם 9H 10 (התחלה דילול של 10 µg/mL) הוסיף. אינדוקציה של תאים Jurkat היו מוערך על ידי הפריה חוץ גופית אות הנוצר על ידי גחלילית לוציפראז תחת הרכיב התגובה NFAT. קווי שגיאה = סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מאפשר למשתמש למדוד את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים HA ספציפית לעסוק FcγRIV מאתר. אנטיגן מטרה, hemagglutinin וירוס שפעת, מבוטא על פני השטח של התאים לאחר זיהום על-ידי וירוס או תרביות תאים של פלסמיד ה-DNA. וזמינותו היא עוד יותר נוטה באמצעות חלבונים ויראלי הביע משטח שונים בשילוב עם FcγRs אחרים (בני אדם או מאתר). בנוסף, השתמשנו סרה דוגמאות כדי להעריך את היכולת של נוגדנים בהקשר polyclonal לזירוז Fc אפקטור פונקציות (נתונים לא מוצג), אשר עשוי לספק מידע רלוונטי יותר כאשר לומדים את תגובה חיסונית אדפטיבית הנגרמת על ידי זיהום או חיסון. אנחנו בנוסף לשער כי ניתן לשנות את הבדיקה כדי למדוד את תנאי הגיוס של נוגדנים לזהות חלבונים ויראלי פנימי על-ידי ישירות ציפוי הצלחות עם חלבון מסיס. עם זאת, מתודולוגיה זו לא בקפדנות נבדק.

יכול להיות מושפע על ידי מספר גורמים, כולל אך לא מוגבל אפקטור היעד יחס אינדוקציה של נוגדנים תלויי אפקטור פונקציות (מספר תאים effectors נוסף לכל טוב), ריכוז נוגדן המשמש, האורך של דגירה בין אפקטור ותאי המטרה, ריכוז נמוך IgG בסרום המשמשים מאגר וזמינותו.

מבחינה היסטורית, וזמינותו סטנדרטי כדי למדוד את הפעילות נוגדנים תלויי הסלולר cytotoxicity של נוגדנים או סרה polyclonal כרוך ראשי טבעי רוצח (NK) תאים שנקטפו מתורמים. האירוסין של FcγR והפעלה של השביל תאיים נקבעת בדרך כלל לפי הביטוי של הפעלת סמנים CD107a ו/או IFN-γ19,23,24,31. למרות וזמינותו קלאסית משתמשת רלוונטיים יותר תאים אפקטור כפי שהם יש לא היה מהונדסים גנטית, התורם וריאציה עקב הבדלים allelic FcγR עשוי להשפיע על הפעלת תאי NK והתוצאה בוריאציה אצווה כדי אצווה. מבחני חלופי המשמש כתחליף לפעילות ADCC לכלול אליסה מבוסס-דימר של FcγR או שחרור כרום הורג assay25. למרות השימוש של אליסה מבוסס-דימר FcγR הוא תפוקה גבוהה, וזמינותו ייתכן שלא יהיה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כמו assay הזה אינו משתמש אפקטור תאים32. בעוד האמצעים וזמינותו של שחרור כרום ישיר ההרג, זה לא תפוקה גבוהה ודורש תאי NK העיקרי אשר שוב התורם התלויים33. אחת השיטות האחרונות מתארות את השימוש hybridomas T-cell מאתר stably לבטא chimeric FcγR-CD3ζ שרשרת מולקולות ואמצעי הפעלה באמצעות ההפרשה של il-2. וזמינותו תיאר דומה השיטה המתוארת כאן, שעושה שימוש של תא T ששונה פונדקאית עבור תא אפקטור לבטא יחיד הפעלת FcγR34. לחלופין, ניתן להשתמש קו תא (NK92.05-CD16) לבטא את FcγRIIIa וגם אפקטור התא קולטנים upregulation של אנטיגן degranulation ש-cd107a משמש סמן הפעלה. עם זאת, השימוש virions ויראלי פפטידים על חומרי ניקוי על הפרוטוקול האחרון יש לציין כמו חלבונים מצופה על משטחי הידרופוביות לא ייתכן תמיד לסכם את מבנה פיזיולוגי של אנטיגנים35.

השיטה המתוארת כאן היא וזמינותו תבנית 96-ובכן, גורם השימוש הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, מקורי הביע מטרות ויראלי, יכול להיות שונה עבור נוגדנים מאתר או אדם. התאים Jurkat מהונדסים יכול להישמר בתרבות, cryopreserved36. אך כעת התאים אפקטור אקספרס FcγR הפעלת אחד בלבד, יתרונותיו הרבים של באמצעות פרוטוקול זה המתוארים במחקר זה צריך להילקח בחשבון כאשר מדידת נוגדנים תלויי תאית אפקטור פונקציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

פרויקט זה יש כבר מומן בחלקו עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, מכוני הבריאות הלאומיים, מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של, תחת CEIRS חוזה P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells  ATCC CCL-185 Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells
HEK 293T cells ATCC CRL-3216 Human embryonic kidney cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies  11668019 Transfection reagent
1X Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-034
White tissue culture treated 96-well plate Corning, Inc.  3917 Assay plates
10X MEM Gibco 11430-030
Jurkat cell expressing murine FcgRIV Promega M1201 Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum
Jurkat cell expressing human FcgRIIIa Promega G7010 Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum
Jurkat cell expressing human FcgRIIa Promega G9901 Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum
Luminometer BioTek Synergy H1 Multi-Mode reader Luminescence plate reader
Bio-Glo Luciferase Assay System Promega G7940 Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate
Madin Darby canine kidney cells ATCC CCL-34 Canine kidney cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
  2. Throsby, M., et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PloS One. 3 (12), e3942 (2008).
  3. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  4. Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  5. Tan, G. S., et al. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
  6. Tan, G. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
  7. Friesen, R. H. E., et al. A common solution to group 2 influenza virus neutralization. PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).
  8. Dreyfus, C., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
  9. Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).
  10. Impagliazzo, A., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. , (2015).
  11. Nachbagauer, R., Krammer, F. Clinical Microbiology and Infection. Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).
  12. Krammer, F. Novel universal influenza virus vaccine approaches. Current opinion in virology. 17, 95 (2016).
  13. Steel, J., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
  14. Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
  15. Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice. J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).
  16. Hai, R., et al. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes. J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).
  17. Dunand, C. J. H., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
  18. Tan, G. S., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Path. 12 (4), e1005578 (2016).
  19. DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).
  20. DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).
  21. Potter, C. W., Oxford, J. S. Determinants of immunity to influenza infection in man. Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).
  22. Memoli, M. J., et al. Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model. mBio. 7 (2), e00417 (2016).
  23. Jegaskanda, S., et al. Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1. J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).
  24. Jegaskanda, S., et al. Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies. J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).
  25. Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus. Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).
  26. Srivastava, V., et al. Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus. J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).
  27. He, W., et al. Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus. PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).
  28. Leon, P. E., et al. Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact. PNAS. , 201613225 (2016).
  29. Benjamin, E., et al. A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head. J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).
  30. Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop. Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).
  31. He, W., et al. Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones. J Virol. 89 (7), 3610 (2015).
  32. Kristensen, A. B., et al. Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine. J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).
  33. Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes. J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).
  34. Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors. J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).
  35. de Vries, R. D., et al. Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection. Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).
  36. Cheng, Z., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).

Tags

אימונולוגיה גיליון 132
שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey, M. J., Broecker, F., Leon,More

Bailey, M. J., Broecker, F., Leon, P. E., Tan, G. S. A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies. J. Vis. Exp. (132), e56256, doi:10.3791/56256 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter