Summary
Se describe un método para medir la activación de funciones efectoras Fc-mediada por anticuerpos dirigidos la hemaglutinina del virus de la gripe. Este análisis también pueden ser adaptado para evaluar la capacidad de inducir Inmunidad mediada por Fc de anticuerpos monoclonales o sueros policlonales dirigidos a otras glicoproteínas virales de superficie.
Abstract
Los anticuerpos desempeñan un papel crucial en las respuestas inmunes innatas y adaptativas frente a patógenos virales a través de sus dominios de unión a antígeno y las regiones Fc de acoplamiento. Aquí, describimos cómo medir la activación del Fc funciones efectoras de los anticuerpos monoclonales contra la hemaglutinina del virus de influenza con el uso de una línea de células de Jurkat transgénicos expresando una activación tipo 1 Fc-FcγR. utilizando este método, la contribución de interacciones Fc FcγR conferido por las inmunoglobulinas puede ser determinado mediante un ensayo en vitro .
Introduction
Inmunidad proporcionada por la vacuna contra la gripe estacional se ha valorado tradicionalmente por la hemaglutinación inhibición (HI) ensayo1, que mide la presencia de anticuerpos que atacan el sitio de unión del receptor de la hemaglutinina. Estos anticuerpos HI-active pueden conferir inmunidad esterilizante, pero son generalmente limitados en su alcance de protección, inmunidad a sólo seleccionar pocas las cepas de virus de la gripe. El aislamiento y la caracterización de ampliamente reactivos anticuerpos monoclonales que reconocen la hemaglutinina (HA) sugieren que el desarrollo de una vacuna antigripal universal está al alcance2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. uno de los objetivos principales de una vacuna universal de gripe es inducir una respuesta fuerte de anticuerpos hacia las regiones conservadas del virus de la influenza9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. ampliamente anticuerpos reactivos que reconocen estos epítopes conservados, compuesto de neutralizante y no neutralizar anticuerpos17,18, han demostrado que requieren interacciones FcγR Fc para óptima protección en vivo y a destacar la contribución de la inmunidad mediada por la Fc a la respuesta inmune a influenza virus19,20.
Correlatos de protección son cruciales para evaluar la inmunidad a la infección. Estas métricas permiten a los científicos y los clínicos estimar la eficacia de las vacunas, la importancia de los datos y el curso del tratamiento. El único correlato establecido de protección contra la infección por virus de la influenza es el ensayo de inhibición de hemaglutinación. Un título de 1:40 se asocia con una reducción del 50% en el riesgo de enfermedad1,21 – y refleja la presencia de anticuerpos que inhiben la aglutinación apuntando el receptor binding sitio ubicado en la cabeza globular de la HA. Sin embargo, también cabe señalar que las respuestas de células T pueden ser un mejor correlato de protección contra la infección por virus influenza en los ancianos. Curiosamente, un informe reciente sugiere que la actividad de inhibición de la neuraminidasa puede ser un mejor predictor de la inmunidad a la influenza22. Afortunadamente, típico en vitro ensayos tales como ensayos de inhibición de neutralización o neuraminidasa pueden medir HA tallo o neuraminidasa-anticuerpos específicos. La mayoría de estos ensayos convencionales en vitro , sin embargo, sólo tener en cuenta la función de la región de unión del antígeno del anticuerpo y no medir el papel de la región Fc. Además, el aporte de anticuerpos no neutralizantes que protegen a través de Fc receptor compromiso en vivo no son detectado17,18. Para medir la protección conferida por los anticuerpos que inducen inmunidad de Fc como citotoxicidad celular dependiente mediada por anticuerpos (ADCC), es necesario un análisis robusto en vitro .
El método se describe a continuación evalúa la capacidad de los anticuerpos monoclonales murinos para inducir funciones Fc-mediada a través de una línea de células de Jurkat transgénica expresando una activación murino tipo 1 FcR, FcγRIV. Participación de anticuerpo de la FcγR transmite señalización intracelular que desencadena nuclear el factor de actividad de luciferasa mediada por células T activadas. El ensayo tiene varias ventajas sobre las técnicas tradicionales que requieren aislamiento y cultivo de células efectoras primarias y el uso de citometría de flujo para detectar la activación de efectores Fc-mediada funciones19,23,24 ,25,26. En primer lugar, el protocolo descrito aquí puede ser fácilmente adaptado para incorporar objetivos virales diferentes, FcγRs y los anticuerpos de diferentes especies (humanas y murinas). En segundo lugar, el uso de un celular Jurkat modificado línea expresando un FcγR con un gen reportero de luciferasa bajo un factor nuclear de células T activadas (NFAT) permite un análisis de gran formato que pueden analizarse fácilmente usando un lector de placas de medición de luminiscencia. Aquí, se sustituye la tradicional activación de células efectoras primarias con la inducción de NFAT luciferasa sobre participación de anticuerpo de un FcγR en la superficie de las células de Jurkat. Este ensayo de placa de 96 pocillos formato permite la medición de hasta cuatro diversas muestras en triplicado con siete diluciones – un número de muestras que podrían ser incómodos usando técnicas tradicionales. Hay puntos adicionales a considerar en este ensayo que pueda afectar el diseño de experimentos y la interpretación de datos. El objetivo del viral debe expresarse en la superficie celular en orden para el reconocimiento de anticuerpos. Para mitigar esto, el antígeno de la blanco (e.g. una proteína viral interna) puede ser cubierto directamente en la superficie de una placa. Sin embargo, esto no ha todavía sido rigurosamente probado. Además, la línea de células de Jurkat modificada expresa sólo un tipo de activación FcγR y no expresa ningún FcγRs inhibitorio, mientras que líneas de células primarias expresan todos los receptores en un contexto fisiológico.
Anteriormente hemos utilizado este test para demostrar que la especificidad del epítopo en un contexto policlonal desempeña un papel crucial en la regulación de funciones efectoras mediadas por el Fc y que activación óptima de la respuesta mediada por células dependiente de anticuerpos requiere de dos puntos de Póngase en contacto con27,28. Aquí, describimos un método que evalúa la capacidad de los anticuerpos monoclonales específicos del tallo de participar y activar el murino activación FcγRIV. Aunque hay excepciones29,30, un gran número de anticuerpos ampliamente reactivos destino la región del tallo antigénicamente conservada de la hemaglutinina y así jugar un papel importante en el desarrollo de una influenza universal vacuna.
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Protocol
Los experimentos realizados en este manuscrito se realizaron código institucional siguientes Icahn escuela de medicina de ética y reglamentos.
1. expresión de la hemaglutinina del Virus de Influenza mediante transfección o infección
Transfección:
- Células de riñón embrionario humano (HEK 293T) de placa a una densidad de 2 x 104 células/pozo en un cultivo de tejido blanco trataron placa de 96 pocillos y dejaron reposar 4 horas en una incubadora de 37 °C (con 5% CO2).
- Transfectar las células con 100 ng de ADN que codifica para la hemaglutinina viral y 0.2 μL de reactivo de transfección por pozo en un volumen total de 50 μL.
Nota: Ambos plásmidos y transfectant reactivo se diluyen en 1 x medio de suero reducido Opti-mínimo esencial los medios de comunicación (MEM). - Después de incubar las placas en una incubadora de 37 °C con 5% CO2 para 18 h, quitar medios de transfección.
2. infección
- Células de riñón canino placa A549 o Madin Darby en una densidad de 2 x 104 células/pozo en una cultura blanca de tejido trataron placa de 96 pocillos y crecen durante al menos 18 h a 37 °C la incubadora con 5% CO2.
- Virus diluido en 1 x MEM e infectar las células en una multiplicidad de infección de 3, 1 o 0.33 por 1 h en una incubadora de 37 °C con 5% CO2. Volumen total debe ser igual a 100 μL.
Nota: 10 x MEM se diluye con agua para hacer un 1 x bolsa de trabajo de MEM para la dilución de virus mencionado. - Después de la infección, eliminar el inóculo y añadir 100 μL de 1 x MEM en la placa en ausencia de tripsina.
- Crecen las células infectadas durante 18 a 24 h en una incubadora de 37 °C con 5% CO2.
3. evaluación de la activación FcRg/NFAT-mediada de la actividad de luciferasa por anticuerpos monoclonales o sueros
- En primer lugar, sustituir medios de crecimiento de las células transfected o infectadas con 25 μl del medio de ensayo (1 x RPMI 1640 suplementado con 4% (vol/vol) baja IgG fetal bovina sueros).
- En una placa de 96 pocillos separada, realizar cuatro diluciones de los anticuerpos de interés a partir de 30 μg/mL usando los medios de ensayo. Realizar diluciones en triplicado y un diseño de placa de ejemplo se ilustra en la figura 1A. Asegúrese de incluir un control que excluye anticuerpo (no control del anticuerpo) así como un control de fondo (tampón de ensayo solamente).
Nota: para ambos el 'ningún anticuerpo' y los controles del fondo, añadir 25 μl de tampón de ensayo en lugar de anticuerpos. - Transferencia 25 μL de anticuerpos diluidos en serie del paso 3.2 en los pocillos correspondientes en la placa de células infectadas o células transfected.
- Incube la placa en una incubadora de 37 °C (con 5% CO2) durante 15 minutos.
- Añadir 25 μL de la célula de Jurkat efectoras modificado apropiado expresar FcgRIV murino o FcgRIIIa humano (75.000 de células/pocillo). Volumen total de cada bien debe ser 75 μl y la concentración final a partir de los anticuerpos es de 10 μg/mL (figura 1B).
Nota: Para el control del fondo, añadir 25 μl de tampón de ensayo en vez de células efectoras. Para examinar la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo, se puede utilizar un celular Jurkat modificado expresando FcgRIIa humana. - Incube la placa en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 durante 6 h.
- Deshielo y tampón de sustrato caliente luciferasa en un agua de 37 °C por aproximadamente 1 h antes de su uso.
Nota: Para hacer el tampón de sustrato de luciferasa, reconstituir el sustrato de ensayo de luciferasa liofilizada en tampon de ensayo proporcionado. El tampón de sustrato reconstituido puede almacenarse a-30 °C a-10 °C hasta por seis semanas. - Agregar 75 μL/pocillo de buffer de sustrato de luciferasa a excepción del control de fondo.
- Leer en un luminómetro.
- Calcular la inducción de la doblez con la siguiente ecuación: doble inducción = (valor de fondo valor inducido) / (ningún valor de fondo valor de mAb).
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Representative Results
Hemos demostrado que un tallo específico mAb, 6F12, pero no específicos de la cabeza un jefe específico mAb, PY102, fue capaz de activar células de asesino naturales primarias regular CD107a y el interferón γ19. Para modelar la capacidad de un anticuerpo específico de tallo para activar las células NK humanas primarias, mostramos que un tallo específico mAb, 6F12, robusta puede activar el celular Jurkat modificado expresando el FcγRIV murino por ~ 14-fold. Por otro lado, el mAb de cabeza específicos, PY102 y control IgG do no (figura 2)28.
Para investigar si la multiplicidad de infección (MOI) puede afectar la inducción de células de Jurkat expresando el FcγRIV murino, nos infectó las células MDCK con X31 (un recombinante virus de la gripe expresando la hemaglutinina y neuraminidasa de A/Hong Kong/1/68 (H3N2) virus con los segmentos internos de A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)) con un MOI 3 1 y 0,33. Veinticuatro horas más tarde, células de Jurkat expresando murino FcγRIV y mAb 9H 10 se agregaron a las células MDCK infectadas. En la figura 3, se muestra que las células infectadas con una MOI de 3 pueden inducir la luminiscencia alrededor 3-fold mayor que las células MDCK infectadas con una MOI de 0.33.
Figura 1 : Un esquema de un diseño de placa de muestra y composición de los grupos experimentales. (A) la concentración inicial de cada muestra de anticuerpos es de 10 μg/mL y diluido en serie a través de la placa (columna 1 columna 12) 4. Cada muestra se hace en triplicado. Fila G está reservada para el no control de mAb y fila H es fondo. Volumen Final (B) para cada grupo experimental antes de la adición de tampón de sustrato de luciferasa es 75 μl. De la nota, la muestra y 'no hay grupos de mAb' tienen 25 μl de células efectoras añadido, mientras que los grupos de control del fondo tienen 75 μl del medio de ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Inducción de Jurkat modificado células expresando un anticuerpo monoclonal de tallo FcgR. Las células A549 fueron infectadas con A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) con una MOI de 3. A las 24 horas post infección, murino Jurkat expresando FcγRIV células en combinación con PY102, 6F12 o un control de IgG fueron agregadas. Inducción de células Jurkat fueron evaluados por la señal de luminiscencia generada por luciferasa de la luciérnaga en el elemento de respuesta NFAT. Barras de error = desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : La multiplicidad de infección afecta la inducción de un anticuerpo específico de tallo. Células MDCK fueron infectadas con X31 (H3N2) con un MOI 3 1 y 0,33. A las 24 h post infección, células Jurkat FcgR-expresión en combinación con 9H 10 (dilución a partir de 10 μg/mL) añadidas. Inducción de células Jurkat fueron evaluados por la señal de luminiscencia generada por luciferasa de la luciérnaga en el elemento de respuesta NFAT. Barras de error = desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método aquí descrito permite al usuario medir la capacidad de un anticuerpo monoclonal de específicos HA de comprometerse FcγRIV murino. El antígeno Diana, hemaglutinina del virus de influenza, se expresa en la superficie de las células después de la infección por virus o transfección del plásmido ADN. El ensayo es más susceptible al uso de diferentes proteínas virales de superficie expresada en combinación con otros FcγRs (seres humanos o murino). Además, hemos utilizado muestras de sueros a evaluar la capacidad de los anticuerpos en un contexto policlonal para inducir funciones efectoras de Fc (datos no mostrados), que puede proporcionar la información más relevante al estudio de la respuesta inmune adaptativa inducida por infección o vacunación. Además, especulamos que el ensayo puede ser modificado para medir la inducción de anticuerpos que reconocen proteínas virales internas directamente cubriendo las placas con la proteína soluble. Sin embargo, esta metodología no ha sido rigurosamente probada.
Inducción de funciones efectoras dependientes de anticuerpos puede ser afectada por varios factores incluyendo pero no limitada al efector al cociente de la blanco (número de células efectores agregado por pozo), la concentración del anticuerpo utilizado, la duración de la incubación entre las células efectoras y de destino y la concentración de suero de IgG de baja en el tampón de ensayo.
Históricamente, el ensayo estándar para medir la actividad de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de sueros policlonales o de anticuerpos implica natural killer (NK) las células primarias de los donantes. Compromiso de FcγR y activación de la vía intracelular generalmente se determinan por la expresión de marcadores de activación CD107a o IFN-γ19,23,24,31. Aunque el clásico emplea células efectoras más relevantes que no han sido genéticamente diseñados, variación de donantes debido a las diferencias alélicas en el FcγR puede afectar la activación de las células NK y resultar en variación de lote a lote. Ensayos alternativos utilizados como sustitutos para la actividad ADCC incluyen un ELISA basado en dimer FcγR o una liberación de cromo matando ensayo25. Aunque el uso de un ELISA basado en dimer FcγR es alto rendimiento, el ensayo puede no ser fisiológicamente relevante como este ensayo no utiliza de las células efectoras32. Mientras que las medidas de ensayo de liberación de cromo dirigen matanza, no es alto rendimiento y requiere que las células NK primarias que otra vez son dependientes de donantes33. Uno de los métodos recientes describen el uso de murinos hibridomas de células T expresando estable quimérica FcγR CD3ζ cadena medidas y moléculas de activación a través de la secreción de IL-2. El ensayo descrito es similar al método descrito aquí, que hace uso de una célula T modificada como sustituto de una célula efectora expresando un singular activar FcγR34. Alternativamente, puede utilizarse una línea celular (NK92.05-CD16) expresando el FcγRIIIa como la célula efectora y upregulation del antígeno degranulación que cd107a se utiliza como un marcador de activación. Sin embargo, cabe señalar el uso de viriones y péptidos virales en las placas de ELISA en el protocolo de esta última como recubiertas sobre las superficies hidrofóbicas de las proteínas no siempre pueden recapitular la estructura fisiológica de antígenos35.
El método descrito aquí es un ensayo de formato de 96 pocillos, hace uso de fisiológicamente relevantes y forma nativa expresa objetivos virales y puede ser modificado para anticuerpos murinos y humanos. Las células de Jurkat genéticamente modificadas pueden ser mantenidas en la cultura y cryopreserved36. Aunque actualmente las células efectoras expresan FcγR activa sola, las ventajas de utilizar este protocolo que se describe en este estudio deben tomarse en consideración al medir la función efectora mediada por células dependiente de anticuerpos.
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Disclosures
Autores no declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas, institutos nacionales de salud, Departamento de salud y servicios humanos, bajo CEIRS contrato P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
References
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