Summary
Ce protocole décrit en détail la génération des cellules souches pluripotentes induites exempte d’empreinte (CISP) de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans chargeur, suivie d’édition en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines et la caractérisation de la mis à jour le clones de cellules individuelles.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes embryonnaires et induits peuvent se renouveler et se différencier en plusieurs types de cellules du corps. Les cellules pluripotentes sont donc convoités pour la recherche en médecine régénératrice et sont actuellement en essais cliniques pour les maladies de l’oeil, diabète, maladies cardiaques et autres troubles. Le potentiel de se différencier en cellules spécialisées types couplés avec les progrès récents dans le génome de technologies, y compris le système CRISPR/Cas d’édition offrent des possibilités supplémentaires pour adapter le génome de l’iPSC pour applications variées y compris la maladie de modélisation, thérapie génique et polarisation des voies de différenciation, pour n’en nommer que quelques-uns. Parmi les technologies d’édition disponibles, le CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes a émergé comme un outil de choix pour l’édition spécifique du génome eucaryote. Les CRISPRs sont facilement accessible, peu coûteuse et très efficace en ingénierie des modifications ciblées. Le système nécessite une nucléase Cas9 et une séquence de guide (20-mer) spécifique à la cible génomique attenante à un 3-nucléotides « NGG » protospacer-adjacent-motif (PAM) pour le ciblage Cas9 au locus génomique désiré, aux côtés d’un traceur universel de liaison Cas9 (RNA ensemble appelé ARN de guide unique ou sgRNA). Nous présentons ici une étape par étape du protocole pour la production efficace d’iPSC alimentation indépendante et sans encombrement et décrire les méthodologies pour l’édition de génome d’iPSC en utilisant des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) de Cas9. Le génome du protocole d’édition est efficace et peut être facilement multiplexé par pre-complexants sgRNAs pour plus d’une cible avec la protéine Cas9 et débitent simultanément dans les cellules. Enfin, les auteurs décrivent une approche simplifiée pour l’identification et la caractérisation de la CISP, avec les modifications souhaitées. Pris ensemble, les stratégies décrites sont censés rationaliser la production et l’édition d’iPSC pour des applications multiples.
Introduction
La reprogrammation de cellules somatiques humaines à l’État pluripotent par la surexpression des facteurs de reprogrammation a révolutionné la recherche sur les cellules souches avec des applications dans la modélisation de la maladie, médecine régénérative et développement de médicaments. Plusieurs méthodes de reprogrammation non viraux sont disponibles pour l’administration de facteurs de reprogrammation et de générer la CISP, mais le processus est travail intensif et pas très efficace1. Les méthodes virales, bien qu’efficace, sont associés aux problèmes d’intégration de virus et de la tumorigénicité2,3,4. Dans ce manuscrit, les auteurs rapportent l’utilisation de virus cytoplasmique de Sendai pour livraison reprogrammation des facteurs et l’établissement de lignes iPSC exempte d’empreinte qui n’ont pas l’intégration de toute séquence de vecteur viral dans leurs génomes5. Le virus de Sendai est un virus à ARN qui est dilué de passages de cytoplasme ~ 10 cellule après l’infection et produit des facteurs de reprogrammation en abondance, conduisant à la rapide et efficace de reprogrammation6,7. Le CISP établie peut ensuite être facilement passés à un milieu sans alimentation afin d’éviter l’utilisation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) comme alimentation cellules8.
Dans cette publication, outre décrivant le virus Sendai médiée par la reprogrammation, nous décrivons également un protocole amélioré pour l’édition CISP, qui a le potentiel d’approvisionnement illimité de cellules humaines avec des modifications génétiques souhaitées pour la recherche. Nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9 pour la modification de la CISP, qui est maintenant utilisé pour un large éventail d’applications dont knock-ins et masquages, destructions à grande échelle de génomiques, bibliothèque mise en commun de dépistage pour la découverte du gène, génie génétique de nombreux organismes modèles et la thérapie de gène pour9,10,11. Cette technique implique la formation de complexes de Streptococcus pyogenes-dérivées Cas9 nucléase et 20-mer guident ARN qui obtenir une reconnaissance de la cible par appariement de bases avec la séquence cible génomique adjacent à 3' les protospacer de nucléotides adjacent séquence de motif (PAM). La nucléase Cas9 induit une nucléotides double brin pause ~ 3 sur le site de PAM, qui est par la suite réparé principalement par la fin non homologue, rejoindre la voie (NHEJ) conduisant à des insertions ou suppressions dans le cadre de lecture ouvert et donc fonctionnel masquage des gènes12.
Notre protocole amélioré inclut les détails pour la culture de cellules pancréatiques humaines, leur reprogrammation sur mitotically inactivés fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) pour atteindre une plus grande efficacité de reprogrammation, adaptation ultérieure de culture sans chargeur le Matrigel, caractérisation de CISP établie, CRISPR guidée RNA conception, préparation, livraison en CISP complexes RNP, seule cellule tri pour générer des lignées clonales de CISP édité, facile de dépistage et identification des modifications et la caractérisation des clones de cellule unique. Destructions génomiques ont été efficacement générées dans cette étude par l’introduction de protéines Cas9 et deux complexes de la RNP CRISPR sgRNA pour induire la doubles brin pauses (CDB) et les segments de la suppression de l’intervenant. Cette méthode tire parti de l’utilisation de deux guides pour générer les destructions dans le cadre de lecture ouvert, rendement élevé de NHEJ menant à faible nombre de clones qu’il fallait être caractérisé et simple présélection des clones par le capillaire automatisé unité d’électrophorèse, analyseur de fragment. Ces génome efficaces méthodes pour générer des modèles de maladies humaines axée sur les cellules souches d’édition va bientôt devenir une approche standard et courante dans tout laboratoire de cellules souches. Enfin, génome précis édition rendra possible d’aller au-delà de modélisation de la maladie de cellules souches et potentiellement pourrait aider catalysent les thérapies à base cellulaire.
