Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/56258
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Laboratorio Nacional de Canalopatías, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

פרוטוקול לחקר הפחתת הרגישות וההתאוששות הרגישות של מנועי סרטן הסרטנים כפונקציה של הזמן האחראי מוצג.

Abstract

שיטה לחקר הפחתת רגישות והתאוששות של מנועי סרטן הנהרות מוצגת. ביצעת הקלטות חשמל תאיים של תאים תא קולט אור בתוך העיניים מבודדים באמצעות אלקטרודה רציפה בודדת ממותגת מתח-מהדק התצורה. עם סכין גילוח הצלחנו לפתוח את הקרנית. כדי לקבל גישה לרשתית העין לאחר מכן, הוספת אלקטרודה זכוכית דרך הפתח, וחדרה לתא כפי שדווח על ידי הקלטה של פוטנציאל שלילי. פוטנציאל הממברנה היה מהודק בפוטנציאל המנוחה של photoreceptor והדופק האור הוחל על הפעלת זרמים. בסופו של דבר, שני פרוטוקול פלאש האור הועסק כדי למדוד את הפחתת הרגישות וההתאוששות הנוכחית. האור הראשון מפעיל הבזק, לאחר תקופת השהיה, הזרם היוני התמרה, אשר לאחר שהגיע משרעת שיא לקראת מדינה בעלת הרגישות למדינה; ההבזק השני, המוחל במרווחי זמן משתנים, מעריך את מצב הכיוון של מוליכות האור המופעלת. כדי לאפיין את הזרם, שלושה פרמטרים נמדדו: 1) השהיה (הזמן שחלף בין מסירת פלאש קלה לבין הרגע שבו הנוכחי משיגה 10% מהערך המירבי שלו); 2) השיא הנוכחי; ו 3) הפחתת הרגישות קבוע זמן (קבוע זמן מעריכי של השלב ריקבון הנוכחי). כל הפרמטרים מושפעים מהפעימה הראשונה.

כדי לכמת התאוששות מהפחתת הרגישות, היחס p2/p1 היה מועסק לעומת הזמן בין פולסים. p1 היא הפיסגה העדכנית מעורר על ידי פולס האור הראשון, ו p2 הוא השיא הנוכחי מעורר על ידי הדופק השני. נתונים אלה הותאמו לסכום של פונקציות מעריכי. לבסוף, המידות האלה בוצעו כפונקציה של זמן מעגלי.

Introduction

כדי להיתפס כגירוי ויזואלי, האור המגיע לעיניים חייב להיות מחולק לאות חשמלי. מכאן, בכל האורגניזמים החזותיים, אור מפעיל יון התמרה-זרם, אשר בתורו מייצרת שינוי בפוטנציאל הממברנה של התאים תא קולט אור, הפוטנציאל הנקרא הקולטן. בשל כך, הרגישות הקלה של העין תלויה בעיקר במצב של מוליכות האור המופעלת, שיכולה להיות זמינה להפעלה או לחוסר הרגישות.

ב מנועי סרטן הנהרות, אור מעורר איטי, ארעי, זרם יוני1. עם התאורה, הזרימה הנוכחית מתעוררת לאחר השהיה או השהיה לפני שהגיעה למקסימום; לאחר מכן הוא decays כמו ערוצי התמרה ליפול למצב מתחת לחוסר הרגישות שבו הם אינם מגיבים לגירוי אור נוסף2. כלומר, אור, בנוסף להפעלה האחראית הנוכחית של חזון, משרה גם הפחתה ארעית של הרגישות של תאים תא קולט אור. הפחתת רגישות עשויה לייצג מנגנון הגנה כללי מפני חשיפה יתר לגירוי מספיק. הרגישות של העין לאור הוא התאושש כאשר מוליכות התמרה משחזרת מתוך הפחתת רגישות.

