Summary
Viene presentato un protocollo per lo studio della desensibilizzazione e del recupero di sensibilità dei fotorecettori dei gamberi in funzione del tempo circadiano.
Abstract
Viene presentato un metodo per studiare la desensibilità e il recupero dei fotorecettori dei gamberi. Abbiamo eseguito registrazioni elettriche intracellulari di cellule fotorecettrici in occhi con occhi isolati utilizzando la configurazione discontinua del morsetto a tensione a commutazione di elettrodi. In primo luogo, con una lama di rasoio abbiamo fatto un'apertura nella cornea dorsale per ottenere l'accesso alla retina. Successivamente, abbiamo inserito un elettrodo di vetro attraverso l'apertura e siamo penetrati in una cella come riportato dalla registrazione di un potenziale negativo. Il potenziale della membrana è stato bloccato al potenziale di riposo del fotorecettore ed è stato applicato un impulso luminoso per attivare le correnti. Infine, il protocollo light-flash è stato impiegato per misurare l'attuale desensibilizzazione e recupero. Il primo lampo di luce innesca, dopo un periodo di ritardo, la corrente ionica di trasduzione, che dopo aver raggiunto un picco di ampiezza decade verso uno stato desensibilizzato; il secondo flash, applicato a intervalli di tempo variabili, valuta lo stato della conduttanza attivata dalla luce. Per caratterizzare la corrente luminosa, sono stati misurati tre parametri: 1) latenza (il tempo trascorso tra la consegna del flash di luce e il momento in cui la corrente raggiunge il 10% del suo valore massimo); 2) corrente di picco; e 3) costante del tempo di desensibilità (costante temporale esponenziale della fase di decadimento corrente). Tutti i parametri sono influenzati dal primo impulso.
Per quantificare il recupero dalla desensibilizzazione, è stato impiegato il rapporto p2/p1 rispetto al tempo tra gli impulsi. p1 è la corrente di picco evocata dal primo impulso luminoso, e p2 è la corrente di picco evocata dal secondo impulso. Questi dati sono stati adattati a una somma di funzioni esponenziali. Infine, queste misurazioni sono state effettuate in funzione del tempo circadiano.
Introduction
Per essere percepita come uno stimolo visivo, la luce che raggiunge gli occhi deve essere traspolata in un segnale elettrico. Quindi, in tutti gli organismi visivi, la luce innesca una corrente di ioni a trasduzione, che a sua volta produce un cambiamento nel potenziale della membrana delle cellule fotorecettrici, il cosiddetto potenziale recettore. A causa di questo, la sensibilità alla luce dell'occhio dipende principalmente dallo stato della luce attivata conduttanza, che può essere disponibile per essere attivato o desensibilizzato.
Nei fotorecettori dei gamberi, la luce innesca una corrente lenta, transitoria, ionica1. Al momento dell'illuminazione, la corrente di trasduzione si verifica dopo un ritardo o una latenza prima di raggiungere il suo massimo; successivamente decade, poiché i canali di trasduzione cadono in uno stato desensibilizzato in cui non rispondono a ulteriori stimoli luminosi2. Cioè, la luce, oltre ad attivare la corrente di trasduzione responsabile della visione, induce anche un decremento transitorio della sensibilità delle cellule fotorecettrici. La desensibilità può rappresentare un meccanismo protettivo generale contro la sovraesposizione a uno stimolo adeguato. La sensibilità dell'occhio alla luce viene recuperata man mano che la conduttanza della trasduzione si riprende dalla desensibilizzazione.
La registrazione intracellulare è una tecnica utile per misurare l'attività elettrica delle cellule eccitabili3,4,5,6,7,8. Anche se la registrazione intracellulare è diventata meno frequente con l'avvento della tecnica patch-clamp9, è ancora un approccio conveniente quando le celle sono difficili da isolare, o presentano una geometria che rende difficile la formazione delle guarnizioni giga-seal patch (cioè, sigilli o stretti contatti tra l'elettrodo patch e membrane con resistenza elettrica dell'ordine di 109ohms). Esempi di questi ultimi sono le cellule spermatozoi10 e le cellule fotorecettrici qui studiate. Nella nostra esperienza, i fotorecettori di Procambarus clarkii sono difficili da isolare e mantenere nella cultura primaria; inoltre, sono aste sottili che rendono difficile ottenere la formazione di giga-sigilli. Nelle registrazioni intracellulari, un elettrodo affilato viene avanzato in una cellula che viene mantenuta in posizione dal tessuto circostante. L'elettrodo viene tagliato dal circuito di commutazione ad alta velocità dell'amplificatore, quindi la corrente viene campionata tra gli impulsi di tensione. Questa modalità è nota come morsetto di tensione a singolo elettrodo discontinuo (modalità dSEVC)11. L'elevata resistenza (piccola apertura) dell'elettrodo ostacola lo scambio di diffusione tra la cellula e le soluzioni pipetta, producendo un disturbo minimo dell'ambiente intracellulare3. Un potenziale inconveniente di questa tecnica è che l'inserimento dell'elettrodo può produrre una corrente di perdita non selettiva; pertanto, è necessario prestare attenzione per evitare la registrazione da celle in cui le dimensioni della corrente di perdita possono interferire con le misure previste4,12.
Qui, usiamo occhi isolati di gamberi per valutare la desensibilità e il recupero della conduttanza iografica attivata dalla luce eseguendo registrazioni elettriche intracellulari di cellule fotorecettrici in condizioni di morsetto di tensione.
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Protocol
NOTA: Gli esperimenti rispettano le leggi sulla protezione degli animali del Messico.
1. Configurazione sperimentale
- Connessioni generali
- Collegare l'amplificatore a un computer adatto tramite un convertitore da analogico a digitale e utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'esperimento (Figura 1).
- Collegare il fotostimolatore all'A/D convertito.
- Camera di registrazione
- Posizionare la camera di registrazione su un tavolo anti-vibrazione e localizzarla all'interno di una gabbia di Faraday.
NOTA: Ciò impedisce la vibrazione meccanica e il rumore elettrico che possono influenzare la registrazione. La nostra gabbia di Faraday era fatta di rete metallica oscurata. Viene utilizzata una camera di registrazione acrilica fatta in casa (Figura 2). - Preparare la soluzione bagno per mantenere la preparazione in vita13: 205 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM MgSO4; 13 mM CaCl2; 5 mM Hepes-NaOH, pH 7.3.
NOTA: la soluzione non include il dextrose o qualsiasi bubbling del 95% O2, 5%co2 miscela perché la procedura sperimentale è abbastanza breve per rilevare i danni dalla registrazione elettrica (vedere passo 4.2.3 per completezza).
- Posizionare la camera di registrazione su un tavolo anti-vibrazione e localizzarla all'interno di una gabbia di Faraday.
- Elettrodi
- Utilizzare un elettrodo a filo d'argento rivestito in cloruro come elettrodo di riferimento
NOTA: il rivestimento in cloruro d'argento è necessario per consentire la reazionedell'elettrodo: AgCl(s) - e↔-ag(s)- . - Sand a silver wire (spessore : 1 mm, lunghezza , 10 cm) con una carta spalmata di qualità fine per pulirne la superficie.
- Sciacquare il filo d'argento con acqua distillata.
- Immergere il filo d'argento pulito in una soluzione di ipocloredi di sodio 4-6% (NaClO) fino a quando non appare scuro (circa 20 min).
- Utilizzare pipette di vetro sottili riempite con una soluzione elettrolitica (2,7 M KCl) come elettrodo intracellulare.
- Tirare un tubo capillare di vetro (diametro interno : 1 mm) con un tiratore a micropipetta per ottenere una punta sottile con una piccola apertura (0,01-0,1 m)14.
- Riempire il vetro capillare tirato con una soluzione KCl da 2,7 M. In primo luogo riempirlo per capillarità (immergere la punta della pipetta nella soluzione KCl da 2,7 m) e poi riempire la metà della pipetta con un ago a iniezione fine. Se necessario, toccare la pipetta elettrodo per eliminare le bolle d'aria.
- Collegare l'elettrodo al suo supporto. Collegare il supporto alla vela dell'amplificatore con l'amplificatore. Posizionare il porta-porta-testa dell'elettrodo con un micromanipolatore 3D stabile. Abbassare l'elettrodo fino a quando la soluzione del bagno copre la sua punta.
NOTA: l'elettrodo deve avere un orientamento verticale
- Utilizzare un elettrodo a filo d'argento rivestito in cloruro come elettrodo di riferimento
- Selezionare la modalità Bridge dell'amplificatore (nella sezione Modalità dell'amplificatore, premere il pulsante Bridge) e misurare la resistenza dell'elettrodo. Assicurarsi che la resistenza è di circa 50M. 11.
NOTA: Questa dimensione dell'elettrodo consente una registrazione elettrica di buona qualità con danni limitati alla cellula. - Annullare la corrente di offset e compensare i transitori capacitivi utilizzando il pulsante Posizione di tenuta nella sezione Morsetto di tensione dell'amplificatore e il pulsante Neutralizzazione di capacità nella sezione Microelectrode 1 dell'amplificatore.
- Sistema di superfusione
- Versare la soluzione di bagno (passaggio 1.2.2) in un recipiente adatto (una bottiglia di siero da 250 mL) e collegarla a un set di tubi di irrigazione (3,2 mm di diametro interno), collegando così la camera di registrazione. Utilizzare un sistema di superfusione a gravità. Regolare la portata a 0,5 mL/s.
- Collegare la camera ad un dispositivo di aspirazione. Regolare il sistema di aspirazione della soluzione in modo tale che il volume totale della camera di registrazione non vari. Utilizzare una pompa a vuoto per l'aspirazione.
NOTA: Un volume costante nella camera di registrazione è importante per mantenere costanti i capacità vaganti durante l'esperimento.
2. Materiale biologico
Nota: Utilizzare i gamberi adulti P. clarkii (7-10 cm di lunghezza) nella fase di intermolt del sesso indistinto.
- Tempo circadiano
- Un mese prima degli esperimenti, mantenere 100 gamberi sotto un ciclo scuro 12-h luce/12-h15 (luce bianca, 2,4 kW/m2).
NOTA: Un mese è il tempo sufficiente per sincronizzare la popolazione di gamberi. - Determinare il tempo circadiano della popolazione di gamberi valutando l'ampiezza degli elettroretinogrammi di cinque animali scelti casualmente15.
NOTA: 0 h tempo circadiano (CT 0) indica l'inizio di una giornata soggettiva, cioè,tempo durante il quale un organismo è normalmente attivo16,17,18,19( Figura3). Il gambero è un animale notturno, quindi sotto un ciclo scuro di 12-h di luce/12 h, è attivo durante la fase oscura.
- Un mese prima degli esperimenti, mantenere 100 gamberi sotto un ciclo scuro 12-h luce/12-h15 (luce bianca, 2,4 kW/m2).
- Procedura di isolamento di Eyestalk
- Nell'ora circadiana desiderata, anestesizzare un gambero selezionato per immersione in acqua di rubinetto a 0-4 gradi centigradi, per 15 min.
- Per mezzo di una forbice fine, staccare il gambo oleoso dalla base.
- Accedere alla retina utilizzando una lama di rasoio per fare un'apertura (1-mm2) nella cornea dorsale.
- Posizionare il gambo occhiali al centro della camera di registrazione (il foro coperto di silicone) con l'apertura di accesso alla retina sulla parte superiore della camera.
- Tieni il gambo occhi sotto l'oscurità costante per 20 min.
NOTA: 20 min è tempo sufficiente per la cellula fotorecettore per essere completamente scuro adattato.
3. Impalamento fotorecettore
- Mettere parallelamente il microelettrodo e l'asse longitudinale del gambo osta in modo tale che il microelettrodo sia centrato per l'accesso alla retina. Utilizzare un microscopio stereoscopico (10X) per posizionare i dispositivi nella configurazione corretta.
- Monitorare la differenza di tensione tra gli elettrodi di riferimento e di registrazione selezionando la modalità Bridge11 dell'amplificatore.
- Abbassare l'elettrodo nel bagno e successivamente posizionarlo proprio sopra la retina.
- Allontanare il microscopio e posizionare la lampada fotostimolatrice parallela all'asse longitudinale del gambo occhioso.
NOTA: La distanza tra la lampada e la camera di superfusione è di circa 15 cm. - Abbassare lentamente il microelettrodo fino a quando non viene rilevata una caduta improvvisa di tensione.
NOTA: Una caduta di tensione di circa 50 mV indica l'impalamento di una cellula fotocettore sana. - Fornire un lampo luminoso di prova (luce bianca, 7,2 kW/m2, 10 gradi di durata) per registrare il potenziale recettore del fotorecettore.
NOTA: Il potenziale recettore del fotorecettore è un potenziale depolarizzante di 10-15 mV di ampiezza e 300 ms di durata (Figura 4).
4. Registrazione elettrica
- Assicurarsi che le cellule fotorecettrici siano totalmente adattate alle condizioni scure (vedere il passaggio 2.3).
- Fornire un flash test-luce ogni 2 min. Automatizzare il tempo tra i flash scegliendo un valore adeguato (120 s) di "tempo tra gli episodi" nel software di acquisizione dati.
NOTA: 2 min è il tempo necessario per consentire il recupero totale delle correnti alla base della risposta elettrica del fotorecettore. - Monitorare il potenziale della membrana a riposo, così come l'ampiezza e la durata del potenziale recettore. Si supponga che il fotorecettore è completamente adattato una volta che il potenziale della membrana, ampiezza, e la durata del potenziale recettore rimangono invariati. I discorsi d'occhi precedentemente tenuti sotto l'oscurità costante per 20 min (fase 2.3) completano il loro adattamento in circa 5 min.
- Smettere di stimolare la cella 2 min prima di registrare la corrente illuminata.
- Fornire un flash test-luce ogni 2 min. Automatizzare il tempo tra i flash scegliendo un valore adeguato (120 s) di "tempo tra gli episodi" nel software di acquisizione dati.
- Registrazione corrente
- Bloccare la tensione al valore potenziale della membrana di riposo misurato della cella selezionando "Holding amplitude" nel software di acquisizione dati (in Waveform nella sezione Analog Output Channel).
- Selezionare la modalità dSEVC dell'amplificatore. Nella sezione Modalità dell'amplificatore, selezionare il pulsante SEVC e impostare la leva nella posizione Discont SEVC.
- Impostare la velocità di commutazione su 500-1.000 Hz (utilizzando il pulsante Regolazione della velocità dell'amplificatore), come determinato dalla velocità dell'elettrodo11.
- Consegnare un lampo di luce, e osservare l'afflusso di ioni evocati.
NOTA: Questa è la corrente di trasduzione o di luce(Figura 5). - Tornare alla modalità Bridge sull'amplificatore e registrare un potenziale recettore inviando un lampo luminoso (vedi sezione 3). Assicurarsi che la cellula fotorecettore sia totalmente adattata alle condizioni scure. Misurare le caratteristiche potenziali del recettore (ampiezza e durata) e confrontarle con le prime misurazioni. Si supponga che la cellula impalata del fotorecettore sia una cellula sana se ha le stesse caratteristiche.
NOTA: Dopo l'ablazione del gambo dell'occhio, la preparazione biologica è praticabile durante le seguenti 2 h.
- Protocollo a due impulsi: misurare il recupero dalla desensibilizzazione con un protocollo luce-flash a due.
NOTA: il protocollo light-flash è simile al protocollo standard di tensione a due impulsi utilizzato per misurare il recupero dall'inattivazione dei canali impolcati della tensione20. Il primo lampo luminoso provoca un cambiamento temporaneo nella sensibilità della cellula fotorecettore e il secondo flash valuta lo stato della conduttanza attivata dalla luce.- Fornire un paio di impulsi di luce. Applicare il secondo flash dopo un intervallo di tempo desiderato (da 300 ms a 2 min).
- Digitalizzale le correnti a un campionamento di 10 KHz con il software di acquisizione dati e salva i dati per l'analisi off-linea 11.
NOTA: Una tabella con i valori di configurazione del software è inclusa come materiale supplementare.
5. Analisi dei dati
- Cinetica della corrente illuminata dalla luce
- Misurare tre parametri di corrente: latenza di attivazione L, il tempo trascorso dalla consegna light-flash fino a quando la corrente raggiunge il 10% della sua ampiezza massima (Figura 5); ampiezza di corrente massima o massima Ip; e desensibilizzazione tempo costante T. Misurare la costante del tempo di desensibilizzazione (sezione) adattando la fase di decadimento corrente a:
dove, A - I (t) è una costante positiva (Figura 5).
- Misurare tre parametri di corrente: latenza di attivazione L, il tempo trascorso dalla consegna light-flash fino a quando la corrente raggiunge il 10% della sua ampiezza massima (Figura 5); ampiezza di corrente massima o massima Ip; e desensibilizzazione tempo costante T. Misurare la costante del tempo di desensibilizzazione (sezione) adattando la fase di decadimento corrente a:
- Desensibilizzazione e recupero
Nota: il recupero dalla desensibilità è stato valutato come il rapporto p2/p1, dove p1 è il parametro rilevante (L, Ipo T) della corrente di controllo e p2 è il parametro corrispondente della seconda test-corrente.- Grafico p2/p1 (L, Ipo T) in funzione del tempo tra gli impulsi.
- A seconda del parametro, adattare i punti di ogni stampa a:
o a:
- Utilizzare un test statistico appropriato per determinare il numero di termini esponenziali necessari per adattare i dati sperimentali.
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Representative Results
In primo luogo, si ottiene un potenziale recettore rappresentativo delle cellule fotorecettrici dei gamberi (Figura 4). Successivamente, è stato applicato un test light-flash per attivare la corrente di trasduzione della luce (Figura 5). La corrente di trasduzione cationica1 si attiva dopo un ritardo, raggiungendo un massimo e successivamente scende lentamente in uno stato desensibilizzato assorbente da cui si riprende lentamente.
È ragionevole supporre che la lunga latenza L (decine di millisecondi) della corrente luminosa dipenda dagli eventi biochimici innescati dalla luce, che coinvolgono percorsi proteici G. L'ampiezza della corrente di picco Ip dipende dalla frazione di canali disponibili per l'apertura e dai tassi relativi di attivazione e inattivazione correnti. Quest'ultimo è valutato dalla costante di decadimento T.
D'altra parte, il recupero di L dovrebbe essere correlato al tasso di recupero della cascata di fototraduzione biochimica; Il recupero dipende sia dai cambiamenti conformazionali intrinseci delle proteine responsabili della conduttanza iosa, sia dal tasso di recupero della cascata di fototrasduzione biochimica. Quest'ultimo potrebbe anche essere correlato al recupero di T. Inoltre, la variazione parallela di L e T suggerisce che un fattore biochimico comune (o fattori; ad esempio,lo stato di fosforiliatura del canale) può influenzare entrambi i parametri1.
Successivamente è stato applicato un protocollo a due flash (Figura 6) per determinare la cinetica del recupero dalla desensibilità (Figura 7) in momenti diversi del ciclo circadiano ( Figura8).
Figura 1. Diagramma lineare della configurazione dell'attrezzatura. Connessioni tra personal computer (PC)(Pc)( A ), interfaccia (B), oscilloscopio (C), amplificatore a mora -D, fotostimolatore (E) e il sistema headstage/holder/microelettrodi della configurazione dell'apparecchiatura (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Cameradiperlamento A. (A) La camera di registrazione all'interno di una gabbia di Faraday con il suo sistema di aspirazione di superfusione. È anche mostrato la posizione del sistema di fotostimolatori, microscopio e micromanipolatore-headstage-microelettrodi. (B) Diagramma della camera di registrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Ampiezza dell'elettroretinogramma (ERG). (A) Gamberi. (B) Trama rappresentativa dell'ampiezza ERG dei fotorecettori dei gamberi (i dati sono stati presi ogni 20 min) in funzione del tempo circadiano. L'esistenza di un ritmo circadiano può essere chiaramente apprezzata. Si noti che per ogni ciclo, l'inizio dell'attività coincide con il tempo circadiano 0. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Potenziale del recettore. Potenziale del recettore rappresentativo evocato da un lampo luminoso (luce bianca, 7,2 kW/m2, durata 10). Questa cifra è stata modificata da Barriga-Montoya, C, et al. 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Corrente di trasduzione. Corrente di trasduzione rappresentativa innescata da un lampo luminoso (luce bianca, 7,2 kW/m2, durata 10) applicata con la tensione mantenuta costante al potenziale di riposo del fotorecettore. Sono indicati la latenza corrente, l'ampiezza di picco e la fase di desensibilizzazione. Questa cifra è stata modificata da Barriga-Montoya, C, et al. 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Protocollo a due impulsi. Correnti suscitate da un paio di lampi di luce. Gli stimoli luminosi sono stati applicati a 0 ms e 700 ms (indicati da frecce). Questa cifra è stata modificata da 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Recupero dalla desensibilizzazione. (A) Ip: recupero corrente di picco, (B) L: recupero latenza, (C) T: tempo di desensibilità costante recupero T. Gli esperimenti sono stati effettuati a 0 h CT. Questa cifra è stata modificata da Barriga-Montoya, C, et al. 2. I risultati sono espressi come la media e la deviazione standard del numero di esperimenti (n . 11). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8. Recupero dalla desensibilizzazione in funzione della Tac. (A) Ip recupero, (B) L recupero, (C) recupero. (D) Costanti temporali ponderate. I processi bifasici sono contrassegnati da una freccia. Questa cifra è stata modificata da Barriga-Montoya, C, et al. 2. I risultati sono espressi come la media e la deviazione standard del numero di esperimenti (n . 11). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Il gambero ha dimostrato di essere un modello eccellente grazie alla sua capacità di sopravvivere in condizioni non naturali. C'è un facile accesso alle analisi elettrofisiologiche in vivo e in vitro. Inoltre, i crostacei sono un gruppo favorevole per la ricerca neurobiologica nel campo della cronobiologia comparativa21.
In questo articolo, lo studio della desensibilità e del recupero della corrente di trasduzione attivata dalla luce delle cellule fotorecettrici dei gamberi viene mostrato utilizzando la tecnica di registrazione intracellulare. Tuttavia, crediamo che la stessa tecnica potrebbe essere adattata ad altri sistemi visivi invertebrati, purché sia possibile accedere alle cellule fotorecettrici.
Per ottenere risultati sperimentali accettabili, è importante considerare alcuni passaggi critici del protocollo, tra cui l'eliminazione del rumore elettrico mediante messa a terra di tutte le apparecchiature, la costruzione di un elettrodo con una punta sufficientemente fine e la verifica che il la cellula fotorecettore è completamente adattata al buio prima dell'inizio del protocollo a due impulsi.
Nonostante i limiti della registrazione intracellulare come il danno della membrana, è possibile andare oltre e ottenere informazioni dettagliate sul meccanismo biofisico sottostante il segnale elettrico dei gamberi (o di un altro animale). Come in altri fotorecettori invertebrati, nei fotorecettori dei gamberi, la luce innesca una depolarizzazione graduata, o potenziale recettore, prodotta dall'attivazione di una conduttanza cationica. La conduttanza attivata dalla luce inizia dopo un ritardo o una latenza, e dopo aver raggiunto la sua ampiezza massima, diminuisce lentamente seguendo un percorso temporale esponenziale, quando i canali entrano in uno stato desensibilizzato assorbente.
La cinetica del recupero dalla desensibilizzazione della conduttanza ioscosa di gamberi, proveniente dalla luce, è stata ottenuta utilizzando un protocollo flash a due luci (simile allo standard protocollo a impulsi a due tensioni utilizzato per studiare il recupero dall'inattivazione dei canali di tensione-gated)20. È interessante notare che, e in contrasto con il caso ben noto di canali di tensione-gated, non solo l'ampiezza di picco, ma anche tutti i parametri attuali (Ip, L, T) cambiano dopo il primo stimolo luminoso, recuperando con caratteristici corsi temporali esponenziali all'originale, primi valori flash, come riportato altrove20. Questa variazione di tutti i parametri che caratterizzano la corrente indica la partecipazione dei secondi messaggeri nel sistema di trasduzione visiva di crayfish1,2,22,23,24.
Inoltre, e interessante, come illustrato nella Figura 8, il recupero di L, Ipe T dipende dal momento circadiano in cui vengono realizzati gli esperimenti. Sono necessari ulteriori studi per determinare la base molecolare di questo fenomeno. Naturalmente, è possibile ottenere informazioni simili utilizzando un'altra tecnica, come il morsetto. Tuttavia, l'ambiente intracellulare può essere notevolmente disturbato in altre tecniche, e questo potrebbe essere critico, se, ad esempio, elementi interni come proteine, aminoacidi, nucleotidi, tra molti altri, svolgono un ruolo rilevante nella generazione del segnale elettrico o nell'interazione con ormoni o neuromodulatori.
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Disclosures
Non abbiamo niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 sovvenzione. Gli autori vogliono ringraziare la signora Josefina Bolado, capo del dipartimento di traduzione scientifica della carta, da Divisiàn de Investigaciàn a Facultad de Medicina, UNAM, per aver modificato la versione in lingua inglese di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments, Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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