Summary
항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.
Abstract
항 체 항 원 바인딩 도메인 Fc 영역을 통해 바이러스 성 병원 체에 대 한 타고 난 및 적응형 면역 응답 커플링에 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리가 활성화를 측정 하는 방법에 설명 Fc의 단일 클론 항 체는 활성화 표현 유전자 조작된 Jurkat 세포 라인의 사용으로 인플루엔자 바이러스 조류를 대상으로 하 여 이펙터 기능 입력 1 Fc-FcγR. 전송 시각:이 메서드를 사용 합니다 특정 Fc-FcγR 상호 작용 면역 글로불린에 의해 수 여의 생체 외에서 분석 결과 사용 하 여 확인할 수 있습니다.
Introduction
계절 독감 백신에서 제공 하는 면역은 전통적으로 hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과1, 대상으로 하는 조류의 수용 체 바인딩 사이트 항 체의 존재를 측정 하 여 평가 되었습니다. 이러한이 활성 항 체 살 균 면역을 부여 수 있습니다 하지만 일반적으로 인플루엔자 바이러스의 단지 선택 몇 가지 계통에 면역을 제공 하는 보호의 그들의 범위에서 좁은. 격리 및 조류 (HA)를 인식 하는 광범위 하 게 반응 단일 클론 항 체의 특성화 제안 범용 인플루엔자 백신의 개발은 도달 시간2,,34, 5 , 6 , 7 , 8. 인플루엔자 바이러스9,10,,1112 의 보존된 지역으로 강한 항 체 응답을 유도 하는 것은 보편적인 인플루엔자 백신의 주요 목표 중 하나 , 13 , 14 , 15 , 16. 이러한 보존된 epitopes, 중화 및 비 중화 항 체17,18의 인식 반응 항 체 Fc-FcγR 상호 작용에 대 한 요구를 광범위 하 게 표시 되었습니다 최적의 vivo에서 보호 하 고 하이라이트 Fc 중재 면역 인플루엔자 바이러스19,20전반적인 면역 응답에의 기여.
보호의 관계가 중요 한 감염에 면역을 평가에 있습니다. 이러한 통계 과학자와 임상 백신의 효능, 데이터의 의미와 치료 과정을 추정 하실 수 있습니다. 인플루엔자 바이러스 감염에 대 한 보호의 유일한 설립된 상관 hemagglutination 저해 분석 결과 이다. 1시 40분의 titer 질병1,21 -위험 50% 감소와 관련 이며 바인딩 사이트는 HA의 구형 머리에 있는 수용 체를 대상으로 교착을 억제 하는 항 체의 존재를 반영 한다. 그러나, 그것은 또한 주목 해야한다 T 세포 응답 노인에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대 한 보호의 더 나은 상관 있을 수 있습니다. 흥미롭게도, 최근 보고서 응집 저해 행위 면책 독감22의 더 나은 예언자를 있을 수 있습니다 제안 합니다. 다행히도, 일반적인 체 외에서 분석 실험 같은 중화 또는 응집 저해 분석 하 줄기 또는 응집 특정 항 체를 측정할 수 있습니다. 그러나 대부분 이러한 기존의 시험관에서 분석의,만 항 체의 항 원 바인딩 영역의 기능을 고려 하 고 Fc 영역의 역할을 측정 하지 않습니다. 또한, 비 중화 항 체 Fc 수용 체 참여에서 vivo에서 를 통해 보호 하는의 기여 감지17,18되지 않습니다. Fc 중재 면역 항 체 의존 세포 중재 세포 독성 (ADCC) 등을 유발 하는 항 체에 의해 여유 보호를 측정 하기 위하여 강력한 생체 외에서 시험이 필요 합니다.
아래 설명 하는 방법을 평가 수 murine 단일 클론 항 체의 Fc 중재 기능 활성화는 표현 유전자 변형된 Jurkat 세포 라인 사용 유도 murine 입력 1 FcR, FcγRIV. 항 체는 FcγR의 교전 세포내 신호 트리거 활성화 된 T 세포 중재 luciferase 활동의 핵 요인 transduces. 분석 결과 여러 장점이 격리 및 기본 효과 기 세포의 문화 및 cytometry Fc 중재 effector 기능19,23,24의 활성화를 감지를 사용 하 여 요구 하는 전통적인 기법 ,,2526. 첫째, 여기에 설명 된 프로토콜을 쉽게 통합 하는 다른 바이러스 성 대상, FcγRs, 및 다른 종 (인간과 murine)에서 항 체 적용할 수 있습니다. 둘째, 수정된 Jurkat 세포를 사용 하 여 표현 하는 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요인 아래 luciferase 취재 원 유전자와 FcγR 발광 측정 플레이트 리더를 사용 하 여 쉽게 분석할 수 있는 대형 분석 결과 대 한 수 선. 여기, 기본 효과 기 세포의 전통적인 활성화 Jurkat 세포의 표면에 FcγR의 항 체 참여 시 NFAT luciferase의 유도로 대체 됩니다. 이 96 잘 접시 형식 분석 결과 7 희석-성가신 전통적인 기술을 사용 하 여 될 수 있는 샘플 수와 triplicates에서 최대 4 개의 서로 다른 샘플의 측정에 대 한 수 있습니다. 이 분석 결과 실험의 설계 및 데이터의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다 고려해 야 할 추가 포인트가 있다. 바이러스 성 대상 항 체 인식에 세포 표면에 표현 해야 합니다. 이 줄이기 위해 대상 항 원 (예: 내부 바이러스 성 단백질)는 격판덮개의 표면에 직접 코팅 수 수 있습니다. 그러나, 이것은 아직 엄격 하 게 테스트 되지. 또한, 수정 된 Jurkat 세포 선 및 FcγR 활성화의 한 유형을 표현 1 차 셀 라인 표현 생리 적 맥락에서 모든 수용 체 어떤 금지 FcγRs을 표현 하지 않는다.
우리가 이전 polyclonal 컨텍스트에서 epitope 특이성 Fc 중재 effector 기능 조절에 중요 한 역할을 담당 하며 그 항 체-종속 셀 중재 응답의 최적 활성화의 두 가지 포인트를 설명 하기 위해이 분석 결과 사용 27,28문의. 여기, 우리가 참여 하 고 FcγRIV를 활성화 murine 활성화 줄기 특정 단일 클론 항 체의 능력을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 예외29,30비록 광범위 하 게 반응 항 체의 많은 수는 조류의 antigenically 보존된 스토킹 지역 대상 고 따라서 범용 인플루엔자의 개발에 중요 한 역 백신입니다.
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Protocol
이 원고에서 preformed 실험 윤리 및 규정의 다음 아이 칸의 학부의 기관 코드를 완료 했다.
1. 인플루엔자 바이러스 조류 Transfection 또는 감염의 표현
Transfection:
- 플레이트 인간 미 발달 신장 (HEK 293T) 셀 셀/잘 백색 조직 문화에서에서 2 x 104 의 밀도에서 96 잘 접시를 처리 하 고 (와 함께 5% CO2) 37 °C 배양 기에서 4 h 동안 앉아 보자.
- 100 셀 transfect DNA 바이러스 조류 및 50 μ의 전체 볼륨에 잘 당 transfection 시 약 0.2 μ에 대 한 코딩의 ng.
참고: 모두 Opti-최소 필수 미디어 (MEM) 감소 된 혈 청 매체 x 1에 플라스 미드 그리고 transfectant 시 약 희석 하. - 플레이트 18 h 5% CO2 와 37 °C 배양 기에서 배양 후 transfection 미디어를 제거 합니다.
2입니다. 감염
- 플레이트 A549 또는 Madin 다 비 개 신장 세포 세포/잘 백색 조직 문화에서에서 2 x 104 의 밀도에서 96 잘 접시를 처리 하 고 5% CO2와 37 °C 배양 기에 18 h 이상에 대 한 성장.
- 1에서 희석 바이러스 MEM x 3, 1, 또는 5% CO2와 37 °C 배양 기에서 1 h 0.33의 감염의 다양성에서 세포를 감염 하 고. 총 볼륨 100 μ 동일 해야 합니다.
참고: 10 x 메모리 위에서 언급 한 바이러스 희석에 대 한 메모리 작업 재고 x 1을 물으로 희석. - 감염 후는 inoculum을 제거 하 고 추가 1의 100 μ trypsin의 부재에서 접시에 MEM x.
- 5% CO2와 37 °C 배양 기에서 18 ~ 24 h에 대 한 감염 된 세포를 성장 한다.
3. FcRg/NFAT 중재 활성화 단일 클론 항 체 또는 세라 Luciferase 활동의 평가
- 첫째, 25 µ L 분석 결과 미디어 (1 x RPMI 1640 4% (vol/vol) 보충 낮은 IgG 태아 소 세라)의 transfected 또는 감염 된 세포의 성장 미디어를 바꿉니다.
- 별도 96 잘 접시에 분석 결과 미디어를 사용 하 여 30 μ g/mL에서 시작 하는 관심사의 항 체가의 4 배 희석을 수행 합니다. Triplicates에 희석을 수행 하 고 예제 플레이트 레이아웃은 그림 1A에 나타나. 배경 컨트롤 (혼자 분석 결과 버퍼) 뿐만 아니라 항 체 (항 체 제어)을 제외 하는 컨트롤을 포함 해야 합니다.
참고 사항: 모두 '아무 항 체'에 대 한 컨트롤 배경, 25 µ L 대신에 항 체 분석 결과 버퍼의 추가. - Transfected 세포 또는 감염 된 세포의 접시에 단계 3.2 해당 우물을 연속적으로 희석된 한 항 체의 25 μ 전송.
- 15 분 동안 (와 함께 5% CO2) 37 °C 배양 기에서 접시를 품 어.
- Murine FcgRIV 또는 인간 FcgRIIIa (셀/잘 75000) 표현 적절 한 수정된 이펙터 Jurkat 세포의 25 μ를 추가 합니다. 각각에 대 한 총 볼륨 잘 75 µ L 고 항 체의 시작 최종 농도 10 µ g/mL (그림 1B)에 이다.
참고: 배경 컨트롤에 대 한 분석 결과 버퍼 이펙터 셀 대신의 25 µ L 추가 합니다. 항 체 의존 세포 중재 먹어서 검사, 인간 FcgRIIa 표현 수정된 Jurkat 세포를 사용할 수 있습니다. - 플레이트 6 h 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 품 어.
- 해 동 하 고 사용 하기 전에 약 1 h는 37 °C 물에 따뜻한 luciferase 기판 버퍼.
참고: luciferase 기판 버퍼를 만들기 위해 제공 하는 분석 결과 버퍼에서 동결 건조 된 luciferase 분석 결과 기판 다시 구성. 재구성 된 기판 버퍼 최대 6 주 동안-30 °C ~-10 °C에 저장할 수 있습니다. - 배경 컨트롤을 제외한 모든 우물에 75 μ/우물 luciferase 기판 버퍼를 추가 합니다.
- 읽기는 루미 노에.
- 배 유도 다음 방정식으로 계산: 유도 배 = (유도 값-배경 값) / (mAb 값-배경 값 없음).
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Representative Results
우리는 시연 스토킹 전용 mAb, 6F12, 하지만 하지 머리 전용 머리 전용 mAb, PY102, upregulating CD107a 및 인터페론 γ19에 의해 기본 자연 킬러 세포를 활성화할 수 있었습니다. 모델링 기본 인간 NK 세포를 활성화 하는 스토킹 특정 항 체의 능력, 우리 스토킹 관련 mAb, 6F12, 튼튼하게 의해 murine FcγRIV 표현 수정된 Jurkat 세포를 활성화할 수 있습니다 보여 ~ 14-fold. 다른 한편으로, 머리 전용 mAb, PY102 및 제어 IgG (그림 2)28하지 않습니다.
X31 (reassortant 인플루엔자 바이러스는 조류와 응집의 A/Hong 홍콩/1/68 (H3N2)와 MDCK 세포 감염 우리 조사 감염 (MOI)의 다양성 murine FcγRIV 표현 Jurkat 세포의 유도 영향을 미칠 수 있습니다 하는 경우, 내부 세그먼트의 A/Puerto 토 리코/8/34 (H1N1) 바이러스)와 3, 1, 또는 0.33의 나. 24 시간 후, Jurkat 세포 murine FcγRIV 및 mAb 표현 9 H 10 추가 되었습니다 감염 된 MDCK 셀 게. 그림 3, 우리는 셀 3의 나 감염 약 3-fold MDCK 세포 감염 0.33의 나 보다 더 높은 발광을 일으킬 수 있는 표시 됩니다.
그림 1 : 샘플 접시 레이아웃 및 실험적인 그룹의 구성 회로도. (A) 각 항 체 샘플에 대 한 시작 농도 10 µ g/mL 이며 접시 (열 1 열 12)에 걸쳐 순차적으로 희석 하는 4-fold. 각 샘플 triplicates에서 이루어집니다. 행 G 없는 mAb 컨트롤에 대 한 예약 되 고 행 H는 배경. (B) 최종 볼륨 luciferase 기판 버퍼의 추가 하기 전에 각 실험 그룹 75 µ L입니다. 메모의 샘플 및 'mAb 그룹' 추가, 배경 제어 그룹 분석 결과 미디어의 75 µ L 동안 효과 기 세포의 25 µ L 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 수정 된 Jurkat의 유도 세포 줄기 단일 클론 항 체에 의해 표현 하는 FcgR. A549 세포와 A/Puerto 토 리코/8/34 (H1N1) 3의 나 감염 되었다. 24 시간에 게시물 감염, murine FcγRIV 표현 Jurkat 세포 PY102, 6F12 또는 IgG 제어와 함께 추가 되었습니다. Jurkat 세포의 유도 반딧불 luciferase NFAT 응답 요소 아래에 의해 생성 되는 발광 신호에 의해 평가 됐다. 오차 막대 = 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 감염의 다양성에 영향을 미치는 줄기 특정 항 체의 유도. MDCK 세포의 3, 1, 또는 0.33 나 X31 (H3N2)와 감염 되었습니다. 24 시간에 게시물 감염, 추가 함께 9 H 10 (10 µ g/mL의 시작 희석) FcgR 표현 Jurkat 세포. Jurkat 세포의 유도 반딧불 luciferase NFAT 응답 요소 아래에 의해 생성 되는 발광 신호에 의해 평가 됐다. 오차 막대 = 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 메서드를 사용 하면 murine FcγRIV 참여 하 특정 단일 클론 항 체의 능력을 측정 하 수 있습니다. 대상 항 인플루엔자 바이러스 조류 바이러스 또는 플라스 미드 DNA의 transfection 감염 후 세포의 표면에 표현 된다. 분석 결과 (인간 또는 murine) 다른 FcγRs와 함께에서 다른 표면 표현 바이러스 성 단백질을 사용 하 여 의무가 더 이다. 또한, 우리는 세라 샘플 사용 Fc effector 기능 (데이터 표시 되지 않음), 유도 컨텍스트를 polyclonal 항 체의 능력을 평가 하기 위해 감염에 의해 유도 된 적합 한 면역 반응 공부 때 보다 관련성이 높은 정보를 제공할 수 있습니다 또는 예방 접종입니다. 우리는 또한 직접 수용 성 단백질으로 플레이트를 코팅 하 여 내부 바이러스 성 단백질을 인식 하는 항 체의 유도 측정 하는 분석 결과 수정할 수 있습니다 추측 하고있다. 그러나,이 방법론은 엄격 하 게 테스트 되지.
유도의 항 체 의존 effector 기능 등 여러 가지 요인에 의해 영향 될 수 있지만 대상 비율 이펙터에 국한 되지 않음 (이펙터 셀 수 잘 당 추가), 항 체의 농도 사용, 사이 외피의 길이 이펙터 및 대상 셀, 그리고 분석 결과 버퍼에 사용 되는 낮은 IgG 혈 청의 농도.
역사적으로, 항 체 또는 polyclonal 세라의 항 체 의존 세포 세포 독성 활동을 측정 하는 표준 시험 포함 기본 자연적인 살인자 (NK) 세포 기증자에서 수확 됩니다. FcγR의 참여와 세포내 통로의 활성화는 일반적으로 활성화 마커 CD107a의 표현 및 IFN-γ19,23,,2431에 의해 결정 됩니다. 고전 분석 결과 사용 하지만 관련성이 효과 기 세포로 그들은 유전자 조작 하지가지고, 기증자 편차는 FcγR 유전자 차이로 인해 NK 세포 활성화에 영향을 미칠 하 고 배치 배치 변화 귀 착될 수 있습니다. ADCC 활동에 대 한 대리 모 알선으로 사용 하는 대체 분석 FcγR 이합체 기반 ELISA 또는 분석 결과25살인 크롬 릴리스 포함 됩니다. 비록 FcγR 이합체 기반 ELISA 사용 하 여 높은 처리량, 분석 결과 않을 수 있습니다 순수 관련이 분석 결과 이펙터 셀32를 사용 하지 않습니다. 크롬 방출 분석 결과 조치 직접 살인, 하는 동안 그것은 높은 처리량 하며 기본 NK 세포 다시 기증자 종속33. 1 최근 방법 murine T 세포 hybridomas 공상 FcγR CD3ζ 사슬 분자와 대책 활성화 일리노이-2의 분 비를 통해 안정적으로 표현를 사용 하 여를 설명 합니다. 분석 결과 설명 FcγR34을 활성화 하는 단 수를 표현 하는 이펙터 셀에 대 한 대리로 수정 된 T-세포의 사용 설명된 방법 여기와 비슷합니다. 또는, 이펙터 세포와 degranulation 항 CD107a 정품 인증 표식으로 사용의 upregulation 셀 라인 (NK92.05-CD16) 표현 하는 FcγRIIIa를 사용할 수 있습니다. 그러나, virions 및 후자 프로토콜에 ELISA 격판덮개에 바이러스 성 펩 티 드의 사용으로 소수 성 표면에 코팅 하는 단백질 항 원35의 생리 구조를 항상 정리 하지 않을 수 있습니다 주목 해야한다.
여기 설명 하는 방법을 96 잘 포맷 분석 결과, 게의 순수 관련 사용 하 고 기본적으로 바이러스 성 대상 표현과 murine 또는 인간 항 체에 대 한 수정할 수 있습니다. 유전자 변형된 Jurkat 세포 문화에 유지 될 수와36cryopreserved. 현재 효과 기 세포 하나만 활성화 FcγR 익스프레스, 비록 항 체 의존 세포 중재 effector 기능을 측정할 때이 연구에서 설명 하는이 프로토콜을 사용 하 여 많은 장점은 고려 사항으로가지고 한다.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 자금을 일부 알레르기 국립 연구소와 전염병에서 연방 자금, 건강의 국가 학회, 학과의 보건 및 인적 서비스, CEIRS 아래 계약 P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
References
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