הקלטה תאיים היא טכניקה שימושית למדידת פעילות חשמלית של תאים להתרגש3,4,5,6,7,8. למרות הקלטה תאיים הפכה להיות פחות תכופים עם הופעתו של התיקון מהדק טכניקה9, זה עדיין גישה נוחה כאשר התאים הם קשים לבידוד, או להציג הגיאומטריה שהופך את היווצרות של התיקון-החותמות giga-אטמים קשה (כלומר, חותמות או קשר הדוק בין האלקטרודה תיקון ממברנות עם עמידות החשמל של הסדר של 109ohms). דוגמאות לאלה הן תאי זרע10 ותאים תא קולט אור כאן למדו. הניסיון שלנו, מאוד קשה לבודד ולשמור בתרבות הראשית; בנוסף, הם מוטות דקים הופכים giga-חותם היווצרות קשה להשיג. בהקלטות תאיים, אלקטרודה חדה מתקדמת לתא שנשמר במקום על ידי הרקמה הסובבת. האלקטרודה קצוצה על-ידי המעגלים העוברים במהירות גבוהה של המגבר, ולכן הזרם מנדגם בין פולסים במתח. מצב זה ידוע כתפס מקוטע של מתח יחיד באלקטרודה (מצב dSEVC)11. ההתנגדות הגבוהה (פתיחה קטנה) של האלקטרודה מעכבת את החילוף התפוצא בין התא לפתרונות הפיפטה, ומניב הפרעה מינימלית של הסביבה התאיים3. חיסרון פוטנציאלי של טכניקה זו היא כי החדרת אלקטרודה עשויה לייצר זרם דליפה לא סלקטיבי; לכן, יש לנקוט טיפול כדי למנוע הקלטה מתאים בהם גודל זרם הדליפה עלול להפריע למידות המיועדות4,12.

בזאת, אנו משתמשים בגבעולי סרטנים מבודדים כדי להעריך את הפחתת הרגישות וההתאוששות של מוליכות האור המופעל על ידי ביצוע הקלטות חשמל תאיים של תאים תא קולט אור באמצעות מהדק מתח התנאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הניסויים עומדים בחוק הגנת בעלי חיים של מקסיקו.

1. התקנה ניסויית

  1. קשרים כלליים
    1. חבר את המגבר למחשב מתאים באמצעות ממיר אנלוגי לדיגיטלי והשתמש באולוסקופ כדי לנטר את הניסוי (איור 1).
    2. חבר את מגירוי התמונה ל-A/D המומר.
  2. תא הקלטה
    1. מניחים את חדר ההקלטה על גבי שולחן אנטי-רטט ומאתרים אותו בתוך כלוב פאראדיי.
      הערה: הדבר מונע רטט מכני ורעש חשמלי העלולים להשפיע על ההקלטה. כלוב פאראדיי היה עשוי. מרשת תיל חשוכה בבית, 2 מ ל, חדר הקלטה אקרילי משמש (איור 2).
    2. להכין את הפתרון אמבטיה כדי לשמור על ההכנה בחיים13: 205 מ"מ; 5 מ"מ KCl; 2 מ"מ MgSO4; 13 מ"מ קאל2; .7.3 מילימטר.
      הערה: הפתרון אינו כולל דקסטרוז או כל מבעבע על ידי 95% O2, 5% CO2 תערובת כי ההליך הניסיוני הוא קצר מספיק כדי לזהות נזק על ידי ההקלטה החשמלית (ראה שלב 4.2.3 לשלמות).
  3. אלקטרודות
    1. השתמש באלקטרודה מצופה כלוריד בחוט כסף כאלקטרודה ההפניה
      הערה: ציפוי כסף כלוריד חיוני כדי לאפשר תגובת האלקטרודה: AgCl (s)+ e-↔ Ag (s) + Cl-.
    2. חול חוט כסף (עובי ~ 1 מ"מ, אורך ~ 10 ס מ) עם נייר כיתה בסדר משובח כדי לנקות את פני השטח שלה.
    3. שטפו את חוט הכסף במים מזוקקים.
    4. הישאב את החוט הכסוף הנקי בתמיסה של 4-6% נתרן היפוכלוריט ("נלאו") עד שיופיע כהה (כ-20 דקות).
    5. השתמש בפיפטות זכוכית דקות מלאות בתמיסת אלקטרוליט (2.7 M KCl) כאלקטרודה תאיים.
    6. משוך צינור נימי זכוכית (קוטר פנימי ≈ 1 מ"מ) עם פולר מיקרו-פיילט כדי לקבל טיפ דק עם פתח קטן (0.01-0.1 מטרים)14.
    7. ממלאים את הזכוכית הקפילר עם פתרון 2.7 M KCl. ראשית למלא אותו על ידי קפילריות (לטבול את העצה הצינורות לתוך הפתרון 2.7 M KCl) ולאחר מכן למלא את החצי של הפיפטה עם מחט הזרקה קנס. אם יש צורך, הקש על הצנרת אלקטרודה כדי לחסל בועות אוויר.
    8. חבר את האלקטרודות למחזיק בו. חבר את המחזיק לשלב הכותרת של המגבר עם המגבר. הצב את השלב עם מחזיק האלקטרודות במיקרומניפולציה תלת-ממדית יציבה. הנמך את האלקטרודה עד שפתרון האמבטיה יכסה את קצהו.
      הערה: על האלקטרודה להיות בעלת אוריינטציה אנכית
  4. בחר במצב גשר של המגבר (במקטע ' מצב ' של המגבר, לחץ על הלחצן Bridge) ומלא את התנגדות האלקטרודה. ודא כי ההתנגדות היא כ 50 MΩ11.
    הערה: גודל האלקטרודה הזה מאפשר הקלטה חשמלית באיכות טובה עם נזק מוגבל לתא.
  5. Null את ההיסט הנוכחי ופיצוי הטרנזיטים קיבולי באמצעות לחצן החזקת מיקום במקטע קלאמפ מתח של המגבר, ואת לחצן ניטרול קיבוליות במקטע מיקרואלקטרודה 1 של המגבר.
  6. מערכת סופרפיוז
    1. יוצקים את הפתרון לאמבטיה (שלב 1.2.2) לתוך כלי קיבול מתאים (בקבוק סרום מ250 mL) ולחבר אותו לערכת אבובים השקיה (3.2 מ"מ קוטר פנימי), ובכך חיבור תא ההקלטה. השתמש במערכת היתוך הכבידה מונחה. ויסות קצב הזרימה ל-~ 0.5 mL/s.
    2. . חברו את התא למכשיר יניקה ויסות מערכת השאיבה של התמיסה באופן כזה, הנפח הכולל של תא ההקלטה אינו משתנה. . תשתמש במשאבת ואקום לשאיבה
      הערה: כמות קבועה בחדר ההקלטה חשובה לשמור על יציבות מתמדת במהלך הניסוי.

2. חומר ביולוגי

הערה: השימוש המבוגר הדגים P. clarkii (7-10 ס מ ארוך) בשלב intermolt של סקס ברור.

  1. זמן מעגלי
    1. חודש לפני הניסויים, לשמור על 100 כלדגים תחת אור 12-h מחזור כהה 12-h15 (אור לבן, 2.4 kW/m2).
      הערה: חודש אחד מספיק זמן כדי לסנכרן את אוכלוסיית סרטני הסרטן.
    2. לקבוע את הזמן המעגלי של אוכלוסיית סרטני הסרטן על ידי הערכת משרעת של אלקטורנוגרמות של חמש בעלי חיים שנבחרו באופן אקראי15.
      הערה: הזמן של 0 h אחראי (CT 0) מציין את תחילתו של יום סובייקטיבי, כלומר, זמן שבמהלכו אורגניזם פעיל בדרך כלל16,17,18,19 (איור 3). סרטן הנהרות הוא חיה לילית, ולכן תחת מחזור כהה של 12 שעות או 12-h, הוא פעיל במהלך השלב האפל.
  2. נוהל בידוד
    1. בזמן המעגלי הרצוי, השקיעה במים מהברז ב-0-4 ° c, במשך 15 דקות.
    2. בעזרת מספריים דקים, נתק את העיניים מהבסיס.
    3. גישה הרשתית באמצעות להב תער כדי ליצור פתח (~ 1-mm2) בקרנית הגבי.
    4. מניחים את קנה העין במרכז חדר ההקלטה (החור המכוסה בסיליקון) עם הגישה הפותחת לרשתית בחלק העליון של החדר.
  3. שמרו על העיניים בחשיכה. מתמדת במשך 20 דקות
    הערה: 20 דקות מספיק זמן עבור התא תא קולט אור להיות כהה לחלוטין מותאם.

