Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Desensibilisering och återvinning av kräftor fotoreceptorer vid leverans av en ljus stimulans

doi: 10.3791/56258 Published: November 9, 2019

Summary

Ett protokoll för studiet av desensibilisering och känslighet återhämtning av kräftor fotoreceptorer som en funktion av dygnsrytm tid presenteras.

Abstract

En metod för att studera desensibilisering och återhämtning av kräftor fotoreceptorer presenteras. Vi utförde intracellulära elektriska inspelningar av Rostnings celler i isolerade att med hjälp av diskontinuerliga enda elektrod-switchat spänning-klämma konfiguration. Först, med ett rakblad vi gjorde en öppning i dorsala hornhinnan för att få tillgång till näthinnan. Därefter satte vi in en glaselektrod genom öppningen, och penetrade en cell som rapporteras av inspelningen av en negativ potential. Membranpotentialen var fastspänd vid foto receptorns vilopotential och en ljus puls tillämpades för att aktivera strömmar. Slutligen var de två Light-Flash-protokollet används för att mäta nuvarande desensibilisering och återhämtning. Den första ljus-blixt utlöser, efter en fördröjning period, signaltransduktion Joniska strömmen, som efter att ha nått en topp amplitud sönderfaller mot en desensibiliserade tillstånd; den andra blixten, som appliceras med varierande tidsintervall, bedömer tillståndet för den ljusaktiverade kontruktans. För att karakterisera ljuset-framkallade ström, tre parametrar mättes: 1) latens (den tid som förflutit mellan ljus blixt leverans och det ögonblick då ström uppnår 10% av dess maximala värde); 2) toppström; och 3) desensibilisering tid konstant (exponentiell tidskonstant av den nuvarande sönderfalls fasen). Alla parametrar påverkas av den första pulsen.

För att kvantifiera återhämtning från desensibilisering, var förhållandet P2/P1 anställd kontra tid mellan pulser. P1 är toppströmmen frammanade av den första ljus-pulsen, och P2 är toppströmmen framkallat av den andra pulsen. Dessa data var monterade på en summa av exponentialfunktioner. Slutligen utfördes dessa mätningar som funktion av dygnsrytmen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att uppfattas som en visuell stimulans, måste ljus som når ögonen vara omvandlas till en elektrisk signal. Därför, i alla visuella organismer, utlöser ljus en transduktion Jon ström, vilket i sin tur ger en förändring i membranet potential Rostnings celler, den så kallade receptor potential. På grund av detta, ljuskänslighet i ögat beror främst på tillståndet i ljuset aktiverad conductance, som kan antingen vara tillgängliga för att aktiveras eller desensibiliseras.

I kräftfotoreceptorer utlöser ljus en långsam, övergående, jonisk ström1. Vid belysning uppstår transduktionströmmen efter en fördröjning eller fördröjning innan den når sitt maximum. därefter sönderfaller det, som transduktionkanalerna hamnar i ett okänsligare tillstånd där de inte svarar på ytterligare ljus stimulans2. Det är, ljus, förutom att aktivera transduktion nuvarande ansvarig för synen, inducerar också en övergående minskning av känsligheten hos fotoreceptor celler. Desensibilisering kan utgöra en allmän skyddsmekanism mot överexponering för en adekvat stimulans. Ögats känslighet för ljus återvinns som transduktionconductance återhämtar sig från desensibilisering.

Intracellulär inspelning är en användbar teknik för att mäta elektrisk aktivitet av retbara celler3,4,5,6,7,8. Även om intracellulär inspelning har blivit mindre frekvent med tillkomsten av patch-Clamp teknik9, är det fortfarande en bekväm metod när cellerna är antingen svårt att isolera, eller presentera en geometri som gör bildandet av plåstret-fastspänning Giga-tätningar svårt (dvstätningar eller täta kontakter mellan plåstret elektroden och membran med elektriskt motstånd i storleksordningen 109ohm). Exempel på de senare är spermier celler10 och fotoreceptor cellerna häri studeras. Enligt vår erfarenhet, Procambarus clarkii fotoreceptorer är svåra att isolera och hålla i primärkulturen; Dessutom är de tunna stavar som gör Giga-Seal formation svårt att uppnå. I intracellulära inspelningar, en skarp elektrod är avancerad i en cell som hålls på plats av den omgivande vävnaden. Elektroden hackas av den snabba switchkretsen på förstärkaren, så ström samplas mellan spännings pulser. Detta läge är känt som diskontinuerlig enelektrod spännings klämma (dSEVC-läge)11. Den höga resistensen (liten öppning) av elektroden hindrar det diffusionella utbytet mellan cellen och pipettlösningarna, vilket ger en minimal störning av den intracellulära miljö3. En potentiell nackdel med denna teknik är att insättning av elektroden kan ge en icke-selektiv läcka ström. Därför måste försiktighet iakttas för att undvika registrering från celler där läckageströmens storlek kan störa de avsedda mätningarna4,12.

Häri använder vi isolerade kräftor att för att bedöma desensibilisering och återhämtning av ljus-aktiverade Jon värmeledningsförmåga genom att utföra intracellulära elektriska inspelningar av fotoreceptor celler under spänning klämma villkor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Observera: experimenten följer lagarna för djurskydd i Mexiko.

1. experimentell inställning

  1. Allmänna anslutningar
    1. Anslut förstärkaren till en lämplig dator via en analog-till-digital-omvandlare och Använd ett oscilloskop för att övervaka experimentet (figur 1).
    2. Anslut photostimulatorn till A/D konverteras.
  2. Inspelnings kammare
    1. Placera inspelnings kammaren ovanpå ett vibrationsdämpande bord och lokalisera den i en Faradays bur.
      Obs: Detta förhindrar mekanisk vibration och elektriskt brus som kan påverka inspelningen. Vår Faraday bur var gjord av mörklagt trådnät. En hemmagjord, 2 mL, akryl inspelnings kammare används (figur 2).
    2. Förbered bad lösningen för att hålla preparatet vid liv13: 205 mm NaCl; 5 mM KCl; 2 mM MgSO4; 13 mM CaCl2; 5 mM Hepes-NaOH, pH 7,3.
      Anmärkning: lösningen omfattar inte dextros eller bubblande av 95% O2,5% Co2 blandningen eftersom försöksförfarandet är tillräckligt kort för att upptäcka skador genom den elektriska inspelningen (se steg 4.2.3 för fullständighet).
  3. Elektroder
    1. Använd en klo RID belagd elektrod med silvertråd som referenselektrod
      Obs: Silver klo RID beläggning är nödvändigt för att tillåta elektrod reaktionen: AgCl (s) + e↔ AG (s) + cl-.
    2. Sand en silvertråd (tjocklek ~ 1 mm, längd ~ 10 cm) med en fin grade Emery papper för att rengöra dess yta.
    3. Skölj silvertråden med destillerat vatten.
    4. Sänk ned den rena silvertråden i en 4-6% natriumhypokloritlösning (NaClO) tills den ser mörk ut (ca 20 min).
    5. Använd tunna glas pipetter fyllda med en elektrolytlösning (2,7 M KCl) som den intracellulära elektroden.
    6. Dra ett glas kapillärrör (invändig diameter ≈ 1 mm) med en Micro-pipett avdragare för att få en tunn spets med en liten öppning (0,01-0,1 μm)14.
    7. Fyll det dragna kapillärglaset med en 2,7 M KCl lösning. Fyll den först med kapillaritet (Sänk pipettspetsen i 2,7 M KCl-lösningen) och fyll sedan på hälften av pipetten med en fin injektionsnål. Om det behövs trycker du på elektrod pipetten för att eliminera luftbubblor.
    8. Anslut elektroden till hållaren. Anslut hållaren till förstärkarens huvudscen med förstärkaren. Placera elektrodhållaren-headstage med en stabil 3-D micromanipulator. Sänk elektroden tills bad lösningen täcker dess spets.
      Obs: elektroden måste ha en vertikal orientering
  4. Välj bryggläge för förstärkaren (i läges delen av förstärkaren, tryck på bryggknappen) och mät elektrod motståndet. Se till att motståndet är ca 50 MΩ11.
    Obs: denna elektrod storlek tillåter en god kvalitet elektrisk inspelning med begränsad skada på cellen.
  5. Null offset strömmen och kompensera kapacitiva transienter med hjälp av knappen håll position i avsnittet spännings klämma av förstärkaren, och kapacitans neutralisering knappen i mikroelektrod 1 avsnitt av förstärkaren.
  6. Superfusion system
    1. Häll bad lösningen (steg 1.2.2) i ett lämpligt kärl (en 250 mL serum flaska) och Anslut den till en bevattnings slang uppsättning (3,2 mm av invändig diameter), vilket ansluter inspelnings kammaren. Använd ett gravitations drivet superfusion-system. Reglera flödeshastigheten till ~ 0,5 mL/s.
    2. Anslut kammaren till en sug apparat. Reglera lösnings sug systemet på ett sådant sätt att den totala volymen av inspelnings kammaren inte varierar. Använd en vakuumpump för sugning.
      Obs: en konstant volym i inspelnings kammaren är viktigt att hålla strös kapare konstant hela experimentet.

2. biologiskt material

Obs: Använd vuxna kräftfiskar P. clarkii (7-10 cm lång) i den intermolt skede av otydligt kön.

  1. Cirkadisk tid
    1. En månad före experimenten, underhålla 100 kräftdjur under en 12-h ljus/12-h mörk cykel15 (vitt ljus, 2,4 kW/m2).
      Obs: en månad är tillräckligt med tid för att synkronisera kräftpopulationen.
    2. Bestäm dygnsrytmen hos kräftpopulationen genom att bedöma amplituden hos elektroretinogram av fem slumpmässigt utvalda djur15.
      Anmärkning: 0 h dygnsrytm (CT 0) anger början av en subjektiv dag, d.v.s.den tid under vilken en organism normalt är aktiv16,17,18,19 (figur 3). Kräftorna är ett nattligt djur, så under en 12-h ljus/12-h mörk cykel, är det aktivt under den mörka fasen.
  2. Eyestalk isolering förfarande
    1. Vid önskad dygnsrytm, söva en utvald kräftor genom nedsänkning i kranvatten vid 0-4 ° c, för 15 min.
    2. Med hjälp av en fin sax, lossa eyestalk från basen.
    3. Få tillgång till näthinnan med ett rakblad för att göra en öppning (~ 1-mm2) i dorsala hornhinnan.
    4. Placera eyestalk i mitten av inspelnings kammaren (hålet täckt med silikon) med tillgång öppningen till näthinnan på toppen av kammaren.
  3. Håll eyestalk under konstant mörker för 20 min.
    Obs: 20 min är tillräckligt med tid för att fotoreceptor cellen ska vara helt mörk anpassad.

3. fotoreceptor impaling

  1. Sätt mikroelektroden och eyestalk längsgående axel parallellt på ett sådant sätt att mikroelektroden är centrerad för tillgång till näthinnan. Använd ett stereoskopisk Mikroskop (10X) för att placera enheterna i rätt konfiguration.
  2. Övervaka spännings skillnaden mellan referens-och inspelnings elektroderna genom att välja bryggläge11 på förstärkaren.
  3. Sänk elektroden i badet och därefter placera den rakt över näthinnan.
  4. Flytta bort mikroskopet och placera photostimulator lampan parallellt med eyestalk längsgående axel.
    Anmärkning: avståndet mellan lampan och superfusion-kammaren är cirka 15 cm.
  5. Sänk långsamt mikroelektroden tills ett plötsligt spänningsfall upptäcks.
    Anmärkning: ett spänningsfall på omkring − 50 mV indikerar impalement av en frisk fotoreceptor cell.
  6. Leverera ett test ljus-blixt (vitt ljus, 7,2 kW/m2, 10 μs varaktighet) för att registrera foto receptorns receptor potential.
    Notera: foto receptorns receptor potential är en depolariserande potential på 10-15 mV-amplitud och 300 MS-duration (figur 4).

4. elektrisk inspelning

  1. Se till att fotoreceptor cellerna är helt anpassade till mörka förhållanden (se steg 2,3).
    1. Leverera en test-ljus blixt varje 2 min. automatisera tiden mellan blixtarna genom att välja ett adekvat värde (120 s) av "tid mellan episoder" i datainsamlingsprogrammet.
      Anmärkning: 2 min är den tid som krävs för att möjliggöra total återhämtning av de strömmar som ligger bakom foto receptorns elektriska respons.
    2. Övervaka vilomembranpotentialen, liksom amplituden och varaktigheten av receptorns potential. Anta att fotoreceptorn är helt anpassad när membranet potential, amplitud, och varaktigheten av receptorn potential förblir oförändrad. Eyestalks som tidigare hållits under konstant mörker i 20 min (steg 2,3) slutför anpassningen på ca 5 min.
    3. Sluta stimulera cellen 2 min innan du spelar in ljus-eliciterade ström.
  2. Aktuella inspelnings
    1. Kläm fastspänningen vid det uppmätta vilo membranet potentiella värdet av cellen genom att välja "hålla amplitud" i datainsamling programvara (i vågform på den analoga utgångskanal avsnitt).
    2. Välj dSEVC-läget för förstärkaren. I läges delen av förstärkaren väljer du SEVC-knappen och kopplar spaken till Discont SEVC-positionen.
    3. Ställ in växlingshastigheten på 500-1000 Hz (med hjälp av förstärkarens hastighets justeringsknapp), som bestäms av hastigheten på elektroden11.
    4. Leverera en ljus-blixt, och observera den framkallat Jon tillströmningen.
      Anmärkning: Detta är den ljus-eliciterade eller signaltransduktion ström (figur 5).
    5. Återgå till bryggläge på förstärkaren och spela in en receptor potential genom att skicka en ljus blixt (se avsnitt 3). Se till att fotoreceptor cellen är helt anpassad till mörka förhållanden. Mät receptorns potentiella egenskaper (amplitud och varaktighet) och jämför med de första mätningarna. Anta att den spetsad fotoreceptor cellen är en frisk cell om de har samma egenskaper.
      Anmärkning: efter eyestalk ablation är biologisk beredning livskraftig under följande 2 timmar.
  3. Två puls protokoll: Mät återhämtningen från desensibilisering med ett två Light-Flash-protokoll.
    Obs: de två Light-Flash-protokollet liknar den standard två-Pulse spännings protokoll som används för att mäta återhämtning från inaktivering av spännings-gated kanaler20. Den första ljus-blixten orsakar en tillfällig förändring i känsligheten hos fotoreceptor cellen och den andra blixten utvärderar tillståndet för den ljus-aktiverade conductance.
    1. Leverera ett par ljuspulser. Applicera den andra blixten efter ett önskat tidsintervall (från 300 MS till 2 min).
    2. Digitalisera strömmar vid 10 KHz provtagning med datainsamlingsprogram och spara data för off-line analys11.
      Obs: en tabell med konfigurationsvärdena för programvaran ingår som tilläggsmaterial.

5. analys av data

  1. Kinetik av tända-framkallade strömmen
    1. Mät tre aktuella parametrar: aktiverings fördröjning L, den tid som förflutit från ljus blixtens leverans till dess att strömmen uppnår 10% av dess maximala amplitud (figur 5). maximal ström amplitud Ip; och desensibilisering tidskonstant T. Mät desensibiliseringstidskonstant (Τ) genom att montera den aktuella sönderfalls fasen till:
      Equation 1
      där, A =-I (t = 0) är en positiv konstant (figur 5).
  2. Desensibilisering och återhämtning
    Anmärkning: återhämtning från desensibilisering bedömdes som förhållandet p2/p1, där p1 är den relevanta parametern (antingen L, Ipeller T) för kontroll strömmen, och p2 är motsvarande parameter för den andra test strömmen.
    1. Plot p2/p1 (antingen L, Ipeller T) som en funktion av tiden mellan pulser.
    2. Beroende på parametern, passa in punkterna i varje komplott för att:
      Equation 2
      eller för att:
      Equation 3
    3. Använd ett lämpligt statistiskt test för att bestämma antalet exponentiella termer som krävs för att passa experimentella data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För det första erhålls en representativ receptor risk för kräftor-fotoreceptorceller (figur 4). Efteråt användes ett test ljus blixt för att utlösa ljus transduktionströmmen (figur 5). Den katjontransduktion ström1 aktiveras efter en fördröjning, når en maximal och därefter långsamt droppar i en absorberande desensibiliserade tillstånd som det sakta återhämtar sig.

Det är rimligt att anta att den långa latens L (tiotals millisekunder) av ljus-eliciterade strömmen beror på de biokemiska händelser som utlöses av ljus, som involverar G-protein vägar. Amplituden av toppströmmen Ip beror på andelen kanaler som är tillgängliga för att öppnas, och den relativa frekvensen av nuvarande aktivering och inaktivering. Den senare bedöms av den konstanta tids konstanten T.

Å andra sidan, L återhämtning bör relateras till graden av återhämtning av den biokemiska ljusöverledningen kaskad; Jagp återhämtning beror både på de inneboende överensstämande förändringar av de proteiner som ansvarar för Jon konvektans, och om graden av återhämtning av den biokemiska ljusöverledningen kaskad. Det sistnämnda skulle också kunna relateras till indrivning av T. Dessutom tyder den parallella variationen av L och T på att en gemensam biokemisk faktor (eller faktorer; t. ex. kanalens fosforylationsstatus) kan påverka båda parametrarna1.

Ett protokoll med två blixtar (figur 6) applicerades därefter för att fastställa kinetiken för återhämtning från desensibilisering (figur 7) vid olika tidpunkter i dygns cykeln (figur 8).

Figure 1
Figur 1. Linjediagram över utrustnings inställningarna. Anslutningar mellan persondator (PC) (a), gränssnitt (B), oscilloskop (C), spännings kläm förstärkare (D), fotostimulator (E), och headstage/hållare/mikroelektrod system för utrustningens inställning (F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Av deninvändiga kammaren. a) inspelnings kammaren i en Faradays bur med dess superfusion-sug-system. Det är också visat positionen för photostimulator, Mikroskop, och micromanipulator-headstage-microelektrod system. B) diagram över inspelnings kammaren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Elektroretinogram (ERG) amplitud. Akräftor. B) representativ handling av ERG-amplituden för kräftfotoreceptorer (data togs var 20: e minut) som en funktion av dygnsrytmen. Förekomsten av en dygnsrytm kan tydligt uppskattas. Observera att i början av aktiviteten sammanfaller med dygnsrytm tid 0 för varje cykel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Receptor potential. Representativ receptor potential framkallat av en ljus blixt (vitt ljus, 7,2 kW/m2, 10 μs varaktighet). Denna siffra har modifierats från Barriga-Montoya, C, et al. 2. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Transduction ström. Representativ transduktionström utlöst av en ljus blixt (vitt ljus, 7,2 kW/m2, 10 μs varaktighet) appliceras med spänningen hålls konstant på Rostnings vilande potential. Aktuell latens, toppamplitud och desensibiliseringsfas indikeras. Denna siffra har modifierats från Barriga-Montoya, C, et al. 2. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Två-pulsera protokoll. Strömmar som framkallas av ett par ljusblixtar. Ljus stimuli tillämpades vid 0 MS och 700 MS (indikeras med pilar). Denna siffra har modifierats från 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. Återhämtning från desensibilisering. (A) Ip: Peak ström återhämtning, (B) L: latens återhämtning, (C) T: desensibilisering tid konstant T återhämtning. Experiment utfördes vid 0 h CT. Denna siffra har modifierats från Barriga-Montoya, C, et al. 2. resultaten uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen för antalet experiment (n = 11). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8. Återhämtning från desensibilisering som en funktion av CT. (A) Ip återhämtning, (B) L återhämtning, (C) Т återhämtning. (D) viktade tidskonstanter. Bifasiska processer markeras med en pil. Denna siffra har modifierats från Barriga-Montoya, C, et al. 2. resultaten uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen för antalet experiment (n = 11). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande tabell 1. Vänligen klicka här för att se denna tabell (Högerklicka för att ladda ner).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kräftan har visat sig vara en utmärkt modell på grund av dess förmåga att överleva under icke-naturliga förhållanden. Det finns enkel tillgång till in vivo och in vitro elektrofysiologiska analyser. Dessutom är kräftdjur en gynnsam grupp för neurobiologisk forskning inom området komparativ chronobiology21.

I detta dokument visas studiet av desensibilisering och återhämtning av ljus-aktiverad transduktion-ström av kräftor-fotoreceptorceller med hjälp av den intracellulära inspelningstekniken. Men vi tror att samma teknik kan anpassas till andra ryggradslösa visuella system så länge det är möjligt att komma åt fotoreceptor celler.

För att uppnå godtagbara experimentella resultat är det viktigt att överväga några kritiska steg i protokollet, inklusive att eliminera elektriskt brus genom att jorda all utrustning, bygga en elektrod med en tillräckligt fin spets och se till att photoreceptorcellen är fullständigt mörker-anpassad, för tvåna-pulserar protokollet börjar.

Trots begränsningarna av intracellulär inspelning såsom skador av membran, är det möjligt att gå vidare och få detaljerad information om den biofysiska mekanismen bakom kräftor (eller annan djur) fotoreceptor elektrisk signal. Liksom i andra ryggradslösa djur fotoreceptorer, i kräftor fotoreceptorer, utlöser ljus en graderad depolarisering, eller receptor potential, som produceras av aktiveringen av en katjoniska conductance. Den ljus-aktiverade värmeledningsförmåga börjar efter en fördröjning eller latens, och efter att ha nått sin maximala amplitud, det långsamt sjunker efter en exponentiell tid kurs, som kanalerna in en absorberande desensibiliserade tillstånd.

Kinetiken av återhämtning från Desensibilisering av ljus-framkallade Jon värmeledningsförmåga av kräftor erhölls med hjälp av en två-ljus blixt protokoll (liknande den vanliga två-spänning puls protokoll som används för att studera återhämtning från inaktivering av spännings-gated kanaler)20. Intressant, och i motsats till det välkända fallet av spännings-gated kanaler, inte bara den högsta amplituden, men också alla aktuella parametrar (Ip, L, T) ändras efter det första ljuset stimulus, återhämta sig med karakteristiska exponentiell tid kurser till den ursprungliga, första Flash-värden, som rapporteras på annat håll20. Denna variant av alla de parametrar som kännetecknar den aktuella indikerar deltagandet av andra budbärare i det visuella transduktionssystemet av kräftor1,2,22,23,24.

Dessutom, och intressant, som figur 8 visar, återvinning av L, jagp, och T beror på dygnsrytmen tid då experiment realiseras. Ytterligare studier behövs för att fastställa den molekylära grunden för detta fenomen. Naturligtvis är det möjligt att få liknande information med hjälp av en annan teknik, såsom patch Clamp. Men den intracellulära miljön kan störas mycket i andra tekniker, och detta kan vara kritiskt, om till exempel interna element som proteiner, aminosyror, nukleotider, bland många andra, spelar en relevant roll i den elektriska signalen generationen eller i samspelet med hormoner eller Neuromodulatorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 Grant. Författarna vill tacka fru Josefina Bolado, chef för avdelningen för vetenskaplig pappers översättning, från División de Investigación på Facultad de Medicina, UNAM, för att redigera den engelskspråkiga versionen av detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axoclamp2A  Axon Instruments Inc Amplifier
Digidata 1200 Interface Axon Instruments Inc Digitizer
Oscilloscope TDS430A Tektronix Analogic Oscilloscope
Photostimulator PS33 Plus Grass Lamp
Puller PC-100 Narishige Micropipette Puller
Puller P-97 Sutter Instruments Micropipette Puller
Glass Capillary Tube Kimax-51 Kimble Products 34502 0.8, 1.10, 100 mm
HS-2 Headstage Axon Instruments Inc Headstage
Micromanipulator MX-4 Narishige Mechanical Micromanipulator
Stereoscopic Microscope Zeiss Microscope
pClamp Axon Instruments Inc Data acquisition software for digidata 1200 interface
Clampfit Axon Instruments, Inc Analysis software linked to pClamp
Origin OriginLab Corp. Data analysis and graphing software
Sodium Chloride Sigma S7653 >99.5%
Potassium Chloride Sigma P-9333 Minimum 99%
Magnesium Sulfate Sigma M7506 Minimum 99.5%
Calcium Chloride Sigma C5080 Minimum 99.0%
Hepes Sigma H7523 >99.5%
Sodium Hydroxide Sigma S8045 98.00%
Sodium hypochlorite solution Sigma 425044 Available chlorine, 10-15% 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157, (4), 338-345 (2010).
  2. Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
  3. Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
  4. Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. 44-91 (2012).
  5. Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142, (2), 199-202 (1981).
  6. Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
  7. Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64, (3), 318-323 (1969).
  8. Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17, (3), 353-368 (2000).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, (2), 85-100 (1981).
  10. Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
  11. Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. (1990).
  12. Single-channel recording. Sakmann, B. Springer Science & Business Media. (2013).
  13. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34, (4), 428-432 (1936).
  14. Oesterle, A. pipette cookbook. Sutter Instruments. Novato, CA. 97 (2008).
  15. Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74, (3), 711-714 (1983).
  16. Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3, (8), 591-605 (2002).
  17. Pittendrigh, C. S. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. Aschoff, J. North Holland, Amsterdam. 277-297 (1965).
  18. Pittendrigh, C. S. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. Aschoff, J. Plenum, New York. 94-124 (1981).
  19. Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25, (2), 85-93 (2001).
  20. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. 507, Sinauer. Sunderland, MA. (2001).
  21. Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
  22. Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
  23. Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183, (4), 411-417 (1998).
  24. Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13, (3), 539-547 (1996).
Desensibilisering och återvinning av kräftor fotoreceptorer vid leverans av en ljus stimulans
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Picones, A., Hernández-Cruz, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus. J. Vis. Exp. (153), e56258, doi:10.3791/56258 (2019).More

Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Picones, A., Hernández-Cruz, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus. J. Vis. Exp. (153), e56258, doi:10.3791/56258 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter