Summary
Les auteurs décrivent une méthode pour mesurer l’activation des fonctions effectrices Fc-médiée par les anticorps qui ciblent l’hémagglutinine du virus influenza. Ce test peut également être adapté afin d’évaluer la capacité des anticorps monoclonaux ou polyclonaux sérums ciblant d’autres glycoprotéines de surface virales à provoquer l’immunité induite par le Fc.
Abstract
Les anticorps jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire innée et adaptative contre des pathogènes viraux par le biais de leurs domaines de liaison de l’antigène et Fc-régions de couplage. Ici, nous décrivons comment mesurer l’activation du Fc fonctions effectrices par anticorps monoclonal ciblant l’hémagglutinine de virus de la grippe à l’aide d’une lignée de cellules Jurkat génétiquement modifiée exprimant une activation de type Fc 1-FcγR. à l’aide de cette méthode, la contribution des interactions spécifiques de Fc-FcγR conférés par immunoglobulines peut être déterminée à l’aide d’un test in vitro .
Introduction
L’immunité prévue par le vaccin contre la grippe saisonnière a traditionnellement été évaluée par l’hemagglutination inhibition (HI) test1, qui mesure la présence d’anticorps qui ciblent le site de liaison du récepteur de l’hémagglutinine. Ces anticorps HI-active peuvent conférer une immunité stérilisante, mais sont généralement étroites dans leur largeur de protection, en accordant l’immunité à seulement un peu select souches du virus grippal. L’isolement et la caractérisation d’anticorps monoclonaux largement qui reconnaissent l’hémagglutinine (HA) suggèrent que le développement d’un vaccin antigrippal universel est à portée de main2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. l’un des objectifs majeurs d’un vaccin antigrippal universel est d’induire une réponse anticorps forte vers les régions conservées de la grippe virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. globalement réactifs anticorps qui reconnaissent ces épitopes conservés, composé de neutralisants et non neutralisants anticorps17,18, auraient dû être divulgués d’exiger des interactions Fc-FcγR pour optimal protection in vivo et mettre en évidence la contribution de l’immunité à médiation Fc à l’immuno-réaction globale à l’influenza virus19,20.
Corrélats de protection sont essentiels dans l’évaluation de l’immunité aux infections. Ces mesures permettent des scientifiques et cliniciens estimer l’efficacité des vaccins, l’importance des données et la durée du traitement. Le seul corrélat établi de protection contre l’infection par le virus grippal est essai d’inhibition de l’hémagglutination. Un titre de 01:40 est associé à une réduction de 50 % du risque de maladie1,21 – et reflète la présence d’anticorps inhibant l’agglutination en ciblant le récepteur liaison site situé sur la tête globulaire de l’AP. Toutefois, il convient également de noter que les lymphocytes-T peuvent être un meilleur corrélat de protection contre l’infection par le virus de grippe chez les personnes âgées. Fait intéressant, un récent rapport suggère que l’inhibition de l’activité neuraminidase peut-être être un meilleur prédicteur de l’immunité grippe22. Heureusement, typique en vitro tests comme les tests d’inhibition de neutralisation ou de la neuraminidase peuvent mesurer les anticorps propres à tige ou neuraminidase HA. La plupart de ces dosages classiques en vitro , cependant, seulement prend en compte la fonction de la région de liaison de l’antigène de l’anticorps et ne mesure pas le rôle de la région Fc. En outre, la contribution des anticorps non neutralisants qui protègent via Fc récepteur engagement in vivo ne sont pas dépistés17,18. Afin de mesurer la protection conférée par les anticorps qui stimulent l’immunité à médiation Fc comme la cytotoxicité de cellule dépendante médiée par anticorps (ADCC), il faut un dosage fiable in vitro .
La méthode décrite ci-dessous évalue la capacité des anticorps monoclonaux murins pour induire des fonctions Fc-négociée par l’utilisation d’une lignée de cellules Jurkat transgénique exprimant une activation murin tapez 1 FcR, FcγRIV. Engagement d’anticorps de la FcγR transduit signalisation intracellulaire ce facteur nucléaire de déclencheurs de l’activité de la luciférase de médiée par les T-cellules activées. Le test a plusieurs avantages par rapport aux techniques traditionnelles qui nécessitent l’isolement et de culture de cellules effectrices primaires et de l’utilisation de la cytométrie pour détecter l’activation induite par le Fc effecteur fonctions19,23,24 ,25,26. Tout d’abord, le protocole décrit ici peut être facilement adapté pour intégrer les différentes cibles virales, FcγRs et anticorps provenant de différentes espèces (humains et murins). Deuxièmement, l’utilisation d’une cellule modifiée de Jurkat ligne exprimant un FcγR avec un gène de rapporteur luciférase sous un facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) permet un dosage de grand format qui peut être facilement analysé à l’aide d’un lecteur de luminescence de mesure. Ici, la traditionnelle activation des cellules effectrices primaires est remplacée par l’induction de la luciférase-NFAT sur engagement des anticorps d’un FcγR sur la surface de la cellule Jurkat. Ce dosage de format de plaque à 96 puits permet la mesure de jusqu'à quatre différents échantillons en géométrie avec sept dilutions – un nombre d’échantillons pouvant être encombrant selon les techniques traditionnelles. Il y a des points supplémentaires à considérer pour cette analyse qui peut-être affecter la conception d’expériences et l’interprétation des données. La cible virale doit être exprimée à la surface cellulaire afin que la reconnaissance d’anticorps. Pour atténuer ce, l’antigène cible (par exemple une protéine virale interne) peut-être être directement enduit sur la surface d’une plaque. Toutefois, cela n’a pas encore été rigoureusement testé. En outre, la lignée Jurkat modifiée exprime qu’un seul type d’activation FcγR et n’exprime aucune inhibition FcγRs, tandis que les lignées cellulaires primaires expriment tous les récepteurs dans un contexte physiologique.
Nous avons déjà utilisé ce test pour démontrer que l’épitope spécificité dans un contexte polyclonaux joue un rôle crucial dans la régulation des fonctions effectrices induite par le Fc et que l’activation optimale de la réponse à médiation cellulaire dépendante des anticorps requiert deux points de Contacter le27,28. Nous décrivons ici une méthode qui évalue la capacité des anticorps monoclonaux spécifiques à tige d’engager et d’activer le murin activation FcγRIV. Bien qu’il y a des exceptions29,30, un grand nombre d’anticorps largement cible la région de tige sur le plan antigénique conservée de l’hémagglutinine et joue ainsi un rôle important dans le développement d’une grippe universelle vaccin.
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Protocol
Les expériences réalisées dans ce manuscrit ont été faites code institutionnel suivant Icahn School of Medicine de l’éthique et des règlements.
1. expression de l’hémagglutinine Virus Influenza par Transfection ou Infection
Transfection :
- Cellules humaines embryonnaires de rein (HEK 293 t) plaque à une densité de 2 x 104 cellules/puits dans une culture de tissus blanche traitement plaque 96 puits et laisser reposer pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C (avec 5 % de CO2).
- Transfecter cellules avec 100 ng d’ADN codant pour l’hémagglutinine virale et 0.2 μl de réactif de transfection par puits dans un volume total de 50 μL.
NOTE : Les plasmide et transfectant réactif sont dilués dans 1 x moyen de sérum réduit Opti-Minimum essentiel médiatique (MEM). - Après incubation des plaques dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 18 heures, retirez le support de la transfection.
2. infection
- Des cellules de rein canin plaque A549 ou Madin Darby à une densité de 2 x 104 cellules/puits dans une culture de tissu blanche traitement plaque 96 puits et croître pendant au moins 18 h dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Virus dilué dans 1 x MEM et infecter des cellules à une multiplicité d’infection de 0,33 dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2pendant 1 heure, 1 ou 3. Volume total doit être égal à 100 μL.
Remarque : 10 x MEM est dilué avec de l’eau pour faire un 1 x stock travail MEM pour la dilution des virus mentionnée ci-dessus. - Après l’infection, enlever l’inoculum et ajouter 100 μL de 1 x MEM dans la plaque en l’absence de la trypsine.
- La croissance des cellules infectées pendant 18 à 24 heures dans une étuve à 37 °C avec 5 % de CO2.
3. Evaluer l’Activation FcRg/NFAT-négociée de l’activité de la luciférase par anticorps monoclonaux ou sérums
- Tout d’abord, remplacer les milieux de culture des cellules transfectées ou infectés par 25 µL de médias de dosage (1 x RPMI 1640 additionné de 4 % (vol/vol) faible IgG fœtale bovine sérums).
- Dans une plaque à 96 puits distincte, effectuer des dilutions en quatre volets des anticorps d’intérêt à partir de 30 μg/mL à partir du support d’essai. Effectuer des dilutions en géométrie et un schéma exemple est illustré dans la Figure 1 a. Assurez-vous d’inclure un contrôle qui exclut les anticorps (aucun contrôle de l’anticorps) ainsi qu’un contrôle de fond (tampon seul).
Remarque : pour les deux le « aucun anticorps » et contrôles de fond, ajouter 25 µL de tampon au lieu d’anticorps. - Transférer 25 μL des anticorps en série dilués d’étape 3.2 aux puits correspondants sur la plaque de cellules transfectées ou les cellules infectées.
- Incuber les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant 15 min (avec 5 % de CO2).
- Ajouter 25 μL de la cellule de Jurkat effecteur mis à jour l’approprié exprimant FcgRIV murine ou humaine FcgRIIIa (75 000 cellules/puits). Volume total pour chaque bien doit être de 75 µL et la concentration finale de départ de l’anticorps est à 10 µg/mL (Figure 1 b).
Remarque : Pour le contrôle de fond, ajouter 25 µL de tampon au lieu de cellules effectrices. Pour examiner la phagocytose de médiation cellulaire dépendante des anticorps, une cellule modifiée de Jurkat exprimant la FcgRIIa humaine peut être utilisée. - Incuber les plaques dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2 pendant 6 h.
- Dégel et tampon de substrat de luciférase chaud dans une eau de 37 °C pendant environ 1 h avant utilisation.
Remarque : Pour rendre la mémoire tampon de substrat luciférase, reconstituer substrat test luciférase lyophilisée dans du tampon fourni. Le tampon de substrat reconstitué peut être stocké à-30 °C à-10 °C jusqu'à six semaines. - Ajouter 75 μL/puits de tampon de substrat de luciférase à tous les puits sauf le contrôle arrière-plan.
- Lire sur un luminomètre.
- Calculer l’induction de pli par l’équation suivante : plier induction = (valeur de la valeur-Background Induced) / (aucune valeur de valeur-fond mAb).
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Representative Results
Nous avons démontré qu’une tige spécifique mAb, 6F12, mais pas de tête spécifique une tête spécifique mAb, PY102, a été capable d’activer les cellules tueuses naturelles primaires par ses CD107a et l’interféron γ19. Pour modéliser la capacité d’un anticorps spécifique au pédoncule à activer des cellules humaines primaires de NK, nous montrons qu’une tige spécifique mAb, 6F12, peut activer robuste la cellule Jurkat modifiée exprimant le murin FcγRIV par ~ 14 fois. En revanche, le mAb tête spécifique, PY102 et le contrôle d’IgG ne pas (Figure 2)28.
Afin de vérifier si la multiplicité d’infection (MOI) peut influer sur l’induction des cellules Jurkat exprimant le FcγRIV murin, nous avons infecté des cellules de MDCK avec X31 (un grippe A virus réassorti exprimant l’hémagglutinine et la neuraminidase de Hong Kong/1/68 de la Commission (H3N2) virus avec les segments internes de la Rico/8/34 A/Puerto (H1N1)) avec un MOI de 3, 1, soit 0,33. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules Jurkat exprimant murin FcγRIV et mAb 9H 10 ont été ajoutés vers les cellules MDCK infectées. Dans la Figure 3, nous montrent que les cellules infectées par un MOI de 3 peuvent induire la luminescence environ 3 fois plus élevée que les cellules MDCK infectés avec un MOI de 0,33.
Figure 1 : Une représentation schématique d’un schéma de plaque prédéterminé et la composition des groupes expérimentaux. (A) la concentration initiale pour chaque échantillon d’anticorps est à 10 µg/mL et dilués en série dans l’ensemble de la plaque (colonne 1 colonne 12) 4 fois. Chaque échantillon est fait en géométrie. Ligne G est réservé à aucun contrôle mAb et ligne H est fond. Le volume Final (B) pour chaque groupe expérimental avant l’addition de tampon de substrat de luciférase est 75 µL. À noter, l’échantillon et « pas de groupes de mAb » ont 25 µL de cellules effectrices ajoutée, tandis que les groupes de contrôle de fond ont 75 µL de médias de dosage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Induction de mis à jour le Jurkat cellules exprimant FcgR par un anticorps monoclonal tige. Les cellules A549 ont été infectés avec A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) avec un MOI de 3. 24 heures après l’infection, murines exprimant le FcγRIV Jurkat cellules en association avec PY102, 6F12 ou un contrôle IgG ont été ajoutés. Induction des cellules Jurkat ont été évaluées par luminescence signal généré par la luciférase firefly sous l’élément de réponse NFAT. Barres d’erreur = écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La multiplicité des infection affecte l’induction d’un anticorps spécifique au pédoncule. Des cellules de MDCK abritaient des X31 (H3N2) avec un MOI de 3, 1, soit 0,33. Après 24 h après l’infection, les cellules Jurkat FcgR exprimant en combinaison avec 9H 10 (départ de dilution de 10 µg/mL) ajoutés. Induction des cellules Jurkat ont été évaluées par luminescence signal généré par la luciférase firefly sous l’élément de réponse NFAT. Barres d’erreur = écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode décrite ici permet de mesurer la capacité d’un anticorps monoclonal spécifique HA de pratiquer la FcγRIV murin. L’antigène cible, hémagglutinine de virus de la grippe, est exprimée à la surface des cellules après l’infection par le virus ou la transfection d’ADN plasmidique. L’essai est plus favorable à l’utilisation de différentes protéines virales exprimées à la surface en combinaison avec d’autres FcγRs (humains ou murin). En outre, nous avons utilisé des échantillons de sérums pour évaluer la capacité des anticorps dans un contexte polyclonaux pour induire des fonctions effectrices de Fc (données non présentées), qui peuvent offrir une information plus pertinente pour étudier la réponse immunitaire adaptative induite par l’infection ou vaccination. En outre, nous croyons que le dosage peut être modifié afin de mesurer l’induction d’anticorps qui reconnaissent des protéines virales internes en enduisant directement les plaques avec une protéine soluble. Cependant, cette méthodologie n’a pas été rigoureusement testée.
Induction des fonctions effectrices dépendante des anticorps peut être affectée par plusieurs facteurs, y compris mais non limitée à l’effecteur ratio cible (nombre de cellules d’effecteurs ajouté / puits), la concentration d’anticorps utilisé, la durée d’incubation entre cellules effectrices et cible et la concentration d’IgG sérique utilisé dans le tampon.
Historiquement, le test standard pour mesurer l’activité de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps d’anticorps polyclonaux de sérums ou implique natural killer (NK) des cellules primaires récoltées auprès de donateurs. Engagement de FcγR et activation de la voie intracellulaire sont normalement déterminées par l’expression des marqueurs d’activation CD107a et/ou IFN-γ19,23,24,31. Bien que le test classique utilise les cellules effectrices plus pertinents qu’ils n’ont pas été génétiquement modifiées, variation du donneur en raison des différences alléliques le FcγR peut affecter l’activation des cellules NK et entraîner variation de lots. Des essais alternatifs utilisés comme substituts pour activité ADCC comprennent une FcγR axée sur les dimères ELISA ou une version de chrome tuant dosage25. Bien que l’utilisation d’une FcγR axée sur les dimères ELISA est un débit élevé, l’essai ne soient pas physiologiquement pertinent, comme ce test n’utilise pas de cellules effectrices32. Tandis que les mesures de test chrome sortie directement mise à mort, il n’est pas un débit élevé et nécessite des cellules NK primaires qui sont encore dépendants de donateurs33. Une méthode récente décrivent l’utilisation des hybridomes de lymphocytes murins exprimant de manière stable chimérique FcγR-CD3ζ chaîne des molécules et des mesures d’activation par le biais de la sécrétion d’il-2. L’essai décrit est similaire à la méthode décrite ici, qui se sert d’une T-cellule modifiée comme substitut pour une cellule effectrice exprimant un singulier activation FcγR34. Alternativement, une lignée de cellules exprimant le FcγRIIIa (NK92.05-CD16) peut être utilisée comme les cellules effectrices et la stimulation de l’expression de l’antigène de dégranulation que cd107a est utilisé comme un marqueur de l’activation. Cependant, l’utilisation de virions et peptides virus sur plaques ELISA sur le protocole de ce dernier est à noter que protéines adsorbés sur des surfaces hydrophobes peuvent récapituler pas toujours la structure physiologique des antigènes35.
La méthode décrite ici est un dosage de format 96 puits, fait utilise de physiologiquement pertinents et exprimées en mode natif cibles virales et peut être modifiés pour les anticorps murins ou humaines. Les cellules Jurkat génétiquement modifiés peuvent être maintenues en culture et cryoconservés36. Bien qu’actuellement les cellules effectrices expriment seul FcγR activant, les nombreux avantages de l’utilisation de ce protocole décrit dans cette étude devraient prendre en considération pour lors de la mesure fonction effectrice de médiation cellulaire dépendante des anticorps.
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Disclosures
Auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Ce projet a été financé en partie avec des fonds fédéraux depuis le National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sous CEIRS contrat P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
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