3. פוטורקטור בחלוקה

  1. הניחו את המיקרואלקטרודה ואת ציר האורך של העין במקביל באופן שהמיקרואלקטרודה ממורכזת לגישה לרשתית. השתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופי (10X) כדי למקם את ההתקנים בתצורה הנכונה.
  2. נטר את הפרש המתח בין אלקטרודות ההפניה וההקלטה על-ידי בחירת מצב Bridge11 של המגבר.
  3. הנמך את האלקטרודה לתוך האמבטיה ולאחר מכן למקם אותו ישר מעל הרשתית.
  4. הזיזו את המיקרוסקופ ומקמו את מנורת הפוטוגירוי במקביל לציר האורך של העין.
    הערה: המרחק בין המנורה לבין חדר הסופרפיוז הוא כ-15 ס מ.
  5. הנמך באיטיות את המיקרואלקטרודה עד שמתגלה ירידה פתאומית במתח.
    הערה: ירידה במתח של כ-50 mV מציינת את החלוקה של תא תא קולט אור בריא.
  6. לספק אור מבחן-פלאש (אור לבן, 7.2 kW/m2, 10 μs משך) כדי להקליט את הפוטנציאל הקולטן photorector.
    הערה: הפוטנציאל של קולטן photoreceptor הוא פוטנציאל הקיטוב של משרעת 10-15 mV ו 300 ms משך (איור 4).

4. הקלטה חשמלית

  1. ודא כי התאים תא קולט אור מותאמים לחלוטין לתנאים כהים (ראה שלב 2.3).
    1. העבר הבזק מבחן לאור כל 2 דקות. הפוך את הזמן בין הבזקים על-ידי בחירת ערך הולם (120 s) של "זמן בין פרקים" בתוכנה לרכישת נתונים.
      הערה: 2 דקות הוא הזמן הדרוש כדי לאפשר את ההתאוששות הכוללת של הזרמים המשמשים את תגובת החשמל של photoreceptor.
    2. לנטר את הפוטנציאל ממברנה המנוחה, כמו גם משרעת ומשך של פוטנציאל הקולטן. נניח כי תא קולט אור מותאם לחלוטין לאחר הפוטנציאל קרום, משרעת, ומשך הפוטנציאל הקולטן להישאר ללא שינוי. Eyestalks שמרו בעבר תחת חושך קבוע עבור 20 דקות (שלב 2.3) להשלים את ההסתגלות שלהם כ 5 דקות.
    3. הפסק לגרות את התא 2 דקות לפני הקלטת זרם מעורר האור.
  2. הקלטה נוכחית
    1. הדק את המתח על הערך הפוטנציאלי של הממברנה הנמדד של התא על-ידי בחירה באפשרות "החזקת משרעת" בתוכנת רכישת הנתונים (בצורת גל באזור ערוץ הפלט האנלוגי).
    2. בחר במצב dSEVC של המגבר. במקטע ' מצב ' של המגבר, בחר את לחצן SEVC והחלף את המנוף במיקום הפירוק.
    3. הגדר את קצב המעבר ל-500-1000 הרץ (באמצעות לחצן התאמת קצב של המגבר), כפי שנקבע לפי מהירות האלקטרודה11.
    4. העבר מבזק אור, והתבונן בזרם היונים המעורר.
      הערה: זהו זרם הנוצר באור או התמרה (איור 5).
    5. חזור למצב גשר על המגבר והקלט פוטנציאל קולטן על-ידי שליחת הבזק אור (ראה סעיף 3). ודא כי התא תא קולט אור מותאם לחלוטין לתנאים כהים. למדוד את המאפיינים הפוטנציאליים לקולטן (משרעת ומשך) ולהשוות עם המידות הראשונות. להניח כי התא תא קולט אור שופד הוא תא בריא אם יש להם את אותם מאפיינים.
      הערה: לאחר אבלציה העיניים, הכנה ביולוגית הוא בר קיימא במהלך 2 השעות הבאות.
  3. שני פרוטוקול פולס: למדוד את ההחלמה מפני הפחתת הרגישות עם שני פרוטוקול פלאש-light.
    הערה: שני הפרוטוקולים למבזק אור דומים לפרוטוקול המתח הסטנדרטי בעל שני הפעימות המשמש למדידת ההחלמה מפני הפעלה של ערוצים מגודרת במתח20. מבזק האור הראשון גורם לשינוי זמני ברגישות של התא תא קולט אור וההבזק השני מעריך את מצב מוליכות האור המופעל.
    1. . מסור זוג פולסים קלים החל את המבזק השני לאחר מרווח זמן רצוי (מ-300 ms עד 2 דקות).
    2. דיגיטייז את הזרמים בדגם של 10 KHz עם תוכנת רכישת הנתונים ושמרו את הנתונים לניתוח לא מקוון11.
      הערה: טבלה עם ערכי התצורה של התוכנה נכללת כחומר משלים.

5. ניתוח נתונים

  1. קינטיקה של זרם האור מעורר
    1. מדוד שלושה פרמטרים נוכחיים: השהיית הפעלה L, הזמן שחלף ממסירה הבזק האור עד שהזרם מגיע ל -10% מהשרעת המקסימלית (איור 5); משרעת הפסגה או המקסימלית הנוכחית Ip; והפחתת הרגישות מתמדת T. מדידה קבוע הפחתת הרגישות (Τ) על ידי התאמת שלב ריקבון הנוכחי כדי:
      Equation 1
      כאשר, A =-I (t = 0) הוא קבוע חיובי (איור 5).
  2. הפחתת רגישות והתאוששות
    הערה: שחזור מתוך הפחתת רגישות הוערך כיחס p2/p1, כאשר p1 הוא הפרמטר הרלוונטי (או L, Ip, או T) של הפקד הנוכחי, ו-p2 הוא הפרמטר המתאים של המבחן השני זרם.
    1. העלילה p2/p1 (או L, Ip, או T) כפונקציה של זמן בין פולסים.
    2. בהתאם לפרמטר, התאם את הנקודות של כל מזימה ל:
      Equation 2
      או ל:
      Equation 3
    3. השתמש בבדיקה סטטיסטית מתאימה כדי לקבוע את מספר המונחים המעריכית הדרושים להתאמת הנתונים הניסיוניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ראשון, פוטנציאל קולטן הנציג של התאים של סרטן הסרטנים תא קולט אור מתקבל (איור 4). לאחר מכן, הוחל הבזק מבחן על מנת להפעיל את זרם האור הנוכחי (איור 5). הזרימה הנוכחית מפעילה לאחר השהיה, ומגיעה למצב מקסימלי ולאחר מכן יורדת לאט לתוך המדינה הסופגת בצורה מאוד מרחיקת לכת שממנה היא מתאוששת באיטיות.

סביר להניח שההשהיה הארוכה L (עשרות אלפיות שניה) תלויה באירועים הביוכימיים המופעל על ידי אור, הכרוכים במסלולים של G-חלבון. משרעת השיא הנוכחי Ip תלוי בחלק של ערוצים זמינים להיפתח, ואת התעריפים היחסיים של ההפעלה הנוכחית הפעלה. האחרון מוערך על ידי מתמדת זמן ריקבון T.

לעומת זאת, השחזור של L צריך להיות קשור לקצב ההתאוששות של מפל הפוטוקציה הביוכימי; אניp התאוששות תלוי הן, על השינויים הפנימיים שינויים של החלבונים האחראים על מוליכות היון, ועל שיעור ההתאוששות של מפל הפוטוקציה הביוכימי. האחרון יכול גם להיות קשור התאוששות של T. יתרה מזאת, הווריאציה המקבילה של L ו-T מציעה שגורם ביוכימיים נפוץ (או גורמים; לדוגמה, מצב הזירחון של הערוץ) יכול להשפיע על שני הפרמטרים1.

פרוטוקול של שני הבזקים (איור 6) יושם לאחר מכן כדי לקבוע את הקינטיקה של ההתאוששות מהפחתת הרגישות (איור 7) ברגעים שונים במחזור האחראי (איור 8).

Figure 1
איור 1. דיאגרמת קו של כיוונון הציוד. חיבורים ביןמחשבאישי (PC) (A), ממשק (ב), אולוסקופ (C), מגבר מהדק מתח (D), מערכת פוטופלייר (E), והשלב הקדמי/בעל/מיקרואלקטרודה של התקנת ציוד (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. לשכת אכבדינג. (א) חדר ההקלטה בתוך כלוב פאראדיי עם הסופרפיוז-מערכת היניקה. הוא מראה גם את מיקומו של פוטופוטור, מיקרוסקופ, ו מיקרומניפולציה-הבמה-מערכת מיקרואלקטרודה. (ב) תרשים של תא ההקלטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. אלקטרואטינוגרמה (ERG) משרעת. (A) סרטני אקווריום. (ב) מגרש מייצג של משרעת erg של סרטן הנהרות (הנתונים נלקחו כל 20 דקות) כפונקציה של זמן אחראי. ניתן להעריך בבירור את קיומו של קצב מעגלי. שים לב כי עבור כל מחזור, התחלת הפעילות חופפת עם זמן מעגלי 0. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. . פוטנציאל לקולטן הפוטנציאל קולטן הנציג עורר על ידי פלאש אור (אור לבן, 7.2 kW/m2, 10 μs משך). דמות זו שונתה מ Barriga-ונטויה, C, ואח '. 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. התמרה זרם. מפעיל התמרה הנוכחי המופעל על ידי פלאש אור (אור לבן, 7.2 kW/m2, 10 μs משך) מוחל עם מתח המשיך קבוע ב תא קולט אור מנוחה פוטנציאל. השהיה נוכחית, משרעת שיא, ושלב הפחתת הרגישות מצוינים. דמות זו שונתה מ Barriga-ונטויה, C, ואח '. 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. . פרוטוקול שני פעימות הזרמים מושחר על ידי. זוג גלי אור גירוי קל הוחלו על 0 ms ו 700 ms (המסומנים על ידי חיצים). איור זה שונה מ- 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7. התאוששות מהפחתת רגישות. (א) אניp: שיא ההתאוששות הנוכחית, (ב) L: שחזור השהיה, (ג) T: הפחתת הרגישות לזמן שחזור T. . הניסויים בוצעו ב-0 שעות סי. טי דמות זו שונתה מ Barriga-ונטויה, C, ואח '. 2. תוצאות מבוטא כמו סטיית הממוצע ± סטנדרטי של מספר ניסויים (n = 11). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8. התאוששות מהפחתת הרגישות כפונקציה של CT. (א) אניp התאוששות, (ב) L התאוששות, (ג) התאוששות Т. (ד) קבועי זמן משוקללים. תהליכים ביפאיתיים מסומנים בחץ. דמות זו שונתה מ Barriga-ונטויה, C, ואח'. 2. תוצאות מבוטא כמו סטיית הממוצע ± סטנדרטי של מספר ניסויים (n = 11). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סרטני הנהרות הוכיחו כמודל מצוין בשל יכולתה לשרוד בתנאים שאינם טבעיים. יש גישה קלה בvivo ובניתוחים אלקטרולוגיים מחוץ לגופית . בנוסף, סרטנים הם קבוצה חיובית עבור מחקר נוירוביולוגי בתחום הכרונוביולוגיה21השוואתי.

במאמר זה, המחקר של הפחתת הרגישות וההתאוששות של האור המופעל התמרה-זרם של תאי סרטן תא קולט אור מוצג באמצעות טכניקת ההקלטה תאיים. עם זאת, אנו מאמינים כי אותה טכניקה יכול להיות מותאם למערכות חזותיות אחרות חסרי חוליות כל עוד אפשר לגשת לתאים תא קולט אור.

כדי להשיג תוצאות נסיוניות מקובלות, חשוב לשקול כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול, כולל ביטול הרעש החשמלי על-ידי הארקה של כל הציוד, בניית אלקטרודה בעלת קצה דק מספיק, ולהבטיח ש תא תא קולט אור הוא לגמרי כהה מותאם לפני הפרוטוקול שני פעימות מתחיל.

למרות המגבלות של הקלטה תאיים כגון הנזק של קרום, אפשר ללכת רחוק יותר ולקבל מידע מפורט על מנגנון הביופיזיקלי בבסיס סרטנים (או בעלי חיים אחרים) אות חשמל תא קולט אור. כמו בחסרי חוליות פוטורפקטורים אחרים, באור הסרטן, מפעיל מערך הדפולריזציה, או פוטנציאל הקולטן, המיוצר על ידי הפעלת מוליכות מכוח. הסיוע המפעיל המופעל באור מתחיל לאחר השהיה או השהיה, ולאחר שהגיע לשרעת המקסימלית, הוא יורד באיטיות לאחר מסלול הזמן האקספוננציאלי, כאשר הערוצים נכנסים למצב מאוד מרתק.

