Summary
En protokol til undersøgelse af desensibilisering og følsomhed nyttiggørelse af krebs-foto som funktion af cirkadiske tid er præsenteret.
Abstract
En metode til at studere desensibilisering og nyttiggørelse af krebs foto er præsenteret. Vi udførte intracellulære elektriske optagelser af fotoreceptor-celler i isolerede øjestalker ved hjælp af den diskontinuerlige enkelt elektrode koblede spændings klemme konfiguration. For det første, med en barberkniv gjorde vi en åbning i dorsale hornhinden for at få adgang til nethinden. Derefter indsatte vi en glaselektrode gennem åbningen og trængte ind i en celle som rapporteret ved optagelsen af et negativt potentiale. Membranpotentialet blev fastspændt på photoreceptors hvile potentiale, og der blev anvendt en lys impuls til at aktivere strømninger. Endelig var de to Light-flash-protokollen ansat til at måle nuværende desensibilisering og nyttiggørelse. Den første Light-flash udløser, efter en mellemliggende periode, den transduktionsionstrøm, som efter at have nået en spids amplitude henfalder mod en desensibiliseret tilstand; den anden blitz, der anvendes med varierende tidsintervaller, vurderer tilstanden af den lysaktiverede ledning. For at karakterisere den lys-fremkaldte strøm, tre parametre blev målt: 1) ventetid (den tid, der er gået mellem lys flash levering og det øjeblik, hvor strømmen opnår 10% af sin maksimale værdi); 2) spidsstrøm; og 3) desensibiliserings tiden konstant (eksponentiel tidskonstant for den aktuelle henfalds fase). Alle parametre påvirkes af den første puls.
For at kvantificere genfinding fra desensibilisering blev forholdet P2/P1 anvendt i forhold til tiden mellem pulser. P1 er den spidsstrøm, der er fremkaldt af den første lysimpuls, og P2 er topstrømmen fremkaldt af den anden puls. Disse data blev monteret på en sum af eksponentielle funktioner. Endelig blev disse målinger udført som funktion af cirkadiske tid.
Introduction
For at blive opfattet som en visuel stimulus, lys nå øjnene skal være transduceret ind i et elektrisk signal. Derfor, i alle visuelle organismer, lys udløser en transduktionsion-strøm, som igen producerer en ændring i membranpotentialet af fotoreceptor celler, den såkaldte receptor potentiale. På grund af dette, den lysfølsomhed af øjet primært afhænger af tilstanden af lyset aktiveret ledning, som kan enten være til rådighed til at blive aktiveret eller desensibiliseret.
I Krebs photoreceptors udløser lys en langsom, forbigående, ionisk strøm1. Ved belysning opstår transduktionsstrømmen efter en forsinkelse eller ventetid, inden den når sit maksimum. derefter henfalder det, da transduktion kanaler falde i en desensibiliseret tilstand, hvor de ikke reagerer på yderligere lys stimulus2. Det vil, ud over at aktivere transduktionsstrømmen ansvarlig for synet, også inducerer en forbigående formindskelse af følsomheden af fotoreceptor celler. Desensibilisering kan repræsentere en generel beskyttende mekanisme mod overeksponering for en passende stimulus. Øjets følsomhed over for lys er genvundet, da transduktionskonduktiviteten genopretter fra desensibilisering.
Intracellulær optagelse er en nyttig teknik til måling af elektrisk aktivitet af overgearet celler3,4,5,6,7,8. Selvom intracellulær optagelse er blevet mindre hyppig med fremkomsten af plasteret-klemme teknik9, det er stadig en bekvem tilgang, når cellerne er enten vanskelige at isolere, eller præsentere en geometri, der gør dannelsen af patch-spænde Giga-sæler vanskelige (dvs.sæler eller tætte kontakter mellem plasteret elektrode og membraner med elektrisk modstand i rækkefølgen af 109ohm). Eksempler på sidstnævnte er sædceller10 og fotoreceptor cellerne heri undersøgt. Det er vores erfaring, procambarus clarkii foto er svære at isolere og holde i primær kultur; Derudover er de tynde stænger, der gør Giga-segl dannelse vanskeligt at opnå. I intracellulære optagelser er en skarp elektrode fremskreden i en celle, der holdes på plads af det omgivende væv. Elektroden er hakket af forstærkeren højhastigheds koblings kredsløb, så der udtages prøver af strøm mellemspændings pulser. Denne tilstand er kendt som diskontinuert single-elektrode spændings klemme (dSEVC mode)11. Den høje modstand (lille åbning) af elektroden hindrer diffusions udvekslingen mellem cellen og pipette opløsningerne, hvilket giver en minimal forstyrrelse af det intracellulære Milieu3. En potentiel ulempe ved denne teknik er, at elektrodeindføring kan producere en ikke-selektiv lækage strøm; Derfor skal der udvises forsigtighed for at undgå optagelse fra celler, hvor størrelsen af lækage strømmen kan forstyrre de tilsigtede målinger4,12.
Heri bruger vi isolerede Krebs-eyestalks til at vurdere desensibilisering og genopretning af den lysaktiverede ionledning ved at udføre intracellulære elektriske optagelser af fotoreceptor-celler under spændings klemme forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: forsøgene overholder lovene om dyrebeskyttelse i Mexico.
1. eksperimentel opsætning
- Generelle tilslutninger
- Tilslut forstærkeren til en passende computer via en analog-til-digital-konverter, og brug et oscilloskop til at overvåge eksperimentet (figur 1).
- Tilslut photostimulatoren til A/D konverteret.
- Optagelse kammer
- Placer optagelses kammeret oven på et Vibrationsdæmpende bord, og Find det inde i et Faraday-bur.
Bemærk: Dette forhindrer mekanisk vibration og elektrisk støj, der kan påvirke optagelsen. Vores Faraday bur var lavet af mørkede trådnet. Der anvendes et hjemmelavet 2 mL akryl optagelses kammer (figur 2). - Forbered badet løsning til at holde præparatet i live13: 205 mm NaCl; 5 mM KCl; 2 mM MgSO4; 13 mM CaCl2; 5 mM Hepes-NaOH, pH 7,3.
Bemærk: opløsningen omfatter ikke dextrose eller boblende med 95% O2,5% Co2 -blanding, fordi den eksperimentelle procedure er kort nok til at detektere skader ved den elektriske optagelse (Se trin 4.2.3 for fuldstændigheden).
- Placer optagelses kammeret oven på et Vibrationsdæmpende bord, og Find det inde i et Faraday-bur.
- Elektroder
- Brug en klor belagt sølv-trådelektrode som referenceelektrode
Bemærk: sølvklorid belægning er nødvendig for at tillade elektrode reaktionen: AgCl (s) + e−↔ AG (s) + CL-. - Sand en sølv wire (tykkelse ~ 1 mm, længde ~ 10 cm) med en fin kvalitet Emery papir for at rense sin overflade.
- Skyl den sølvfarvede ledning med destilleret vand.
- Nedsænk den rene sølv tråd i en 4-6% natriumhypochlorit opløsning (NaClO), indtil den ser mørk ud (ca. 20 minutter).
- Brug tynde glas pipetter fyldt med en elektrolyt opløsning (2,7 M KCl) som den intracellulære elektrode.
- Træk et glas kapillar rør (indvendig diameter ≈ 1 mm) med en Micro-pipette aftrækker for at opnå en tynd spids med en lille åbning (0,01-0,1 μm)14.
- Fyld det trak kapillar glas med en 2,7 M KCl opløsning. Fyld den først med kaplaritet (Nedsænk pipettespidsen i 2,7 M KCl-opløsningen), og fyld derefter halvdelen af pipetten med en fin injektionskanyle. Tap om nødvendigt på elektrode pipetten for at eliminere luftbobler.
- Tilslut elektroden til holderen. Tilslut holderen til forstærkeren hovedfase med forstærkeren. Placer Elektrodeholderen-hovedstadiet med en stabil 3-D micromanipulator. Sænk elektroden, indtil badopløsningen dækker spidsen.
Bemærk: elektroden skal have en lodret retning
- Brug en klor belagt sølv-trådelektrode som referenceelektrode
- Vælg forstærkerens brotilstand (i afsnittet tilstand af forstærkeren skal du trykke på knappen Bridge) og måle elektrode modstanden. Sørg for, at modstanden er omkring 50 MΩ11.
Bemærk: denne elektrode størrelse tillader en elektrisk optagelse af god kvalitet med begrænset beskadigelse af cellen. - Null forskydnings strømmen og kompensere kapacitive transienter ved hjælp af knappen Holding position i forstærkeren sektions spændings klemme og kapacitans Neutraliserings knappen i mikroelektrode 1-delen af forstærkeren.
- Super fusion system
- Hæld bade opløsningen (trin 1.2.2) i en egnet beholder (en 250 mL serum flaske), og Tilslut den til et kunstvandings slange sæt (3,2 mm intern diameter), således at optage kammeret tilsluttes. Brug en tyngdekraften drevet super fusion system. Regulere strømningshastigheden til ~ 0,5 mL/s.
- Tilslut kammeret til en sugeanordning. Regulere opløsningen suge system på en sådan måde, at den samlede volumen af optage kammeret ikke varierer. Brug en vakuumpumpe til sugning.
Bemærk: en konstant lydstyrke i optagelses kammeret er vigtig for at holde omstrejfende kapacitanser konstant i hele eksperimentet.
2. biologisk materiale
Bemærk: Brug voksen crayfishes P. clarkii (7-10 cm lang) i intermolt fase af utydelig sex.
- Cirkadiske tid
- En måned før forsøgene, vedligeholde 100 Krebs under en 12-h lys/12-h mørk cyklus15 (hvidt lys, 2,4 kW/m2).
Bemærk: en måned er tilstrækkelig tid til at synkronisere populationen af krebs. - Bestem den cirkadiske tid for Krebs bestanden ved at vurdere amplituden af elektroretinogrammer af fem tilfældigt udvalgte dyr15.
Bemærk: 0 timer cirkadisk tid (CT 0) angiver begyndelsen på en subjektiv dag, dvs., hvor en organisme normalt er aktiv16,17,18,19 (figur 3). Krebs er en natlig dyr, så under en 12-h lys/12-h mørk cyklus, det er aktiv i den mørke fase.
- En måned før forsøgene, vedligeholde 100 Krebs under en 12-h lys/12-h mørk cyklus15 (hvidt lys, 2,4 kW/m2).
- Eyestalk-isolations procedure
- På den ønskede cirkadiske tid anæstetisere en udvalgt Krebs ved nedsænkning i ledningsvand ved 0-4 °C, i 15 min.
- Ved hjælp af en fin saks løsnes øjestalk fra basen.
- Få adgang til nethinden ved hjælp af en barberkniv til at gøre en åbning (~ 1-mm2) i dorsale hornhinden.
- Placer øjestalk i midten af optagelses kammeret (hullet dækket med silikone) med adgangs åbningen til nethinden på toppen af kammeret.
- Hold øjestalk under konstant mørke i 20 min.
Bemærk: 20 min er tilstrækkelig tid til, at fotoreceptor-cellen er fuldt ud mørkt tilpasset.
3. photoreceptor impaling
- Sæt mikroelektroden og øjestandens langsgående akse parallelt på en sådan måde, at mikroelektroden er centreret for adgang til nethinden. Brug et stereoskopisk mikroskop (10X) til at placere enhederne i den korrekte konfiguration.
- Overvåg spændingsforskellen mellem reference-og optagelses elektroderne ved at vælge brotilstand11 på forstærkeren.
- Sænk elektroden i badet og Placer den derefter lige over nethinden.
- Flyt mikroskop væk, og Placer photostimulator lampen parallelt med øjestandens langsgående akse.
Bemærk: afstanden mellem lampe og super fusions kammer er ca. 15 cm. - Sænk langsomt mikroelektroden, indtil der opdages et pludseligt spændingsfald.
Bemærk: et spændingsfald på omkring − 50 mv indikerer, at en sund fotoreceptor-celle er blevet Spidning på pæl. - Levere en test Light-Flash (hvidt lys, 7,2 kW/m2, 10 μs varighed) for at registrere photoreceptors receptor potentiale.
Bemærk: photoreceptors receptor potentiale er et depolariserende potentiale på 10-15 mV amplitude og 300 MS varighed (figur 4).
4. elektrisk optagelse
- Sørg for, at fotoreceptor-cellerne er helt tilpasset til mørke forhold (Se trin 2,3).
- Levere en test-lys flash hver 2 min. Automatiser tiden mellem blinker ved at vælge en passende værdi (120 s) af "tid mellem episoder" i dataindsamlingen software.
Bemærk: 2 min er den nødvendige tid til at tillade den totale genopretning af strømmen underliggende photoreceptors elektriske respons. - Overvåge hvile membranens potentiale, samt amplituden og varigheden af receptor potentialet. Antag, at photoreceptoren er fuldstændig tilpasset, når membranens potentiale, amplitude og varighed af receptor potentialet forbliver uændret. Eyestalks tidligere holdt under konstant mørke i 20 min (trin 2,3) fuldføre deres tilpasning i ca. 5 min.
- Stop med at stimulere cellen 2 min før optagelsen af den lyse strøm.
- Levere en test-lys flash hver 2 min. Automatiser tiden mellem blinker ved at vælge en passende værdi (120 s) af "tid mellem episoder" i dataindsamlingen software.
- Aktuel optagelse
- Fastgør spændingen ved den målte hvile membran potentielle værdi af cellen ved at vælge "Holding amplitude" i dataindsamlingen software (i bølgeform på analog udgang kanal sektion).
- Vælg dSEVC-tilstanden for forstærkeren. I afsnittet tilstand af forstærkeren skal du vælge knappen SEVC og skiftegrebet til Discont SEVC-positionen.
- Indstil koblings hastigheden til 500-1000 Hz (ved hjælp af justeringsknappen på forstærkeren), som bestemmes af elektrodens hastighed11.
- Levere en lys-flash, og observere den fremkaldte ion tilstrømning.
Bemærk: Dette er den lys-fremkaldte eller transduktionsstrøm (figur 5). - Vend tilbage til broen tilstand på forstærkeren og Optag en receptor potentiale ved at sende en lys flash (se punkt 3). Sørg for, at fotoreceptor cellen er helt tilpasset til mørke forhold. Måle receptor potentielle karakteristika (amplitude og varighed) og sammenligne med de første målinger. Antag, at den Impaled fotoreceptor celle er en sund celle, hvis de har de samme egenskaber.
Bemærk: efter fjernelse ablation er biologisk præparat levedygtigt i løbet af følgende 2 timer.
- To Pulse Protocol: mål inddrivelse fra desensibilisering med en to lys-flash-protokol.
Bemærk: de to lys-flash-protokollen svarer til standard to-Pulse spænding protokol, der anvendes til at måle opsving fra inaktivering af spændings-gated kanaler20. Den første lys-flash forårsager en midlertidig ændring i følsomheden af fotoreceptor celle og den anden flash evaluerer tilstanden af den lys-aktiverede ledning.- Levere et par lypulser. Påfør den anden blitz efter et ønsket tidsinterval (fra 300 MS til 2 min).
- Digitalisere strømmen ved 10 KHz sampling med data Acquisition software og gemme data til off-line analyse11.
Bemærk: en tabel med konfigurations værdierne for softwaren er inkluderet som supplerende materiale.
5. data analyse
- Den lys-fremkaldte aktuelle kinetik
- Mål tre aktuelle parametre: aktiverings ventetid L, den tid, det har gået fra lys-flash-levering, indtil strømmen opnår 10% af den maksimale amplitude (figur 5); Peak eller maksimal aktuel amplitude Ip; og desensibilisering tid konstant T. måle desensibiliserings tiden konstant (Τ) ved at montere den nuværende forfald fase til:
hvor, A =-I (t = 0) er en positiv konstant (figur 5).
- Mål tre aktuelle parametre: aktiverings ventetid L, den tid, det har gået fra lys-flash-levering, indtil strømmen opnår 10% af den maksimale amplitude (figur 5); Peak eller maksimal aktuel amplitude Ip; og desensibilisering tid konstant T. måle desensibiliserings tiden konstant (Τ) ved at montere den nuværende forfald fase til:
- Desensibilisering og genoprettelse
Bemærk: genfinding fra desensibilisering blev vurderet som forholdet p2/p1, hvor p1 er den relevante parameter (enten L, ipeller T) for kontrol strømmen, og p2 er den tilsvarende parameter for den anden test-strøm.- Plot p2/p1 (enten L, Ipeller T) som funktion af tiden mellem bælgfrugter.
- Afhængigt af parameteren skal du tilpasse punkterne i hvert plot til:
eller til:
- Brug en passende statistisk test til at bestemme antallet af eksponentielle termer, der kræves for at passe til forsøgsdataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For det første opnås et repræsentativt receptor potentiale af krebs-fotoreceptor-celler (figur 4). Derefter blev der anvendt en testlampe til at udløse lystransduktionsstrømmen (figur 5). Den kationiske transduktionsstrøm1 aktiverer efter en forsinkelse, når en maksimal og derefter langsomt falder i en absorberende desensibiliseret tilstand, hvorfra den langsomt genopretter.
Det er rimeligt at antage, at den lange ventetid L (snesevis af millisekunder) af den lyse-fremkaldte strøm afhænger af de biokemiske hændelser udløst af lys, som involverer G-protein veje. Amplituden af peak Current Ip afhænger af den brøkdel af kanaler til rådighed, der skal åbnes, og de relative satser for aktuel aktivering og inaktivering. Sidstnævnte vurderes ved forfald tid konstant T.
På den anden side bør L-opsvinget være relateret til restitutionssatsen for den biokemiske fototransduktionskaskade; Ip Recovery afhænger både af de iboende konformationelle ændringer af de proteiner, der er ansvarlige for ionledning, og på hastigheden af inddrivelse af den biokemiske phototransduction kaskade. Sidstnævnte kunne også være relateret til inddrivelse af T. Desuden tyder den parallelle variation af L og T på, at en fælles biokemisk faktor (eller faktorer; f. eks. den fosforylerings tilstand af kanalen) kan påvirke begge parametre1.
En to-flash-protokol (figur 6) blev efterfølgende anvendt til at bestemme kinetikken af nyttiggørelse fra desensibilisering (figur 7) på forskellige tidspunkter i døgnrytmen (figur 8).
Figur 1. Linjediagram over udstyrs opsætningen. Forbindelser mellem personlig computer (PC) (A), grænseflade (B), oscilloskop (C), spændings klemme forstærker (D), photostimulator (E) og hovedstadiet/holderen/mikroelektrode systemet i udstyrs opsætningen (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Etkammer. a) optage kammeret i et Faraday-bur med et sugeindsugningssystem. Det er også vist positionen af photostimulator, mikroskop, og micromanipulator-headstage-mikroelektrode system. B) diagram over optagelses kammeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Elektroretinogram (ERG) amplitude. A) krebs. (B) repræsentativt plot af ERG amplitude af krebs foto (data blev taget hver 20 min) som en funktion af døgnrytmen tid. Eksistensen af en døgnrytme kan være klart værdsat. Bemærk, at for hver cyklus er aktivitetens begyndelse sammenfaldende med cirkadisk tid 0. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Receptor potentialet. Repræsentativ receptor potentiel fremkaldt af et let blink (hvidt lys, 7,2 kW/m2, 10 μs varighed). Dette tal er blevet ændret fra Barriga-Montoya, C, et al. 2. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Transduktionsstrøm. Repræsentativ transduktionsstrøm udløst af et let blink (hvidt lys, 7,2 kW/m2, 10 μs varighed) anvendt med den spænding, der holdes konstant ved photoreceptors hvile potentiale. Aktuel ventetid, spids amplitude og desensibiliserings fase er indikeret. Dette tal er blevet ændret fra Barriga-Montoya, C, et al. 2. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. To-Pulse protokol. Strømme fremkaldt af et par lys blinker. Der blev anvendt lette stimuli ved 0 MS og 700 MS (indikeret med pile). Dette tal er blevet ændret fra 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Opsving fra desensibilisering. (A) Ip: peak Current Recovery, (B) L: ventetid opsving, (C) T: desensibilisering tid konstant T opsving. Eksperimenter blev udført ved 0 h CT. Dette tal er blevet ændret fra Barriga-Montoya, C, et al. 2. resultaterne udtrykkes som middelværdien ± standardafvigelsen for antallet af eksperimenter (n = 11). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Recovery fra desensibilisering som en funktion af CT. (A) Ip nyttiggørelse, (B) L nyttiggørelse, (C) т inddrivelse. D) vægtede tidskonstanter. Bifasisk processer er markeret med en pil. Dette tal er blevet ændret fra Barriga-Montoya, C, et al. 2. resultaterne udtrykkes som middelværdien ± standardafvigelsen for antallet af eksperimenter (n = 11). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende tabel 1. Venligst klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Krebs har vist sig at være en glimrende model på grund af dens evne til at overleve under ikke-naturlige forhold. Der er nem adgang til in vivo og in vitro elektrofysiologiske analyser. Desuden er krebsdyr en gunstig gruppe for neurobiologisk forskning inden for komparativ chronobiology21.
I dette papir, studiet af desensibilisering og nyttiggørelse af lys-aktiveret transduktion-strøm af krebs fotoreceptor celler vises ved hjælp af intracellulære optagelse teknik. Vi mener dog, at den samme teknik kan tilpasses andre hvirvelløse visuelle systemer, så længe det er muligt at få adgang til fotoreceptor-celler.
For at opnå acceptable eksperimentelle resultater, er det vigtigt at overveje nogle kritiske trin i protokollen, herunder eliminere elektrisk støj ved jordforbindelse alt udstyr, opbygning af en elektrode med en tilstrækkelig fin spids, og sikre, at fotoreceptor celle er helt mørkt-tilpasset før to-Pulse protokollen begynder.
På trods af begrænsningerne af intracellulære optagelse såsom beskadigelse af membranen, er det muligt at gå videre og indhente detaljerede oplysninger om den biofysiske mekanisme underliggende Krebs (eller et andet dyr) fotoreceptor elektrisk signal. Som i andre hvirvelløse photoreceptors, i Krebs-photoreceptorer, udløser lys en graderet depolarisering eller receptor potentiale, der produceres ved aktivering af en kationisk ledning. Den lysaktiverede ledning begynder efter en forsinkelse eller ventetid, og efter at have nået sin maksimale amplitude, falder den langsomt efter et eksponentiel tidsforløb, da kanalerne indtaster en absorberende desensibiliseret tilstand.
Den kinetik af nyttiggørelse fra desensibilisering af lys-fremkaldte ion ledning af Krebs blev opnået ved hjælp af en to-Light flash-protokol (svarende til standard to-spænding Pulse protokol, der anvendes til at studere opsving fra inaktivering af spændings-gated kanaler)20. Interessant, og i modsætning til det velkendte tilfælde af spændings-gated kanaler, ikke kun peak amplitude, men også alle de nuværende parametre (jegp, L, T) ændre efter den første lette stimulus, inddrive med karakteristiske eksponentiel tid kurser til den oprindelige, første flash-værdier, som rapporteret andetsteds20. Denne variation af alle de parametre, der karakteriserer den nuværende indikerer deltagelse af anden budbringere i det visuelle transduktionssystem af krebs1,2,22,23,24.
Derudover, og interessant, som figur 8 viser, inddrivelse af L, jegp, og T afhænger af døgn tid, hvor eksperimenter er realiseret. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme det molekylære grundlag for dette fænomen. Selvfølgelig er det muligt at få lignende oplysninger ved hjælp af en anden teknik, såsom patch clamp. Men det intracellulære miljø kan være meget forstyrret i andre teknikker, og dette kunne være kritisk, hvis for eksempel, interne elementer som proteiner, aminosyrer, nukleotider, blandt mange andre, spiller en relevant rolle i den elektriske signal generation eller i samspillet med hormoner eller neuromodulatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 Grant. Forfatterne vil gerne takke Mrs. Josefina, chef for afdelingen for videnskabelig papir oversættelse, fra División de Investigación ved Facultad de Medicina, UNAM, for at have redigeret den engelsksprogede udgave af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments, Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Single-channel recording. Sakmann, B. , Springer Science & Business Media. (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. pipette cookbook. , Sutter Instruments. Novato, CA. 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. Aschoff, J. , North Holland, Amsterdam. 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. Aschoff, J. , Plenum, New York. 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. 507, Sinauer. Sunderland, MA. (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
