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Neuroscience

Desensitisierung und Wiederherstellung von Krebse Photorezeptoren nach der Lieferung eines leichten Stimulus

doi: 10.3791/56258 Published: November 9, 2019

Summary

Ein Protokoll zur Untersuchung der Desensibilisierung und Empfindlichkeit sebung von Krebsphotorezeptoren als Funktion der zirkadianen Zeit wird vorgestellt.

Abstract

Eine Methode zur Untersuchung der Desensibilisierung und Wiederherstellung von Krebsphotorezeptoren wird vorgestellt. Wir führten intrazelluläre elektrische Aufnahmen von Photorezeptorzellen in isolierten Augenstielen mit der diskontinuierlichen Konfiguration der Einzelelektroden-Geschalteten Spannungsklemme durch. Zuerst haben wir mit einer Rasierklinge eine Öffnung in der dorsalen Hornhaut gemacht, um Zugang zur Netzhaut zu erhalten. Danach setzten wir eine Glaselektrode durch die Öffnung ein und drangen in eine Zelle ein, wie durch die Aufzeichnung eines negativen Potentials berichtet. Das Membranpotential wurde auf das Ruhepotential des Photorezeptors eingeklemmt und ein Lichtimpuls angewendet, um Ströme zu aktivieren. Schließlich wurde das zwei Lichtblitzprotokoll verwendet, um die aktuelle Desensibilisierung und Wiederherstellung zu messen. Der erste Lichtblitz löst nach einer Verzögerungsperiode den transduktionsionischen Strom aus, der nach Erreichen einer Spitzenamplitude in einen desensithissiierten Zustand abfällt; der zweite Blitz, der in unterschiedlichen Zeitintervallen angewendet wird, bewertet den Zustand der lichtaktivierten Leitfähigkeit. Um den lichtentwirrten Strom zu charakterisieren, wurden drei Parameter gemessen: 1) Latenz (die Zeit, die zwischen der Lichtblitzabgabe verstrichen ist, und dem Moment, in dem der Strom 10% seines Maximalwerts erreicht); 2) Spitzenstrom; und 3) Desensibilisierungszeitkonstante (exponentielle Zeitkonstante der aktuellen Zerfallsphase). Alle Parameter werden vom ersten Impuls beeinflusst.

Um die Erholung von der Desensibilisierung zu quantifizieren, wurde das Verhältnis p2/p1 im Vergleich zur Zeit zwischen den Impulsen verwendet. p1 ist der Spitzenstrom, der durch den ersten Lichtimpuls evoziert wird, und p2 ist der Spitzenstrom, der vom zweiten Impuls evoziert wird. Diese Daten wurden an eine Summe exponentiver Funktionen angepasst. Schließlich wurden diese Messungen in Abhängigkeit von der zirkadianen Zeit durchgeführt.

Introduction

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Um als visueller Reiz wahrgenommen zu werden, muss Licht, das die Augen erreicht, in ein elektrisches Signal umgewandelt werden. Somit löst Licht in allen visuellen Organismen einen Transduktionsionenstrom aus, der wiederum eine Veränderung des Membranpotenzials von Photorezeptorzellen, dem sogenannten Rezeptorpotential, bewirkt. Aus diesem Grund hängt die Lichtempfindlichkeit des Auges in erster Linie vom Zustand der lichtaktivierten Leitfähigkeit ab, die entweder aktiviert oder desensizipiert werden kann.

Bei Krebsphotorezeptoren löst Licht einen langsamen, transienten, ionischen Stromaus 1. Bei der Beleuchtung entsteht der Transduktionsstrom nach einer Verzögerung oder Latenz, bevor er sein Maximum erreicht; danach zerfällt es, da die Transduktionskanäle in einen desensiwordenen Zustand fallen, in dem sie nicht auf weitere Lichtreize reagieren2. Das heißt, Licht, zusätzlich zur Aktivierung der Transduktionsströmung verantwortlich des Sehens, induziert auch eine vorübergehende Dekrementierung der Empfindlichkeit von Photorezeptorzellen. Die Desensizipierung kann einen allgemeinen Schutzmechanismus gegen eine Übermäßige Exposition gegenüber einem angemessenen Stimulus darstellen. Die Lichtempfindlichkeit des Auges wird wiederhergestellt, wenn sich die Transduktionsleitfähigkeit von der Desensibilisierung erholt.

Intrazelluläre Aufzeichnung ist eine nützliche Technik zur Messung der elektrischen Aktivität von erregbaren Zellen3,4,5,6,7,8. Obwohl die intrazelluläre Aufzeichnung mit dem Aufkommen der Patch-Clamp-Technik9seltener geworden ist, ist es immer noch ein bequemer Ansatz, wenn Zellen entweder schwer zu isolieren sind oder eine Geometrie darstellen, die die Bildung der patch-clamping Giga-Dichtungen erschwert(d.h.Dichtungen oder enge Kontakte zwischen der Patchelektrode und Membranen mit elektrischem Widerstand in der Größenordnung von 109Ohm). Beispiele für letztere sind die Spermien10 und die hier untersuchten Photorezeptorzellen. Nach unserer Erfahrung, Procambarus clarkii Photorezeptoren sind schwierig zu isolieren und in der Primärkultur zu halten; Darüber hinaus sind es dünne Stäbe, die die Giga-Siegelbildung schwer zu erreichen machen. In intrazellulären Aufnahmen wird eine scharfe Elektrode in eine Zelle vorgeschoben, die vom umgebenden Gewebe an Ort und Stelle gehalten wird. Die Elektrode wird durch die Hochgeschwindigkeitsschaltschaltung des Verstärkers gehackt, so dass Strom zwischen Spannungsimpulsen abgetastet wird. Dieser Modus wird als diskontinuierliche Single-Elektroden-Spannungsklemme (dSEVC-Modus)11bezeichnet. Der hohe Widerstand (kleine Öffnung) der Elektrode behindert den Diffusionsaustausch zwischen der Zelle und den Pipettenlösungen, was zu einer minimalen Störung des intrazellulären Milieus3führt. Ein möglicher Nachteil dieser Technik ist, dass das Einsetzen von Elektroden einen nicht selektiven Leckstrom erzeugen kann; Daher ist darauf zu achten, dass die Aufzeichnung von Zellen vermieden wird, bei denen die Größe des Leckstroms die vorgesehenen Messungen4,12beeinträchtigen kann.

Dabei verwenden wir isolierte Krebsaugenstiele, um die Desensibilisierung und Wiederherstellung der lichtaktivierten Ionenleitfähigkeit zu bewerten, indem wir intrazelluläre elektrische Aufnahmen von Photorezeptorzellen unter Spannungsklemmenbedingungen durchführen.

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Protocol

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HINWEIS: Die Experimente entsprechen den Tierschutzgesetzen Mexikos.

1. Versuchsaufbau

  1. Allgemeine Verbindungen
    1. Schließen Sie den Verstärker über einen Analog-Digital-Wandler an einen geeigneten Computer an und verwenden Sie ein Oszilloskop, um das Experiment zu überwachen (Abbildung 1).
    2. Verbinden Sie den Photostimulator mit dem konvertierten A/D.
  2. Aufnahmekammer
    1. Platzieren Sie die Aufnahmekammer auf einen Anti-Vibrations-Tisch und lokalisieren Sie sie in einem Faraday-Käfig.
      HINWEIS: Dies verhindert mechanische Vibrationen und elektrische Geräusche, die die Aufzeichnung beeinträchtigen können. Unser Faraday Käfig bestand aus abgedunkelten Drahtgittern. Es wird eine hausgemachte, 2 ml Acrylaufnahmekammer verwendet (Abbildung 2).
    2. Bereiten Sie die Badlösung vor, um das Präparat am Leben zu halten13: 205 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM MgSO4; 13 mM CaCl2; 5 mM Hepes-NaOH, pH 7.3.
      HINWEIS: Die Lösung umfasst keine Dextrose oder ein Sprudeln um 95% O2, 5%CO2-Mischung, da das experimentelle Verfahren kurz genug ist, um Schäden durch die elektrische Aufzeichnung zu erkennen (siehe Schritt 4.2.3 für Vollständigkeit).
  3. Elektroden
    1. Verwenden Sie eine chloridbeschichtete Silberdrahtelektrode als Referenzelektrode
      ANMERKUNG: Silberchlorid-Beschichtung ist notwendig, um die Elektrodenreaktion zu ermöglichen: AgCl(s) + e-↔ Ag(s) + Cl-.
    2. Sand einen silbernen Draht (Dicke 1 mm, Länge 10 cm) mit einem feinen Grad Schmiralpapier, um seine Oberfläche zu reinigen.
    3. Spülen Sie den Silberdraht mit destilliertem Wasser.
    4. Tauchen Sie den sauberen Silberdraht in eine 4-6% Natriumhypochloritlösung (NaClO) ein, bis er dunkel erscheint (ca. 20 min).
    5. Verwenden Sie dünne Glaspipetten, die mit einer Elektrolytlösung (2,7 M KCl) als intrazelluläre Elektrode gefüllt sind.
    6. Ziehen Sie ein Glaskapillarrohr (Innendurchmesser 1 mm) mit einem Mikropipettenzieher, um eine dünne Spitze mit einer kleinen Öffnung (0,01-0,1 m) zu erhalten14.
    7. Füllen Sie das gezogene Kapillarglas mit einer 2,7 M KCl-Lösung. Zuerst mit Kapillarität füllen (die Pipettenspitze in die 2,7 M KCl-Lösung eintauchen) und dann die Hälfte der Pipette mit einer feinen Injektionsnadel füllen. Tippen Sie bei Bedarf auf die Elektrodenpipette, um Luftblasen zu beseitigen.
    8. Schließen Sie die Elektrode an ihren Halter an. Schließen Sie den Halter mit dem Verstärker an die Verstärkerkopfbühne an. Positionieren Sie die Elektrodenhalter-Kopfbühne mit einem stabilen 3D-Mikromanipulator. Senken Sie die Elektrode, bis die Badlösung ihre Spitze bedeckt.
      ANMERKUNG: Die Elektrode muss eine vertikale Ausrichtung haben
  4. Wählen Sie den Brückenmodus des Verstärkers (im Modusbereich des Verstärkers, drücken Sie die Bridge-Taste) und messen Sie den Elektrodenwiderstand. Stellen Sie sicher, dass der Widerstand ca. 50 M x11beträgt.
    HINWEIS: Diese Elektrodengröße ermöglicht eine hochwertige elektrische Aufzeichnung mit begrenzten Schäden an der Zelle.
  5. Null den Offsetstrom und kompensieren kapazitive Transienten mit der Halteposition-Taste im Abschnitt Spannungsklemme des Verstärkers und der Capacitance Neutralization-Taste in Microelectrode 1 Abschnitt des Verstärkers.
  6. Superfusionssystem
    1. Gießen Sie die Badlösung (Schritt 1.2.2) in einen geeigneten Behälter (eine 250 ml Serumflasche) und schließen Sie sie an ein Bewässerungsrohrset (3,2 mm Innendurchmesser) an, wodurch die Aufnahmekammer angeschlossen wird. Verwenden Sie ein schwerkraftgetriebenes Superfusionssystem. Regulieren Sie den Durchfluss auf 0,5 ml/s.
    2. Schließen Sie die Kammer an eine Saugvorrichtung an. Regulieren Sie das Lösungssaugsystem so, dass das Gesamtvolumen der Aufnahmekammer nicht variiert. Verwenden Sie eine Vakuumpumpe zum Absaugen.
      HINWEIS: Ein konstantes Volumen in der Aufnahmekammer ist wichtig, um streunende Kapazitanzen während des gesamten Experiments konstant zu halten.

2. Biologisches Material

Hinweis: Verwenden Sie erwachsene Krebse P. clarkii (7-10 cm lang) im Intermolt-Stadium des undeutlichen Geschlechts.

  1. Circadian Zeit
    1. Einen Monat vor den Experimenten 100 Krebse unter einem 12-h-Licht-/12-h-Dunkelzyklus15 (weißes Licht, 2,4 kW/m2)aufbewahren.
      HINWEIS: Ein Monat ist ausreichend Zeit, um die Krebspopulation zu synchronisieren.
    2. Bestimmen Sie die zirkadiane Zeit der Krebspopulation, indem Sie die Amplitude von Elektroretinogrammen von fünf zufällig ausgewählten Tieren15bewerten.
      ANMERKUNG: 0 h zirkadiane Zeit (CT 0) gibt den Beginn eines subjektiven Tages an, d.h.die Zeit, in der ein Organismus normalerweise aktiv ist16,17,18,19 ( Abbildung3). Der Krebs ist ein nachtaktives Tier, so dass er unter einem 12-h-Licht-/12-h-Dunkelzyklus während der dunklen Phase aktiv ist.
  2. Eyestalk Isolationsverfahren
    1. Zur gewünschten zirkadianen Zeit eine ausgewählte Krebse durch Eintauchen in Leitungswasser bei 0-4 °C, für 15 min ansiedeln.
    2. Mit einer feinen Schere den Augenstiel von der Basis lösen.
    3. Greifen Sie mit einer Rasierklinge auf die Netzhaut zu, um eine Öffnung (ca. 1 mm2) in der dorsalen Hornhaut zu machen.
    4. Platzieren Sie den Augentalk in der Mitte der Aufnahmekammer (das Loch mit Silikon bedeckt) mit der Zugangsöffnung zur Netzhaut auf der Oberseite der Kammer.
  3. Halten Sie die Augensprechen in ständiger Dunkelheit für 20 min.
    HINWEIS: 20 min ist ausreichend Zeit, um die Photorezeptorzelle vollständig dunkel anzupassen.

3. Photorezeptor Impaling

  1. Setzen Sie die Mikroelektrode und die Längsachse des Eyestalks so parallel, dass die Mikroelektrode für den Zugang zur Netzhaut zentriert ist. Verwenden Sie ein stereoskopisches Mikroskop (10X), um die Geräte in der richtigen Konfiguration zu platzieren.
  2. Überwachen Sie den Spannungsunterschied zwischen der Referenz- und der Aufnahmeelektroden, indem Sie den Bridge Mode11 des Verstärkers auswählen.
  3. Senken Sie die Elektrode in das Bad und legen Sie sie danach direkt über die Netzhaut.
  4. Bewegen Sie das Mikroskop weg und positionieren Sie die Fototimulatorlampe parallel zur Längsachse des Eyestalk.
    HINWEIS: Der Abstand zwischen Lampe und Superfusionskammer beträgt ca. 15 cm.
  5. Senken Sie die Mikroelektrode langsam, bis ein plötzlicher Spannungsabfall erkannt wird.
    HINWEIS: Ein Spannungsabfall von ca. 50 mV zeigt die Präsementung einer gesunden Photorezeptorzelle an.
  6. Liefern Sie einen Testlichtblitz (weißes Licht, 7,2 kW/m2, 10 s Dauer), um das Rezeptorpotenzial des Photorezeptors aufzuzeichnen.
    HINWEIS: Das Rezeptorpotenzial des Photorezeptors ist ein depolarisierendes Potential von 10-15 mV Amplitude und 300 ms Dauer (Abbildung 4).

4. Elektrische Aufzeichnung

  1. Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptorzellen vollständig an dunkle Bedingungen angepasst sind (siehe Schritt 2.3).
    1. Liefern Sie alle 2 min einen Testlichtblitz. Automatisieren Sie die Zeit zwischen den Blitzen, indem Sie einen angemessenen Wert (120 s) der "Zeit zwischen den Episoden" in der Datenerfassungssoftware auswählen.
      HINWEIS: 2 min ist die notwendige Zeit, um die vollständige Wiederherstellung der Ströme zu ermöglichen, die der elektrischen Reaktion des Photorezeptors zugrunde liegen.
    2. Überwachen Sie das ruhende Membranpotential sowie die Amplitude und Dauer des Rezeptorpotentials. Angenommen, der Photorezeptor ist vollständig angepasst, sobald das Membranpotenzial, die Amplitude und die Dauer des Rezeptorpotentials unverändert bleiben. Eyestalks, die zuvor 20 min lang unter ständiger Dunkelheit gehalten wurden (Schritt 2.3), runden ihre Anpassung in ca. 5 min ab.
    3. Stoppen Sie die Stimulierung der Zelle 2 min vor der Aufnahme des lichtentlösten Stroms.
  2. Aktuelle Aufzeichnung
    1. Klemmen Sie die Spannung am gemessenen Ruhenmembranpotentialwert der Zelle, indem Sie in der Datenerfassungssoftware (in Wellenform auf dem Abschnitt Analoger Ausgangskanal) "Amplitude halten" auswählen.
    2. Wählen Sie den dSEVC-Modus des Verstärkers aus. Wählen Sie im Modusbereich des Verstärkers die SEVC-Taste aus und schalten Sie den Hebel in die Position Discont SEVC.
    3. Stellen Sie die Schaltrate auf 500-1.000 Hz (mit Hilfe der Rate Adjust-Taste des Verstärkers), wie durch die Geschwindigkeit der Elektrode11bestimmt.
    4. Liefern Sie einen Lichtblitz, und beobachten Sie den evozierten Ionenzustrom.
      ANMERKUNG: Dies ist der lichtentlockte oder transduktionsstrom (Abbildung 5).
    5. Kehren Sie in den Bridge-Modus am Verstärker zurück und zeichnen Sie ein Rezeptorpotential auf, indem Sie einen Lichtblitz senden (siehe Abschnitt 3). Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptorzelle vollständig an dunkle Bedingungen angepasst ist. Messen Sie die Eigenschaften des Rezeptorpotentials (Amplitude und Dauer) und vergleichen Sie sie mit den ersten Messungen. Angenommen, die aufgespießte Photorezeptorzelle ist eine gesunde Zelle, wenn sie die gleichen Eigenschaften hat.
      HINWEIS: Nach der Augentalk-Ablation ist die biologische Zubereitung während der folgenden 2 h lebensfähig.
  3. Zwei Pulsprotokoll: Messen Sie die Erholung von der Desensibilisierung mit einem Zwei-Licht-Blitz-Protokoll.
    HINWEIS: Das zwei Lichtblitz-Protokoll ähnelt dem Standard-Zweipuls-Spannungsprotokoll, das zur Messung der Wiederherstellung von Inaktivierung von spannungsgebundenen Kanälen20verwendet wird. Der erste Lichtblitz bewirkt eine vorübergehende Änderung der Empfindlichkeit der Photorezeptorzelle und der zweite Blitz wertet den Zustand der lichtaktivierten Leitfähigkeit aus.
    1. Liefern Sie ein Paar Lichtimpulse. Tragen Sie den zweiten Blitz nach einem gewünschten Zeitintervall (von 300 ms bis 2 min) auf.
    2. Digitalisieren Sie die Ströme bei 10 KHz Sampling mit der Datenerfassungssoftware und speichern Sie die Daten für die Off-Line-Analyse11.
      HINWEIS: Eine Tabelle mit den Konfigurationswerten der Software ist als Zusatzmaterial enthalten.

5. Datenanalyse

  1. Kinetik des lichtentelicitten Stroms
    1. Messen Sie drei aktuelle Parameter: Aktivierungslatenz L, die Zeit, die von der Lichtblitzlieferung verstrichen ist, bis der Strom 10 % seiner maximalen Amplitude erreicht (Abbildung 5); Spitzen- oder Maximalstromamplitude Ip; und Desensibilisierungszeitkonstante T. Messen Sie die Desensibilisierungszeitkonstante () durch Anpassung der aktuellen Zerfallsphase an:
      Equation 1
      wobei A = -I(t=0) eine positive Konstante ist (Abbildung 5).
  2. Desensitisierung und Erholung
    Anmerkung: Die Wiederherstellung aus der Desensibilisierung wurde als Verhältnis p2/p1bewertet, wobei p1 der relevante Parameter (entweder L, Ipoder T) des Steuerstroms und p2 der entsprechende Parameter des zweiten Teststroms ist.
    1. Plot p2/p1 (entweder L, Ipoder T) als Funktion der Zeit zwischen den Impulsen.
    2. Passen Sie die Punkte jedes Diagramms je nach Parameter an:
      Equation 2
      oder an:
      Equation 3
    3. Verwenden Sie einen geeigneten statistischen Test, um die Anzahl der exponentiellen Begriffe zu bestimmen, die erforderlich sind, um die experimentellen Daten anzupassen.

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Representative Results

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Zunächst wird ein repräsentatives Rezeptorpotential von Krebsphotorezeptorzellen erhalten (Abbildung 4). Anschließend wurde ein Testlichtblitz angewendet, um den Lichttransduktionsstrom auszulösen (Abbildung 5). Der kationische Transduktionsstrom1 aktiviert sich nach einer Verzögerung, erreicht ein Maximum und fällt danach langsam in einen absorbierenden desensinationen Zustand, aus dem er sich langsam erholt.

Es ist anzunehmen, dass die lange Latenz L (Zehn Millisekunden) des lichtentlösten Stroms von den biochemischen Ereignissen abhängt, die durch Licht ausgelöst werden, die G-Protein-Wege beinhalten. Die Amplitude des Spitzenstroms Ip hängt vom Bruchteil der zu öffnenden Kanäle und den relativen Raten der aktuellen Aktivierung und Inaktivierung ab. Letzteres wird durch die Zerfallszeitkonstante T beurteilt.

Andererseits sollte die L-Rückgewinnung mit der Rate der Rückgewinnung der biochemischen Phototransduktionskaskade zusammenhängen; Die Wiederherstellung hängt sowohl von den intrinsischen konformationalen Veränderungen der für die Ionenleitfähigkeit verantwortlichen Proteine als auch von der Rate der Rückgewinnung der biochemischen Phototransduktionskaskade ab. Letzteres könnte auch mit der Wiedereinziehung von T zusammenhängen. Darüber hinaus deuten die parallelen Variationen von L und T darauf hin, dass ein gemeinsamer biochemischer Faktor (oder Faktoren; z.B.,der Phosphorylierungszustand des Kanals) kann beide Parameter beeinflussen1.

Anschließend wurde ein Zwei-Blitz-Protokoll (Abbildung 6) angewendet, um die Kinetik der Erholung von der Desensibilisierung (Abbildung 7) in verschiedenen Momenten des zirkadianen Zyklus zu bestimmen ( Abbildung8).

Figure 1
Abbildung 1. Liniendiagramm der Geräteeinrichtung. Anschlüsse zwischen Personal Computer (PC) (A), Schnittstelle (B), Oszilloskop (C), Spannungsklemmenverstärker (D), Photostimulator (E), und dem Kopfbühne/Halter/Mikroelektrodensystem des Geräteaufbaus (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. R-Ecording-Kammer. (A) Die Aufnahmekammer in einem Faraday-Käfig mit seinem Superfusions-Saugsystem. Es wird auch die Position des Photostimulators, Mikroskops und Mikromanipulator-Kopfstadium-Mikroelektrodensystems gezeigt. (B) Diagramm der Aufnahmekammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Elektroretinogramm (ERG) Amplitude. (A) Krebse. (B) Repräsentatives Diagramm der ERG-Amplitude von Krebsphotorezeptoren (Daten wurden alle 20 min) in Abhängigkeit von der zirkadianen Zeit aufgenommen. Die Existenz eines zirkadianen Rhythmus kann deutlich geschätzt werden. Beachten Sie, dass für jeden Zyklus der Beginn der Aktivität mit der zirkadianen Zeit 0 zusammenfällt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4. Rezeptorpotenzial. Repräsentatives Rezeptorpotential, das durch einen Lichtblitz evoziert wird (weißes Licht, 7,2 kW/m2, 10 s Dauer). Diese Zahl wurde von Barriga-Montoya, C, et al. geändert. 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5. Transduktionsstrom. Repräsentativer Transduktionsstrom, ausgelöst durch einen Lichtblitz (weißes Licht, 7,2 kW/m2, 10 s Dauer), der mit der Spannung konstant am Photorezeptor-Ruhepotential gehalten wird. Aktuelle Latenz, Spitzenamplitude und Desensibilisierungsphase sind angegeben. Diese Zahl wurde von Barriga-Montoya, C, et al. geändert. 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6. Zwei-Puls-Protokoll. Ströme, die durch ein Paar Lichtblitze ausgelöst werden. Leichte Reize wurden bei 0 ms und 700 ms angewendet (durch Pfeile angezeigt). Diese Zahl wurde von 2geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7. Erholung von der Desensiisierung. (A) Ip: Spitzenstromrückgewinnung, (B) L: Latenzrückgewinnung, (C) T: Desensitisierungszeitkonstante T-Wiederherstellung. Die Experimente wurden bei 0 h CT durchgeführt. Diese Zahl wurde von Barriga-Montoya, C, et al. geändert. 2. Die Ergebnisse werden als mittlere Standardabweichung der Anzahl der Experimente ausgedrückt (n = 11). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8. Erholung von der Desensibilisierung als Funktion von CT. (A) Ip Recovery, (B) L Recovery, (C) - Wiederherstellung. (D) Gewichtete Zeitkonstanten. Biphasische Prozesse sind mit einem Pfeil markiert. Diese Zahl wurde von Barriga-Montoya, C, et al.geändert. 2. Die Ergebnisse werden als mittlere Standardabweichung der Anzahl der Experimente ausgedrückt (n = 11). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

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Discussion

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Die Krebse haben sich als ausgezeichnetes Modell erwiesen, da sie unter nicht-natürlichen Bedingungen überleben können. Es gibt einen einfachen Zugang zu elektrophysiologischen In-vivo- und In-vitro-Analysen. Darüber hinaus sind Krebstiere eine günstige Gruppe für neurobiologische Forschung auf dem Gebiet der vergleichenden Chronobiologie21.

In diesem Beitrag wird die Untersuchung der Desensibilisierung und Wiederherstellung des lichtaktivierten Transduktionsstroms von Krebsphotorezeptorzellen mit der intrazellulären Aufzeichnungstechnik gezeigt. Wir glauben jedoch, dass die gleiche Technik an andere wirbellose visuelle Systeme angepasst werden könnte, solange es möglich ist, auf Photorezeptorzellen zuzugreifen.

Um akzeptable experimentelle Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, einige kritische Schritte im Protokoll zu berücksichtigen, einschließlich der Beseitigung von elektrischem Rauschen durch Erdung aller Geräte, den Bau einer Elektrode mit einer ausreichend feinen Spitze und die Photorezeptorzelle ist vollständig dunkel angepasst, bevor das Zwei-Puls-Protokoll beginnt.

Trotz der Einschränkungen der intrazellulären Aufzeichnung wie die Schädigung der Membran, ist es möglich, weiter zu gehen und detaillierte Informationen über den biophysikalischen Mechanismus zugrunde liegenden Krebse (oder ein anderes Tier) Photorezeptor elektrisches Signal zu erhalten. Wie bei anderen wirbellosen Photorezeptoren löst Licht bei Krebsphotorezeptoren eine abgestufte Depolarisation oder ein Rezeptorpotential aus, das durch die Aktivierung einer kationischen Leitfähigkeit erzeugt wird. Die lichtaktivierte Leitfähigkeit beginnt nach einer Verzögerung oder Latenz, und nachdem sie ihre maximale Amplitude erreicht hat, fällt sie langsam nach einem exponentiellen Zeitverlauf ab, wenn die Kanäle in einen absorbierenden desensibilisierten Zustand eintreten.

Die Kinetik der Erholung von der Desensibilisierung der lichtentelicitten Ionenleitfähigkeit von Krebsen wurde mit einem Zwei-Licht-Blitzprotokoll (ähnlich dem Standard-Zwei-Spannungs-Impulsprotokoll, das verwendet wird, um die Wiederherstellung von inaktivierung von spannungsgebundenen Kanälen zu untersuchen)20erhalten. Interessanterweise und im Gegensatz zum bekannten Fall von spannungsgebundenen Kanälen ändern sich nicht nur die Spitzenamplitude, sondern auch alle aktuellen Parameter (Ip, L, T) nach dem ersten Lichtreiz und erholen sich mit charakteristischen exponentiellen Zeitkursen zum Original, erste Blitzwerte, wie an anderer Stelle berichtet20. Diese Variation aller Parameter, die den Strom charakterisieren, zeigt die Beteiligung der zweiten Boten am visuellen Transduktionssystem von Krebsen1,2,22,23,24an.

Darüber hinaus und interessanterweise hängt die Wiederherstellung von L, Ipund T, wie Abbildung 8 zeigt, von der zirkadianen Zeit ab, zu der Experimente durchgeführt werden. Weitere Studien sind erforderlich, um die molekulare Grundlage dieses Phänomens zu bestimmen. Natürlich ist es möglich, ähnliche Informationen mit einer anderen Technik zu erhalten, wie PatchKlemme. Das intrazelluläre Milieu kann jedoch in anderen Techniken stark gestört werden, und dies könnte entscheidend sein, wenn beispielsweise innere Elemente wie Proteine, Aminosäuren, Nukleotide, unter vielen anderen, eine relevante Rolle bei der elektrischen Signalerzeugung oder in der Interaktion mit Hormonen oder Neuromodulatoren spielen.

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Disclosures

Wir haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch dGAPA-UNAM IN224616-RN224616-Zuschuss unterstützt. Die Autoren danken Frau Josefina Bolado, Leiterin der Abteilung für wissenschaftliche Übersetzung von Papieren, aus divisién de Investigacion in facultad de Medicina, UNAM, für die Bearbeitung der englischsprachigen Version dieses Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axoclamp2A  Axon Instruments Inc Amplifier
Digidata 1200 Interface Axon Instruments Inc Digitizer
Oscilloscope TDS430A Tektronix Analogic Oscilloscope
Photostimulator PS33 Plus Grass Lamp
Puller PC-100 Narishige Micropipette Puller
Puller P-97 Sutter Instruments Micropipette Puller
Glass Capillary Tube Kimax-51 Kimble Products 34502 0.8, 1.10, 100 mm
HS-2 Headstage Axon Instruments Inc Headstage
Micromanipulator MX-4 Narishige Mechanical Micromanipulator
Stereoscopic Microscope Zeiss Microscope
pClamp Axon Instruments Inc Data acquisition software for digidata 1200 interface
Clampfit Axon Instruments, Inc Analysis software linked to pClamp
Origin OriginLab Corp. Data analysis and graphing software
Sodium Chloride Sigma S7653 >99.5%
Potassium Chloride Sigma P-9333 Minimum 99%
Magnesium Sulfate Sigma M7506 Minimum 99.5%
Calcium Chloride Sigma C5080 Minimum 99.0%
Hepes Sigma H7523 >99.5%
Sodium Hydroxide Sigma S8045 98.00%
Sodium hypochlorite solution Sigma 425044 Available chlorine, 10-15% 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Desensitisierung und Wiederherstellung von Krebse Photorezeptoren nach der Lieferung eines leichten Stimulus
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Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Picones, A., Hernández-Cruz, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus. J. Vis. Exp. (153), e56258, doi:10.3791/56258 (2019).More

Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Picones, A., Hernández-Cruz, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus. J. Vis. Exp. (153), e56258, doi:10.3791/56258 (2019).

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