הקינטיקה של ההתאוששות מהפחתת הרגישות של מוליכות האור-מעורר הקלה של סרטני הנהרות הושגו באמצעות פרוטוקול פלאש שני-אור (בדומה לפרוטוקול הדופק הסטנדרטי של שני המתח המשמש לחקר ההתאוששות מפני הפעלה של ערוצים מגודרת מתח)20. מעניין, ובניגוד למקרה ידוע של ערוצי מתח מגודרת, לא רק משרעת שיא, אלא גם את כל הפרמטרים הנוכחיים (אניp, L, T) לשנות לאחר גירוי האור הראשון, שחזור עם קורסים מעריכי הזמן האקספוננציאלי המקורי, ערכי פלאש הראשון, כפי שדווח במקום אחר20. וריאציה זו של כל הפרמטרים המאפיינים את הנוכחי מציין את השתתפות השליחים השני במערכת התמרה חזותית של סרטן הנהרות1,2,22,23,24.

בנוסף, ומעניין, כמו איור 8 מראה, התאוששות של L, Ip, ו-T תלוי בזמן המעגל שבו ניסויים מתממשו. מחקרים נוספים נחוצים כדי לקבוע את הבסיס המולקולרי של תופעה זו. כמובן, ניתן להשיג מידע דומה בטכניקה אחרת, כגון מהדק טלאי. עם זאת, הסביבה תאיים יכול להיות מופרע מאוד בטכניקות אחרות, וזה יכול להיות קריטי, אם, למשל, אלמנטים פנימיים כמו חלבונים, חומצות אמינו, נוקלאוטידים, בין רבים אחרים, לשחק תפקיד רלוונטי בדור האותות החשמליים או באינטראקציה עם הורמונים או נוירומודולדוטורים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. אין לנו מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי D, UNAM IN224616-RN224616 גרנט. המחברים רוצים להודות לגברת ג'וזפינה בולאדו, ראש המחלקה לתרגום ניירות מדעיים, מאליפות דה בדיקה בפסולטד דה מדיטינה, UNAM, לעריכת הגרסה האנגלית של כתב יד זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axoclamp2A  Axon Instruments Inc Amplifier
Digidata 1200 Interface Axon Instruments Inc Digitizer
Oscilloscope TDS430A Tektronix Analogic Oscilloscope
Photostimulator PS33 Plus Grass Lamp
Puller PC-100 Narishige Micropipette Puller
Puller P-97 Sutter Instruments Micropipette Puller
Glass Capillary Tube Kimax-51 Kimble Products 34502 0.8, 1.10, 100 mm
HS-2 Headstage Axon Instruments Inc Headstage
Micromanipulator MX-4 Narishige Mechanical Micromanipulator
Stereoscopic Microscope Zeiss Microscope
pClamp Axon Instruments Inc Data acquisition software for digidata 1200 interface
Clampfit Axon Instruments, Inc Analysis software linked to pClamp
Origin OriginLab Corp. Data analysis and graphing software
Sodium Chloride Sigma S7653 >99.5%
Potassium Chloride Sigma P-9333 Minimum 99%
Magnesium Sulfate Sigma M7506 Minimum 99.5%
Calcium Chloride Sigma C5080 Minimum 99.0%
Hepes Sigma H7523 >99.5%
Sodium Hydroxide Sigma S8045 98.00%
Sodium hypochlorite solution Sigma 425044 Available chlorine, 10-15% 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
  2. Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
  3. Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
  4. Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
  5. Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
  6. Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
  7. Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
  8. Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
  11. Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
  12. Single-channel recording. Sakmann, B. , Springer Science & Business Media. (2013).
  13. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
  14. Oesterle, A. pipette cookbook. , Sutter Instruments. Novato, CA. 97 (2008).
  15. Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
  16. Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
  17. Pittendrigh, C. S. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. Aschoff, J. , North Holland, Amsterdam. 277-297 (1965).
  18. Pittendrigh, C. S. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. Aschoff, J. , Plenum, New York. 94-124 (1981).
  19. Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
  20. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. 507, Sinauer. Sunderland, MA. (2001).
  21. Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
  22. Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
  23. Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
  24. Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).

Tags

מדעי המוח סוגיה 153 זרם מעורר הפחתת הרגישות התאוששות מהפחתת הרגישות הקלטה תאיים מלחציים מתח פרוטוקול שני פעימות סרטני מקצבים מעגליות
הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barriga-Montoya, C., de la… More

Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Picones, A., Hernández-Cruz, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus. J. Vis. Exp. (153), e56258, doi:10.3791/56258 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter