Summary
सर्कैडियन समय के एक समारोह के रूप में क्रेफिश फोटोरिसेप्टर्स के असंवेदनशीलता और संवेदनशीलता वसूली के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है।
Abstract
क्रेफिश फोटोरिसेप्टर्स की असंवेदनशीलता और वसूली का अध्ययन करने की एक विधि प्रस्तुत की जाती है। हमने अलग-अलग आंखों में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की इंट्रासेलर इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डिंग का प्रदर्शन किया, जिसमें असतत एकल इलेक्ट्रोड-स्विच्ड वोल्टेज-क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग किया गया। सबसे पहले, एक रेजर ब्लेड के साथ हमने रेटिना तक पहुंच प्राप्त करने के लिए पृष्ठीय कॉर्निया में एक खोलने बनाया। इसके बाद, हमने उद्घाटन के माध्यम से एक ग्लास इलेक्ट्रोड डाला, और नकारात्मक क्षमता की रिकॉर्डिंग द्वारा रिपोर्ट के अनुसार एक कोशिका में प्रवेश किया। झिल्ली की क्षमता फोटोरिसेप्टर की आराम करने की क्षमता पर क्लैंप किया गया था और धाराओं को सक्रिय करने के लिए एक प्रकाश-नाड़ी लागू की गई थी। अंत में, वर्तमान असंवेदीकरण और वसूली को मापने के लिए दो लाइट-फ्लैश प्रोटोकॉल को नियोजित किया गया था। पहला लाइट-फ्लैश ट्रिगर, अंतराल अवधि के बाद, ट्रांसड्यूक्शन आयनिक वर्तमान, जो एक संवेदनशील राज्य की ओर एक चोटी आयाम क्षय तक पहुंचने के बाद; दूसरा फ्लैश, अलग-अलग समय अंतराल पर लागू होता है, प्रकाश-सक्रिय आचरण की स्थिति का आकलन करता है। प्रकाश प्राप्त वर्तमान की विशेषता के लिए, तीन मापदंडों को मापा गया: 1) विलंबता (प्रकाश फ्लैश डिलीवरी और उस क्षण के बीच बीता समय जिसमें वर्तमान अपने अधिकतम मूल्य का 10% प्राप्त करता है); 2) पीक करंट; और 3) डिसेन्सिटाइजेशन समय स्थिर (वर्तमान क्षय चरण का घातीय समय स्थिर)। सभी पैरामीटर पहले नाड़ी से प्रभावित होते हैं।
असंवेदीकरण से वसूली की मात्रा निर्धारित करने के लिए, अनुपात p2/p1 दालों के बीच समय बनाम नियोजित किया गया था । p1 चोटी वर्तमान पहले प्रकाश नाड़ी द्वारा पैदा की है, और p2 चोटी दूसरी नाड़ी द्वारा पैदा की वर्तमान है । इन आंकड़ों को घातीय कार्यों के योग के लिए फिट किया गया था । अंत में, इन मापों को सर्कैडियन समय के कार्य के रूप में किया गया था।
Introduction
आदेश में एक दृश्य उत्तेजना के रूप में माना जा करने के लिए, आंखों तक पहुंचने प्रकाश एक बिजली के संकेत में स्थानांतरित किया जाना चाहिए । इसलिए, सभी दृश्य जीवों में, प्रकाश एक ट्रांसड्यूक्शन आयन-धारा को ट्रिगर करता है, जो बदले में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की झिल्ली क्षमता में परिवर्तन पैदा करता है, तथाकथित रिसेप्टर क्षमता। इसके कारण, आंख की प्रकाश संवेदनशीलता मुख्य रूप से प्रकाश सक्रिय आचरण की स्थिति पर निर्भर करती है, जिसे या तो सक्रिय या असंवेदनशील होने के लिए उपलब्ध किया जा सकता है।
क्रेफ़िश फोटोरिसेप्टर्स में, प्रकाश धीमी, क्षणिक, आयनिक वर्तमान1को ट्रिगर करता है। रोशनी पर, ट्रांसक्शन वर्तमान अपने अधिकतम तक पहुंचने से पहले अंतराल या विलंबता के बाद उत्पन्न होता है; इसके बाद यह क्षय, ट्रांसड्यूक्शन चैनलों के रूप में एक असंवेदनशील राज्य में गिर जाते हैं जिसमें वे आगे प्रकाश उत्तेजना2के लिए अनुत्तरदायी हैं . यही है, दृष्टि के जिम्मेदार ट्रांसड्यूक्शन वर्तमान को सक्रिय करने के अलावा प्रकाश, फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की संवेदनशीलता का क्षणिक विनाश भी प्रेरित करता है। डिसेन्सिटाइजेशन पर्याप्त उत्तेजना के लिए ओवरएक्सपोजर के खिलाफ एक सामान्य सुरक्षात्मक तंत्र का प्रतिनिधित्व कर सकता है। प्रकाश के प्रति आंख की संवेदनशीलता बरामद होती है क्योंकि ट्रांसड्यूक्शन आचरण डिसिजन से ठीक हो जाता है।
इंट्रासेलर रिकॉर्डिंग एक्सीटेबल कोशिकाओं3,4,5,6,7,8की विद्युत गतिविधि को मापने के लिए एक उपयोगी तकनीक है . यद्यपि इंट्रासेलर रिकॉर्डिंग पैच-क्लैंप तकनीक9के आगमन के साथ कम बार हो गई है, यह अभी भी एक सुविधाजनक दृष्टिकोण है जब कोशिकाओं को या तो अलग करना मुश्किल होता है, या एक ज्यामिति पेश करता है जो पैच-क्लैंपिंग गीगा-सील के गठन को मुश्किल बनाता है(यानी,पैच इलेक्ट्रोड और झिल्ली के बीच 109ओह्म के आदेश के विद्युत प्रतिरोध के साथ सील या तंग संपर्क)। उत्तरार्द्ध के उदाहरण शुक्राणु कोशिकाएं10 और फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं हैं जो यहां अध्ययन की गई हैं। हमारे अनुभव में, प्रोकैम्बस क्लार्की फोटोरिसेप्टर्स को अलग करना और प्राथमिक संस्कृति में रखना मुश्किल है; इसके अतिरिक्त, वे पतली छड़ हैं जो गीगा-सील गठन को प्राप्त करना मुश्किल बनाते हैं। इंट्रासेलर रिकॉर्डिंग में, एक तेज इलेक्ट्रोड एक कोशिका में उन्नत होता है जिसे आसपास के ऊतकों द्वारा जगह में रखा जाता है। इलेक्ट्रोड एम्पलीफायर की हाई-स्पीड स्विचिंग सर्किटरी से कटा हुआ है, इसलिए वोल्टेज दालों के बीच करंट का नमूना लिया जाता है। इस मोड को असतत एकल-इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप (डीएसईवीसी मोड)11के रूप में जाना जाता है। इलेक्ट्रोड का उच्च प्रतिरोध (छोटा उद्घाटन) कोशिका और पिपेट समाधानों के बीच प्रसारित होने वाले आदान-प्रदान में बाधा डालता है, जिससे इंट्रासेलर परिवेश3की न्यूनतम अशांति उत्पन्न होती है। इस तकनीक की एक संभावित खामी यह है कि इलेक्ट्रोड प्रविष्टि एक गैर-चयनात्मक रिसाव वर्तमान का उत्पादन कर सकती है; इसलिए, देखभाल कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग से बचने के लिए लिया जाना चाहिए जहां रिसाव वर्तमान के आकार इच्छित माप4,12के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं .
इसके साथ, हम वोल्टेज क्लैंप स्थितियों के तहत फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की इंट्रासेलर विद्युत रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करके प्रकाश-सक्रिय आयन आचरण की असंवेदीकरण और वसूली का आकलन करने के लिए अलग-थलग क्रेफ़िश आंखों का उपयोग करते हैं।
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Protocol
नोट: प्रयोग मेक्सिको के पशु संरक्षण के कानूनों का पालन करते हैं ।
1. प्रायोगिक सेटअप
- सामान्य कनेक्शन
- एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर के माध्यम से एम्पलीफायर को एक उपयुक्त कंप्यूटर से कनेक्ट करें और प्रयोग(चित्रा 1)की निगरानी के लिए ऑस्टसिस्कोप का उपयोग करें।
- फोटोस्टिलेटर को ए/डी कन्वर्ट से कनेक्ट करें ।
- रिकॉर्डिंग चैंबर
- रिकॉर्डिंग कक्ष को एक एंटी-कंपन टेबल के शीर्ष पर रखें और इसे फैराडे पिंजरे के अंदर ढूंढें।
नोट: यह यांत्रिक कंपन और बिजली के शोर को रोकता है जो रिकॉर्डिंग को प्रभावित कर सकता है। हमारे फैराडे पिंजरे अंधेरे तार जाल से बना था । एक घर का बना, 2 mL, ऐक्रेलिक रिकॉर्डिंग चैंबर का उपयोग किया जाता है(चित्रा 2)। - तैयारी को जीवित रखने के लिए स्नान समाधान तैयारकरें 13:205 एमएम नैल; 5 एमएम केसीएल; 2 एमएम एमजीएसओ4; 13 एमएम सीएसीएल2; 5 एमएम हेप्स-नाओएच, पीएच 7.3।
नोट: समाधान में डेक्सट्रोस या 95% O2,5% सीओ2 मिश्रण शामिल नहीं है क्योंकि प्रायोगिक प्रक्रिया विद्युत रिकॉर्डिंग द्वारा नुकसान का पता लगाने के लिए पर्याप्त कम है (पूर्णता के लिए चरण 4.2.3 देखें)।
- रिकॉर्डिंग कक्ष को एक एंटी-कंपन टेबल के शीर्ष पर रखें और इसे फैराडे पिंजरे के अंदर ढूंढें।
- इलेक्ट्रोड
- संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में क्लोराइड-लेपित सिल्वर-वायर इलेक्ट्रोड का उपयोग करें
नोट: इलेक्ट्रोड रिएक्शन की अनुमति देने के लिए सिल्वर क्लोराइड कोटिंग जरूरी है: एजीसीएल (एस) + ई−↔एजी (एस) + सीएल-। - रेत एक चांदी के तार (मोटाई ~ 1 मिमी, लंबाई ~ 10 सेमी) एक ठीक ग्रेड एमरी कागज के साथ अपनी सतह को साफ करने के लिए।
- आसुत पानी से चांदी के तार को कुल्ला।
- साफ चांदी के तार को 4-6% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान (एनसीएलो) में विसर्जित करें जब तक कि यह अंधेरा (लगभग 20 मिन) दिखाई न दे।
- इंट्रासेलर इलेक्ट्रोड के रूप में इलेक्ट्रोलाइट सॉल्यूशन (2.7 एम केसीएल) से भरे पतले ग्लास पिपेट का उपयोग करें।
- एक छोटे से खोलने (0.01-0.1 μm)14के साथ एक पतली टिप प्राप्त करने के लिए एक माइक्रो-पिपेट खींचने वाले के साथ एक ग्लास केशिका ट्यूब (आंतरिक व्यास 1 मिमी) खींचें।
- 2.7 एम केसीएल समाधान के साथ खींचा केशिका ग्लास भरें। पहले इसे केशिका द्वारा भरें (2.7 एम केसीएल समाधान में पिपेट टिप को विसर्जित करें) और फिर पाइपेट के आधे हिस्से को ठीक इंजेक्शन सुई से भरें। यदि आवश्यक हो, तो हवा के बुलबुले को खत्म करने के लिए इलेक्ट्रोड पिपेट पर टैप करें।
- इलेक्ट्रोड को अपने धारक से जोड़ें। एम्पलीफायर के साथ एम्पलीफायर हेडस्टेज से धारक को जोड़ें। एक स्थिर 3-डी माइक्रोजोड़क के साथ इलेक्ट्रोड-होल्डर-हेडस्टेज की स्थिति। जब तक स्नान समाधान अपनी टिप को कवर नहीं करता तब तक इलेक्ट्रोड को कम करें।
नोट: इलेक्ट्रोड में एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास होना चाहिए
- संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में क्लोराइड-लेपित सिल्वर-वायर इलेक्ट्रोड का उपयोग करें
- एम्पलीफायर के ब्रिज मोड (एम्पलीफायर के मोड सेक्शन में, ब्रिज बटन दबाएं) का चयन करें और इलेक्ट्रोड प्रतिरोध को मापें। सुनिश्चित करें कि प्रतिरोध के बारे में 50 MΩ11है.
नोट: यह इलेक्ट्रोड आकार कोशिका को सीमित क्षति के साथ एक अच्छी गुणवत्ता वाली विद्युत रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। - एम्पलीफायर के सेक्शन वोल्टेज क्लैंप में होल्डिंग पोजीशन बटन का उपयोग करके ऑफसेट वर्तमान और क्षतिपूर्ति कैपेसिटिव ट्रांसिएंट और एम्पलीफायर के माइक्रोइलेक्ट्रोड 1 अनुभाग में कैपेसिटी बेअसर बटन को क्षतिपूर्ति करें।
- सुपरफ्यूजन सिस्टम
- स्नान समाधान (चरण 1.2.2) को एक उपयुक्त पात्र (250 मिलीआर सीरम बोतल) में डालें और इसे सिंचाई ट्यूबिंग सेट (आंतरिक व्यास के 3.2 मिमी) से जोड़ें, इस प्रकार रिकॉर्डिंग कक्ष को जोड़ें। गुरुत्वाकर्षण चालित सुपरफ्यूजन प्रणाली का उपयोग करें। प्रवाह दर को ~ 0.5 मीटर/एस तक विनियमित करें।
- कक्ष को सक्शन डिवाइस से कनेक्ट करें। समाधान सक्शन सिस्टम को इस तरह से विनियमित करें कि रिकॉर्डिंग कक्ष की कुल मात्रा भिन्न न हो। सक्शन के लिए वैक्यूम पंप का उपयोग करें।
नोट: रिकॉर्डिंग कक्ष में एक निरंतर मात्रा प्रयोग के दौरान आवारा क्षमताओं को स्थिर रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
2. जैविक सामग्री
नोट: अस्पष्ट सेक्स के इंटरमोल्ट चरण में वयस्क क्रेफ़िश पी क्लार्की (7-10 सेमी लंबा) का उपयोग करें।
- सर्कैडियन समय
- प्रयोगों से एक महीने पहले, एक 12 घंटे प्रकाश/12-h डार्क चक्र15 (सफेद प्रकाश, २.४ किलोवाट/मीटर2)के तहत १०० क्रेफिश बनाए रखें ।
नोट: क्रेफ़िश आबादी को सिंक्रोनाइज़ करने के लिए एक महीने पर्याप्त समय है। - बेतरतीब ढंग से चुने गए पांच जानवरों के इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम के आयाम का आकलन करके क्रेफ़िश आबादी के सर्कैडियन समय का निर्धारण करें15।
नोट: 0 एच सर्कैडियन समय (सीटी 0) एक व्यक्तिपरक दिन की शुरुआत को इंगित करता है, यानी,उस समय जिसके दौरान एक जीव सामान्य रूप से सक्रिय होता है16,17,18,19 (चित्रा 3)। क्रेफ़िश एक रात्रिभोज जानवर है, इसलिए 12-एच प्रकाश/12-एच डार्क चक्र के तहत, यह अंधेरे चरण के दौरान सक्रिय होता है।
- प्रयोगों से एक महीने पहले, एक 12 घंटे प्रकाश/12-h डार्क चक्र15 (सफेद प्रकाश, २.४ किलोवाट/मीटर2)के तहत १०० क्रेफिश बनाए रखें ।
- आंखों की बात अलगाव प्रक्रिया
- वांछित सर्कैडियन समय में, 15 मिन के लिए 0-4 डिग्री सेल्सियस पर नल के पानी में विसर्जन करके चयनित क्रेफ़िश को एनेस्थेटाइज करें।
- एक ठीक कैंची के माध्यम से, आधार से आंखों की बात अलग।
- पृष्ठीय कॉर्निया में एक खोलने (~ 1-मिमी2)बनाने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग कररेटिना तक पहुंचें।
- कक्ष के शीर्ष पर रेटिना के लिए उपयोग खोलने के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष (सिलिकॉन के साथ कवर छेद) के केंद्र में आंखों की बात रखें।
- 20 मिन के लिए लगातार अंधेरे में आंखों की बात रखें।
नोट: फोटोरिसेप्टर सेल को पूरी तरह से अंधेरा अनुकूलित करने के लिए 20 मिन पर्याप्त समय है।
3. फोटोरिसेप्टर इम्पलिंग
- माइक्रोइलेक्ट्रोड और आंखों की बात की देशांतर धुरी समानांतर इस तरह से रखो कि माइक्रोइलेक्ट्रोड रेटिना तक पहुंच के लिए केंद्रित है। उपकरणों को सही विन्यास में रखने के लिए स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप (10X) का उपयोग करें।
- एम्पलीफायर के ब्रिज मोड11 का चयन करके संदर्भ और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के बीच वोल्टेज अंतर की निगरानी करें।
- इलेक्ट्रोड को स्नान में कम करें और उसके बाद इसे रेटिना के ऊपर रखें।
- माइक्रोस्कोप को दूर ले जाएं और आंखों की देशांतर धुरी के समानांतर फोटोस्टिमुलेटर लैंप की स्थिति रखें।
नोट: दीपक और सुपरफ्यूजन चैंबर के बीच की दूरी लगभग 15 सेमी है। - अचानक वोल्टेज ड्रॉप का पता चलने तक धीरे-धीरे माइक्रोइलेक्ट्रोड को कम करें।
नोट: लगभग −50 एमवी की वोल्टेज ड्रॉप एक स्वस्थ फोटोरिसेप्टर सेल की सूली को इंगित करती है। - फोटोरिसेप्टर की रिसेप्टर क्षमता को रिकॉर्ड करने के लिए एक टेस्ट लाइट-फ्लैश (सफेद प्रकाश, 7.2 किलोवाट/मीटर2,10 μs अवधि) वितरित करें।
नोट: फोटोरिसेप्टर की रिसेप्टर क्षमता 10-15 एमवी आयाम और 300 एमएस अवधि(चित्रा 4)की एक ध्रुवीकरण क्षमता है।
4. इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डिंग
- सुनिश्चित करें कि फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को पूरी तरह से अंधेरे परिस्थितियों के अनुकूल कर रहे है (चरण २.३ देखें) ।
- हर 2 मिन एक टेस्ट-लाइट फ्लैश वितरित करें। डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में "एपिसोड के बीच समय" के पर्याप्त मूल्य (120 एस) का चयन करके चमक के बीच के समय को स्वचालित करें।
नोट: फोटोरिसेप्टर की विद्युत प्रतिक्रिया अंतर्निहित धाराओं की कुल वसूली की अनुमति देने के लिए 2 मिन आवश्यक समय है। - आराम झिल्ली क्षमता की निगरानी, साथ ही आयाम और रिसेप्टर क्षमता की अवधि। मान लें कि झिल्ली की क्षमता, आयाम और रिसेप्टर क्षमता की अवधि अपरिवर्तित रहने के बाद फोटोरिसेप्टर पूरी तरह से अनुकूलित हो ता है। आंखों की बातचीत पहले 20 मिन (चरण 2.3) के लिए लगातार अंधेरे में रखा लगभग 5 मिन में अपने अनुकूलन को पूरा करें।
- प्रकाश प्राप्त वर्तमान रिकॉर्डिंग से पहले सेल 2 मिन उत्तेजक बंद करो।
- हर 2 मिन एक टेस्ट-लाइट फ्लैश वितरित करें। डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में "एपिसोड के बीच समय" के पर्याप्त मूल्य (120 एस) का चयन करके चमक के बीच के समय को स्वचालित करें।
- वर्तमान रिकॉर्डिंग
- डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (एनालॉग आउटपुट चैनल अनुभाग पर वेवफॉर्म में) में "होल्डिंग आयाम" का चयन करके सेल के मापा आराम झिल्ली संभावित मूल्य पर वोल्टेज को क्लैंप करें।
- एम्पलीफायर के डीएसईवीसी मोड का चयन करें। एम्पलीफायर के मोड सेक्शन में, एसईवीसी बटन का चयन करें और लीवर को डिस्कोंट एसईवीसी स्थिति में स्विच करें।
- इलेक्ट्रोड11की गति से निर्धारित 500-1,000 हर्ट्ज (एम्पलीफायर के रेट एडजस्ट बटन का उपयोग करके) के लिए स्विचिंग दर निर्धारित करें।
- एक प्रकाश फ्लैश उद्धार, और पैदा आयन बाढ़ का निरीक्षण करें ।
नोट: यह प्रकाश प्राप्त या ट्रांसड्यूक्शन वर्तमान(चित्रा 5)है। - एम्पलीफायर पर ब्रिज मोड पर लौटें और लाइट फ्लैश भेजकर रिसेप्टर क्षमता रिकॉर्ड करें (सेक्शन 3 देखें)। सुनिश्चित करें कि फोटोरिसेप्टर सेल पूरी तरह से अंधेरे परिस्थितियों के अनुकूल है। रिसेप्टर संभावित विशेषताओं (आयाम और अवधि) को मापें और पहले माप के साथ तुलना करें। मान लें कि सूली वाले फोटोरिसेप्टर सेल एक स्वस्थ कोशिका है यदि उनमें एक ही विशेषताएं हैं।
नोट: आंखों के साथ एब्लेशन के बाद, निम्नलिखित 2 घंटे के दौरान जैविक तैयारी व्यवहार्य है।
- दो पल्स प्रोटोकॉल: दो लाइट-फ्लैश प्रोटोकॉल के साथ डिसिजनसेसेशन से रिकवरी को मापें।
नोट: दो लाइट-फ्लैश प्रोटोकॉल मानक दो-पल्स वोल्टेज प्रोटोकॉल के समान है जिसका उपयोग वोल्टेज-गेटेड चैनलों के निष्क्रियता से वसूली को मापने के लिए उपयोग किया जाता है20। पहला लाइट-फ्लैश फोटोरिसेप्टर सेल की संवेदनशीलता में अस्थायी परिवर्तन का कारण बनता है और दूसरा फ्लैश प्रकाश-सक्रिय चालन की स्थिति का मूल्यांकन करता है।- हल्की दालों की एक जोड़ी वितरित करें। एक वांछित समय अंतराल (300 एमएस से 2 किमी तक) के बाद दूसरा फ्लैश लागू करें।
- डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ 10 KHz नमूना पर धाराओं डिजिटाइज और ऑफ लाइन विश्लेषण11के लिए डेटा बचाने के लिए ।
नोट: सॉफ्टवेयर के विन्यास मूल्यों के साथ एक तालिका पूरक सामग्री के रूप में शामिल है।
5. डेटा विश्लेषण
- प्रकाश प्राप्त वर्तमान के काइनेटिक्स
- तीन वर्तमान मापदंडों को मापें: सक्रियण विलंबता एल, प्रकाश-फ्लैश डिलीवरी से समय बीता जब तक कि वर्तमान अपने अधिकतम आयाम का 10% प्राप्त न हो जाए(चित्रा 5); चोटी या अधिकतम वर्तमान आयाम मैंपी, और डिसेन्सिटाइजेशन समय स्थिर टी वर्तमान क्षय चरण को फिटिंग करके डिसेन्सिटाइजेशन टाइम स्थिर (Τ) को मापें:
कहां, एक = -I (t=0) एक सकारात्मक स्थिर(चित्र5)है।
- तीन वर्तमान मापदंडों को मापें: सक्रियण विलंबता एल, प्रकाश-फ्लैश डिलीवरी से समय बीता जब तक कि वर्तमान अपने अधिकतम आयाम का 10% प्राप्त न हो जाए(चित्रा 5); चोटी या अधिकतम वर्तमान आयाम मैंपी, और डिसेन्सिटाइजेशन समय स्थिर टी वर्तमान क्षय चरण को फिटिंग करके डिसेन्सिटाइजेशन टाइम स्थिर (Τ) को मापें:
- डिसेंसिटाइजेशन और रिकवरी
नोट: desensitization से वसूली अनुपात पी2/p1के रूप में मूल्यांकन किया गया था, जहां पी1 नियंत्रण वर्तमान के प्रासंगिक पैरामीटर (या तो एल, मैंपी,या टी) है, और पी2 दूसरे परीक्षण-वर्तमान का संबंधित पैरामीटर है ।- दालों के बीच समय के एक समारोह के रूप में पी2/पी1 (या तो एल, मैंपी,या टी) प्लॉट ।
- पैरामीटर के आधार पर, प्रत्येक भूखंड के बिंदुओं को फिट करें:
या करने के लिए:
- प्रायोगिक डेटा को फिट करने के लिए आवश्यक घातीय शर्तों की संख्या निर्धारित करने के लिए एक उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग करें।
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Representative Results
सबसे पहले, क्रेफ़िश फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि रिसेप्टर क्षमता प्राप्त की जाती है(चित्र4)। बाद में, प्रकाश ट्रांसड्यूक्शन करंट(चित्रा 5)को ट्रिगर करने के लिए एक परीक्षण लाइट-फ्लैश लागू किया गया था। कांस्टिक ट्रांसड्यूक्शन वर्तमान1 अंतराल के बाद सक्रिय होता है, एक अधिकतम तक पहुंचता है और उसके बाद धीरे-धीरे एक अवशोषित असंवेदनशील स्थिति में गिरता है जिससे यह धीरे-धीरे ठीक हो जाता है।
यह मानना उचित है कि प्रकाश-प्राप्त वर्तमान की लंबी विलंबता एल (दसियों मिलीसेकंड) प्रकाश द्वारा ट्रिगर की गई जैव रासायनिक घटनाओं पर निर्भर करती है, जिसमें जी-प्रोटीन रास्ते शामिल हैं। पीक वर्तमान Ip का आयाम खोला जा करने के लिए उपलब्ध चैनलों के अंश और वर्तमान सक्रियण और निष्क्रियता की सापेक्ष दरों पर निर्भर करता है। बाद क्षय समय निरंतर टी द्वारा मूल्यांकन किया जाता है।
दूसरी ओर, एल रिकवरी बायोकेमिकल फोटोट्रांसडक्शन झरना की वसूली की दर से संबंधित होनी चाहिए; मैंपी वसूली आयन आचरण के लिए जिम्मेदार प्रोटीन के आंतरिक संरचना परिवर्तनों पर, और जैव रासायनिक फोटोट्रांसडक्शन झरना की वसूली की दर पर दोनों पर निर्भर करता है। बाद में भी टी की वसूली से संबंधित हो सकता है । इसके अलावा, एल और टी की समानांतर भिन्नता का सुझाव है कि एक आम जैव रासायनिक कारक (या कारक; उदाहरण के लिए,चैनल के फॉस्फोरिलेशन राज्य) दोनों मापदंडों को प्रभावित कर सकते हैं1.
सर्कैडियन चक्र(चित्रा 8)में विभिन्न क्षणों में डिसिडेंसाइजेशन(चित्रा 7)से वसूली के काइनेटिक्स का निर्धारण करने के लिए बाद में एक दो-फ्लैश प्रोटोकॉल(चित्रा 6)लागू किया गया था।
चित्रा 1। उपकरण सेटअप के लाइन आरेख। पर्सनल कंप्यूटर (पीसी)(ए),इंटरफेस(बी),ऑस्टसिस्कोप(सी),वोल्टेज-क्लैंप एम्पलीफायर(डी),फोटोस्टिलेटर(ई),और उपकरण सेटअप(एफ)के हेडस्टेज/होल्डर/माइक्रोइलेक्ट्रोड सिस्टम के बीच कनेक्शन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2. आरecording कक्ष। (ए)अपने सुपरफ्यूजन-सक्शन सिस्टम के साथ एक फैराडे पिंजरे के अंदर रिकॉर्डिंग कक्ष। इसमें फोटोस्टिमुलेटर, माइक्रोस्कोप और माइक्रोजोड़क-हेडस्टेज-माइक्रोइलेक्ट्रोड सिस्टम की स्थिति भी दिखाई गई है। (ख)रिकॉर्डिंग कक्ष का आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3. इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (ईआरजी) आयाम। (A)क्रेफ़िश। (ख)क्रेफिश फोटोरिसेप्टर्स (डेटा हर 20 min) के ईआरजी आयाम के प्रतिनिधि भूखंड सर्कैडियन समय के एक समारोह के रूप में लिया गया । सर्कैडियन लय के अस्तित्व की स्पष्ट रूप से सराहना की जा सकती है। ध्यान दें कि प्रत्येक चक्र के लिए, गतिविधि की शुरुआत सर्कैडियन समय 0 के साथ मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4। रिसेप्टर क्षमता। प्रतिनिधि रिसेप्टर क्षमता एक प्रकाश फ्लैश (सफेद प्रकाश, ७.२ किलोवाट/मीटर2,10 μs अवधि) द्वारा पैदा की । इस आंकड़े को बैरीगा-मोंटोया, सी, एट अल से संशोधित किया गया है। 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5। ट्रांसड्यूक्शन करंट। एक प्रकाश फ्लैश (सफेद प्रकाश, ७.२ किलोवाट/एम2,10 μs अवधि) द्वारा लागू प्रतिनिधि ट्रांसड्यूक्शन वर्तमान फोटोरिसेप्टर आराम क्षमता पर स्थिर रखा वोल्टेज के साथ लागू किया । वर्तमान विलंबता, पीक आयाम, और असंवेदीकरण चरण इंगित किए जाते हैं। इस आंकड़े को बैरीगा-मोंटोया, सी, एट अल से संशोधित किया गया है। 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6। दो पल्स प्रोटोकॉल। प्रकाश चमक की एक जोड़ी द्वारा प्राप्त धाराएं। प्रकाश उत्तेजनाओं 0 एमएस और 700 एमएस (तीर द्वारा इंगित) पर लागू किया गया। इस आंकड़े को 2से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7। डिसेंकेशन से रिकवरी। (क)मैंपी:पीक वर्तमान वसूली,(B)एल: विलंबता वसूली,(C)टी: Desensitization समय लगातार टी वसूली । 0 एच सीटी पर प्रयोग किए गए। इस आंकड़े को बैरीगा-मोंटोया, सी, एट अल से संशोधित किया गया है। 2.परिणाम प्रयोगों की संख्या (n = 11) के मतलब ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 8. सीटी के एक समारोह के रूप में desensitization से वसूली। (A)मैंवसूली, (B)एल वसूली,(सी)वसूली । (घ)भारित समय स्थिरांक। बिफसिक प्रक्रियाओं को तीर से चिह्नित किया जाता है। इस आंकड़े को बैरीगा-मोंटोया, सी, एट अलसे संशोधित किया गया है । 2.परिणाम प्रयोगों की संख्या (n = 11) के मतलब ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक तालिका 1. कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।
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Discussion
क्रेफ़िश गैर-प्राकृतिक परिस्थितियों में जीवित रहने की क्षमता के कारण एक उत्कृष्ट मॉडल साबित हुआ है। वीवो और इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषणों में आसान पहुंच है। इसके अलावा, क्रस्टेसियन तुलनात्मक क्रोनोबायोलॉजी21के क्षेत्र में न्यूरोबायोलॉजिकल अनुसंधान के लिए एक अनुकूल समूह हैं।
इस पेपर में इंट्रासेलर रिकॉर्डिंग तकनीक का इस्तेमाल करते हुए क्रेफिश फोटोरिसेप्टर सेल्स के लाइट-एक्टिवेटेड ट्रांसड्यूक्शन-करंट की डिसिजन और रिकवरी का अध्ययन दिखाया गया है। हालांकि, हमारा मानना है कि एक ही तकनीक को अन्य अकशेरुकी दृश्य प्रणालियों के अनुकूल बनाया जा सकता है जब तक कि फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं तक पहुंचना संभव है।
स्वीकार्य प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर विचार करना महत्वपूर्ण है, जिसमें सभी उपकरणों को ग्राउंडिंग करके बिजली के शोर को नष्ट करना, पर्याप्त रूप से ठीक टिप के साथ एक इलेक्ट्रोड का निर्माण करना और यह सुनिश्चित करना शामिल है कि फोटोरिसेप्टर सेल दो-पल्स प्रोटोकॉल शुरू होने से पहले पूरी तरह से अंधेरा अनुकूलित है।
झिल्ली की क्षति जैसे इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग की सीमाओं के बावजूद, आगे जाकर बायोफिजिकल तंत्र अंतर्निहित क्रेफ़िश (या किसी अन्य जानवर) फोटोरिसेप्टर विद्युत संकेत के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त करना संभव है। अन्य अकशेरुकी फोटोरिसेप्टर्स की तरह, क्रेफ़िश फोटोरिसेप्टर्स में, प्रकाश एक वर्गीकृत ध्रुवीकरण, या रिसेप्टर क्षमता को ट्रिगर करता है, जो एक कास्टिक चालन की सक्रियता द्वारा उत्पादित होता है। प्रकाश-सक्रिय आचरण अंतराल या विलंबता के बाद शुरू होता है, और इसके अधिकतम आयाम तक पहुंचने के बाद, यह धीरे-धीरे एक घातीय समय पाठ्यक्रम के बाद गिरता है, क्योंकि चैनल एक अवशोषित असंवेदनशील स्थिति में प्रवेश करते हैं।
क्रेफ़िश के प्रकाश-प्राप्त आयन आचरण के असंवेदीकरण से वसूली की काइनेटिक्स को दो-हल्के फ्लैश प्रोटोकॉल (वोल्टेज-गेटेड चैनलों के निष्क्रियता से वसूली का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक दो-वोल्टेज पल्स प्रोटोकॉल के समान)20का उपयोग प्राप्त किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि, और वोल्टेज-गेटेड चैनलों के प्रसिद्ध मामले के विपरीत, न केवल चोटी आयाम, बल्कि पहले प्रकाश उत्तेजना के बाद सभी वर्तमान मापदंडों (आईपी,एल, टी) परिवर्तन, मूल, पहले फ्लैश मूल्यों के लिए विशेषता घातीय समय पाठ्यक्रमों के साथ ठीक हो, जैसा कि कहीं और20की सूचना दी गई है। वर्तमान की विशेषता वाले सभी मापदंडों की यह भिन्नता क्रेफ़िश 1 , 2,22,23,24की दृश्य ट्रांसड्यूक्शन प्रणाली में दूसरे दूतों की भागीदारी को इंगित करती है .
इसके अतिरिक्त, और दिलचस्प बात यह है कि चित्रा 8 शो, एल, आईपीऔर टी की वसूली उस सर्कैडियन समय पर निर्भर करती है जिस पर प्रयोगों का एहसास होता है। इस घटना के आणविक आधार को निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है । बेशक, पैच क्लैंप जैसी किसी अन्य तकनीक का उपयोग करके इसी तरह की जानकारी प्राप्त करना संभव है। हालांकि, इंट्रासेलर परिवेश को अन्य तकनीकों में बहुत परेशान किया जा सकता है, और यह महत्वपूर्ण हो सकता है, उदाहरण के लिए, प्रोटीन, अमीनो एसिड, न्यूक्लियोटाइड्स जैसे आंतरिक तत्व, कई अन्य लोगों के बीच, विद्युत संकेत उत्पादन में या हार्मोन या न्यूरोमोडुलाटर्स के साथ बातचीत में प्रासंगिक भूमिका निभाते हैं।
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Disclosures
हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को डीजीगा-यूएनएएम IN224616-RN224616 अनुदान का समर्थन मिला। लेखक इस पांडुलिपि के अंग्रेजी भाषा के संस्करण को संपादित करने के लिए, यूएएम के Faculión de मेडिसिना, UNAM में डिविसिओन डी Investigación से वैज्ञानिक पेपर अनुवाद विभाग की प्रमुख श्रीमती जोफिना बोलाडो का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
Clampfit | Axon Instruments, Inc | Analysis software linked to pClamp | |
Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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