Summary
インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンを対象とする抗体による Fc を介したエフェクターの機能の活性化を測定する手法を提案します。この試金は、Fc 免疫を誘導するモノクローナル抗体やポリクローナル血清の他のウイルスの表面糖蛋白質をターゲットの能力を評価するために合わせることができます。
Abstract
抗体は結合の抗原結合ドメインと Fc 領域を介してウイルスの病原体に対する自然免疫と適応免疫応答に重要な役割を再生します。ここでは、活性化を測定する方法について述べる Fc のモノクローナル抗体、活性化を表現する遺伝子組み換え Jurkat 細胞株を用いるインフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンをターゲットによるエフェクター機能入力 1 Fc-FcγR このメソッドを使用して、。免疫グロブリンによって与えられた特定の Fc FcγR 相互作用の寄与は、生体外の試金を使用して決定できます。
Introduction
季節性インフルエンザ ワクチンによる免疫が伝統的赤血球凝集抑制 (HI) 試験1ヘマグルチニンの受容体結合部位を対象とする抗体の存在を測定するによって評価されました。これらアクティブ HI 抗体殺菌免疫を与えることができるが、一般に選択数株のインフルエンザ ウイルスのみに耐性を提供する保護の彼らの幅狭い。分離とヘマグルチニン (HA) を認識するモノクローナル抗体が広く反応の万能インフルエンザ ワクチンの開発に、届く2,3,4,を提案します。5,6,7,8. インフルエンザ ウイルス9,10、11,12の保存領域に向かって強い抗体応答を誘導する万能インフルエンザ ワクチンの主要な目的の 1 つです,13,14,15,16. 広く中和と非中和抗体17,18, から成り、これらの保存されたエピトープを認識反応性抗体が Fc FcγR 相互作用を要求する示されている最適な生体内で保護しインフルエンザ ウイルス19,20全体的な免疫応答に Fc 免疫の貢献をハイライトします。
保護の相関は感染への耐性を評価する上で重要であります。これらのメトリックは、ワクチンの有効性、データの意義と治療の過程を推定するためには、科学者や臨床医に許可します。インフルエンザ ウイルス感染症に対する保護の唯一の確立された相関は赤血球凝集抑制法です。1:40 の力価は病気1,21 -のリスクが 50% 削減に関連付けられて、結合部位 HA の球状の頭の上にある受容体をターゲットによって凝集を阻害する抗体の存在を反映します。しかし、T 細胞応答を高齢者におけるインフルエンザ ウイルス感染に対する保護のより良く関連付けることに注意もする必要があります。興味深いことに、最近の報告書では、ノイラミニダーゼ阻害作用をインフルエンザ22への耐性をより良く予測される示唆しています。幸いにも、一般的な体外中和やノイラミニダーゼ阻害アッセイは、HA 茎やノイラミニダーゼ特異的抗体を測定できるよう試金します。しかし、これら従来の in vitroアッセイのほとんどは、のみ、抗体の抗原結合の領域の機能を考慮、Fc 領域の役割を測定しません。さらに、Fc 受容体の関与体内を介して保護非中和抗体の貢献は検出された17,18ではありません。抗体依存細胞性細胞傷害 (ADCC) など Fc 免疫を誘導する抗体によって与えられる保護を測定するために堅牢なの in vitroアッセイが必要です。
下記の方法は、活性化を表現する遺伝子組み換え Jurkat 細胞ラインを使用して Fc 仲介機能を誘発するモノクローナル抗体の作製の能力を評価するマウス入力 1 FcR、FcγRIV。FcγR の抗体の関与は、細胞内シグナル伝達活性化 T 細胞を介したルシフェラーゼ活性のあるそのトリガーの核因子ペリプラズムします。アッセイ分離と主なエフェクター細胞の培養と Fc を介したエフェクター機能19,23,24 の活性化を検出するためのフローサイトメトリーの使用を必要とする従来の技法上のいくつかの利点があります。 ,25,26。最初に、ここで説明されているプロトコルは簡単にウイルスの異なるターゲット、FcγRs、および異なる種 (人間およびマウス) から抗体を組み込むに適応できます。第二に、変更された Jurkat 細胞の使用ラインによる発光測定プレート リーダーを使用して容易に分析することができます大規模な形式の試金のため核因子活性化 T 細胞 (NFAT) の下で、ルシフェラーゼ遺伝子を持つ FcγR により表現します。ここでは、主なエフェクター細胞の伝統的な活性化は、Jurkat 細胞の表面に FcγR の抗体婚約時 NFAT ルシフェラーゼの誘導に置き換えられます。この 96 ウェル プレート形式の試金 7 希釈-伝統的な技術を使用して面倒なことができるサンプル数でトリプリケートで最大 4 つの異なる試料の測定が可能です。実験の設計、データの解釈に影響を与える可能性がありますこのアッセイで考慮する点があります。ウイルスのターゲットは、抗体の認識のための順序で細胞表層に発現する必要があります。これを緩和するには、ターゲット抗原 (例えば内部のウイルス蛋白質) は、プレートの表面に直接コーティングがあります。しかし、これはまだテストされていません厳密。また、変更された Jurkat 細胞株 FcγR を活性化の 1 種類のみを表現、主細胞生理学的なコンテキストですべての受容体に表現の抑制の FcγRs を表現していません。
我々 は以前ポリクローナル コンテキストのエピトープ特異性が Fc を介したエフェクターの機能の調節に重要な役割を果たしていること、抗体依存性細胞媒介性応答の最適な活性化がの 2 つの点を必要とすることを示すためこの試金を使用しています。27,28にお問い合わせください。ここでは、従事し FcγRIV をアクティブにするマウスを有効に茎特異的モノクローナル抗体の能力を評価する手法について述べる。例外29,30が広く反応性抗体の数が多いヘマグルチニンの抗原に保存された茎地域をターゲットし、従って普遍的なインフルエンザの発展に重要な役割を果たすワクチン。
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Protocol
本稿では前もって形成された実験は次 Icahn の医学の倫理と法規制の機関コードを行われました。
1. トランスフェクションや感染によるインフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンの式
トランスフェクション:
- 2 x 10 の4細胞/ウェルの白い組織培養の密度で人間の萌芽期の腎臓 (HEK 293 t) 細胞は、96 ウェル プレートを扱われ、4 h (5% CO2) と 37 °C の定温器に座らせています。
- 100 セルを transfect ウイルス血球凝集素とトランスフェクション試薬 50 μ L の総ボリュームの井戸あたりの 0.2 μ L の DNA のコーディングの ng。
注: 両方 Opti 最低不可欠なメディア (MEM) 減少血清中 × 1 でプラスミドと形質転換試薬が希釈されています。 - 18 h の 5% CO2と 37 °C のインキュベーターでプレートをインキュベート後トランスフェクション メディアを削除します。
2. 感染症
- 2 x 10 の4細胞/ウェルの白い組織培養の密度でプレート A549 またはマディン ダービーの犬の腎臓細胞は 96 ウェル プレートを扱われ、少なくとも 18 h 5% CO2と 37 °C の定温器のための成長します。
- 1 希薄ウイルス MEM × 3、1、または 5% CO2と 37 °C の定温器で 1 時間 0.33 の感染症の多様性で細胞に感染します。容量は 100 μ L に等しくなります。
注: 10 x MEM は上記ウイルスの希釈の MEM 在庫 × 1 を作るために水で希釈しました。 - 感染後接種を削除し、1 の 100 μ L を追加 MEM トリプシンの不在でプレートに x。
- 5% CO2と 37 °C の定温器で 18 に 24 h の感染細胞を成長します。
3. FcRg/NFAT を介した活性化モノクローナル抗体や血清によるルシフェラーゼ活性の評価
- まず、アッセイ メディア (1 x RPMI 1640 4% (巻/巻) を添加した低 IgG 胎仔ウシ血清) の 25 μ L でトランスフェクトまたは感染した細胞の成長媒体を交換してください。
- 別の 96 ウェル プレートで 30 μ g/mL アッセイのメディアを使用して始まる興味の抗体の 4 倍希釈液を実行します。トリプリケートで希釈を行い、プレート レイアウトの例は、図 1 aに示されています。バック グラウンド コントロール (アッセイバッファーだけ) だけでなく、抗体 (抗体コントロールなし) を含まないコントロールを含めるを確認します。
注: 両方、'ない抗体' のコントロールの背景、抗体ではなくアッセイバッファーの 25 μ L を追加。 - ステップ 3.2 から transfected セルまたは感染細胞プレート上の対応する井戸に希釈した抗体の 25 μ L を転送します。
- プレート 15 分 (5% CO2) と 37 °C のインキュベーターで孵化させなさい。
- マウスの FcgRIV または人間 FcgRIIIa (細胞/ウェルの 75,000) を表現する適切な変更されたエフェクター Jurkat 細胞の 25 μ L を追加します。それぞれの総体積はまあ必要があります 75 μ L と抗体の開始の最終濃度は 10 μ G/ml (図 1 b)。
注: バック グラウンド コントロール エフェクター細胞の代わりにアッセイバッファーの 25 μ L を追加します。抗体依存性細胞媒介性細胞貪食を考察し、人間の FcgRIIa を表現する変更された Jurkat 細胞を使用できます。 - プレート 6 時間 5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。
- 雪解けと暖かいルシフェラーゼ基質液を 37 °C の水のご使用前に約 1 時間で。
注: ルシフェラーゼ基板バッファーを作る提供するアッセイバッファー中凍結乾燥ルシフェラーゼ アッセイ基板を再構築します。再構成された基板バッファーは、最大 6 週間までの-30 °C-10 °C に格納できます。 - バック グラウンド コントロールを除くすべての井戸に 75 μ L/ウェル ルシフェラーゼ基板バッファーを追加します。
- ルミノに読まれます。
- 次の方程式で倍誘導を計算: 誘導を折る = (誘導値バック グラウンド値)/(mAb 値バック グラウンド値なし)。
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Representative Results
実証した茎固有 mAb、6F12 がないヘッド固有の頭固有 mAb、PY102、骨折 CD107a とインターフェロン γ19主のナチュラル キラー細胞をアクティブにすることができた。茎固有 mAb、6F12、できます確実によってマウスの FcγRIV を表現する変更された Jurkat 細胞を活性化することを示すヒト NK 細胞を作動する茎特異抗体の機能をモデル化する 〜 14-fold。その一方で、ヘッド固有 mAb、PY102、コントロール IgG ありません (図 2)28を行います。
調べるため感染症 (MOI) の多様性はマウスの FcγRIV を発現する Jurkat 細胞の誘導に影響を与える場合、私たち感染 MDCK 細胞 X31 (リアソータント インフルエンザ A ウイルス ヘマグルチニンとノイラミニダーゼの年香港/1/68 (H3N2) を表現すると内部セグメントの A/Puerto リコ/8/34 (H1N1) ウイルス) 3、1、または 0.33 の慣性モーメントを持つ。24 時間後、マウスの FcγRIV と mAb Jurkat 細胞 9 H 10 感染 MDCK 細胞に追加されました。図 33 の MOI 感染細胞が 0.33 の MOI 感染 MDCK 細胞より約 3 倍の発光を引き起こすことができることを示す.
図 1: サンプル プレート レイアウトと実験群の構成の概略図。(A) 各抗体サンプルの開始濃度 10 μ G/ml では、シリアル プレート (列 1 から列 12) 間 4 倍希釈します。各サンプルは、トリプリケートで行われます。バック行 H ・ コントロールなしの mAb の行 G を予約します。(B) ホタルルシフェラーゼ基質液を添加する前に各実験群の最終巻は、75 μ L です。注記のうち、サンプルと「ない mAb グループの追加、バック グラウンド コントロール グループが 75 μ l 測定メディアのエフェクター細胞の 25 μ L があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 茎モノクローナル抗体による FcgR を表現する細胞変更 Jurkat の誘導します。A549 細胞で A/Puerto リコ/8/34 (H1N1) 3 の MOI で感染していた。24 時間で感染症、PY102、6F12 または IgG コントロールとの組み合わせでセルが追加されたマウスの FcγRIV 表現 Jurkat の記事します。NFAT 応答要素の下でホタルのルシフェラーゼによる発光信号 Jurkat 細胞の誘導を行った。誤差の標準偏差を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 感染症の多様性茎特異抗体の誘導に影響を与えます。MDCK 細胞は 3、1、または 0.33 の MOI で X31 (H3N2) に感染しました。24 h 追加 9 H 10 併用 (10 μ G/ml の開始希釈) FcgR 表現 Jurkat 細胞感染を掲示します。NFAT 応答要素の下でホタルのルシフェラーゼによる発光信号 Jurkat 細胞の誘導を行った。誤差の標準偏差を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明した方法では、マウス FcγRIV を従事する特定の HA 抗体の能力を測定することができます。ターゲット抗原、インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンは、細胞の表面に感染後ウイルスやプラスミド DNA トランスフェクションによって表されます。試金はさらに他の FcγRs (人間またはマウス) との組み合わせで異なる表面表現のウイルス蛋白質を使用してに従うです。さらに、我々 使用している血清サンプル Fc エフェクター機能 (データは示されていない) を誘発する抗体ポリクローナルのコンテキストでの能力を評価する感染による適応免疫応答を勉強するときより関連性の高い情報を提供する可能性がありますまたは予防接種。我々 はまた、可溶性タンパク質でプレートを直接コーティングすることにより内部のウイルス蛋白質を認識する抗体の誘導を測定するアッセイを変更できることを推測します。ただし、この方法論は厳しくテストされていません。
抗体依存性エフェクター分子として機能の誘導できますを含むいくつかの要因によって影響を受けるが目標比率をエフェクターに限らず (ウェルあたり追加エフェクター細胞数)、抗体の濃度を使用する間潜伏の長さエフェクターとターゲットのセル、およびアッセイ バッファーで使用される低 IgG 血清の濃度。
歴史的には、抗体やポリクローナル血清の抗体依存性細胞障害活性を測定する標準的な試金にはドナーから採取したプライマリ ナチュラル キラー (NK) 細胞が含まれます。FcγR の婚約と細胞内経路の活性化は、通常、活性化マーカー CD107a の発現や IFN-γ19,23,24,31によって決まります。古典的なアッセイは、遺伝的に設計されていないが、関連性の高いエフェクター細胞を使用して、ドナー、FcγR の対立遺伝子の違いによるバリエーションが NK 細胞の活性化に影響を与えるし、バッチ バリエーションであります。ADCC 活性の代理として使用される代替のアッセイでは、FcγR ダイマー ベース ELISA アッセイの25を殺すクロム リリースをご利用など。FcγR ダイマー ベース elisa 法の使用は高スループットが、アッセイしないかもしれないが、生理学的この試金でエフェクター細胞32を使用しません。クロム リリース試験対策の直接の殺害、それ高スループットではないと再びドナー依存33である NK 細胞が必要です。1 つの最近の方法は、IL-2 の分泌を通じてキメラ FcγR CD3ζ の鎖分子と対策アクティベーションを安定に発現するマウスの T 細胞ハイブリドーマの使用をについて説明します。説明アッセイは、単数形 FcγR34を活性化を表現するエフェクター細胞の代理として変更された T 細胞の使用になりますここでは、この方法に似ています。また、エフェクター細胞と CD107a は活性化のマーカーとして使用される脱顆粒反応抗原の発現として、FcγRIIIa を表現する細胞株 (NK92.05 CD16) を使用できます。ただし、タンパク質の疎水性表面上にコーティングが常に抗原35の生理学的な構造を要約しないとウイルス粒子とウイルス ペプチド ELISA プレート後者のプロトコル上での使用は注意してください。
ここで説明する方法は、96 ウェル フォーマット アッセイ、作る生理関連のウイルスのターゲットをネイティブ表現しマウスや人間の抗体のため変更することができます。遺伝子組み換え Jurkat 細胞は文化で維持することができますおよび36を凍結しました。現在エフェクター細胞は、1 つだけアクティブにする FcγR を表現は、この研究で説明されているプロトコルを使用して多くの利点が抗体依存性細胞媒介性エフェクター機能を測定するとき考慮に入れする必要があります。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、一部国立研究所のアレルギーと感染症から連邦政府の資金で賄われている、健康の国民の協会の保健社会福祉省、CEIRS の下で契約 P01AI097092 04S1 (P.E.L.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
References
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