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Protocol
1. Protocole de reprogrammation
- génération d’iPSC humaine de cellules pancréatiques humaines primaires
- manteau un puits 6 plaque avec 1,5 mg/mL de collagène froid et permettez-lui de gel à 37 ° C pendant 1 h.
- Plaque de passage début humains cellules pancréatiques primaires dans un milieu Prigrow III (~ 1 à 1,5 × 10 5 éléments) sur un collagène enduit plaque 6 puits jour -2 pour atteindre environ 2,5 × 10 5 cellules ou au moins 60 % confluency par bien sur le jour de transduction (jour 0). Pour la première étude, plaque de puits au moins 2-3 pour obtenir un puits avec confluence désiré le jour 0. Utiliser au moins un puits comme un contrôle pour compter les cellules.
- Le jour de la transduction (jour 0), réchauffer 1 mL de milieu Prigrow III dans un bain d’eau pour chaque puits être transduites. Moissonner les cellules d’un contrôle bien dans 1 mL de milieu FBS de 10 % en utilisant 1 mL de trypsine/EDTA pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules se détachement pour effectuer un nombre de cellules. Pour faire 10 % FBS médium, ajouter DMEM, 10 % BF, 1 % L-Glutamine, 1 % Pyruvate de Sodium et 1 % acides aminés non-essentiels.
- Comte et vérifier la viabilité des cellules à l’aide du compteur de cellules et de calculer le volume de chaque virus pour atteindre la cible basée sur le titre de virus et le nombre de cellule. Utiliser la multiplicité d’infection (MOI) de KOS = 5, hc-Myc = 5 et hKlf4 = 3 pour les cellules du pancréas.
- Un ensemble dégel de Sendai vector tubes dans le stockage de-80 ° C sur la glace et ajouter avec précaution les volumes calculés de chacun des trois tubes vecteur de Sendai à 1 mL de milieu de Prigrow III, préalablement chauffé à 37 ° C. Pipette doucement pour mélanger la solution. Un puits dans une plaque 6 puits est suffisant pour la transduction avec vecteurs viraux de Sendai pour générer des cellules reprogrammés.
- Aspirer le milieu Prigrow III des cellules et ajouter lentement le mélange de virus reprogrammation dans les puits contenant les cellules. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO 2.
- Soigneusement jeter le mélange de virus sur les cellules et remplacer par un milieu frais Prigrow III le lendemain, 24 h après la transduction. La culture des cellules pour 5D et modifier le milieu de chaque autre jour.
- Le jour 5, préparer les MEFs sur 0,1 % gélatine préalablement enduit Pétri 10 cm (1,3 x 10 6 cellules/plat). Croître de MEFs dans des flacons de T175 jusqu’au jour 4 et puis le jour 5, exposer les cellules à 6 000 rads provenant d’une source de rayonnement γ avant d’ensemencer les cellules 13 ou l’utilisation de la source commerciale de MEF.
- Au jour 6, utiliser 1 mL de solution de détachement cellulaire pendant 10 min pour détacher les cellules transduits, tous les plats de force expéditionnaire des marines dans un milieu Prigrow III plaque avec inhibiteur de la roche (5 mM stock, finale 10 µM) et incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec un accuei humidifié re de 5 % de CO 2.
- Changer le support de Prigrow III au milieu de CSEh le lendemain. Pour la fabrication de 500 mL de milieu de CSEh, ajouter DMEM/F-12, 20 % (v/v) remplacement de sérum knockout (KOSR), 5 ng/mL bFGF ; 1 mM de l-glutamine ; Acides aminés non essentiels de 100 µM et 100 µM 2-mercaptoéthanol. Changer le milieu doucement tous les jours maintenant.
- Observer les plaques régulièrement pour l’apparition des amas de cellules ou de colonies indicative des cellules reprogrammés. Les cellules transformées forment des agrégats clonales avec morphologie pavées et gros noyau et nucléoles. Marquer la probable ' iPSC ' colonies et vérifiez-les régulièrement pour croissance.
- Près de quatre semaines après la transduction comme colonies sont prêts pour la cueillette ou transfert, préparer 24 plats MEF en ensemençant 1,3 x 10 plaque revêtus de 6 cellules/gélatine comme avant pour le transfert des colonies individuelles.
- Prepare le membrane de la matrice (p. ex., Matrigel) par aliquotage qu'il basé sur le facteur de dilution sur le certificat d’analyse. Ajouter une aliquote à 25 mL de DMEM/F-12 à manteau quatre puits 6 assiettes (1 mL/puits) et incuber à température ambiante (RT) pendant au moins 1 h avant utilisation. Choisir manuellement les colonies 12-24 en utilisant une pointe de pipette stérile pour aspirer les et transférer sur des plaques de MEF dans 500 µL de milieu de CSEh.
- Aspirer les médias dans le puits pour séparer les colonies ou perturber doucement. Aussi vous procurer des colonies de 24-48 sur plaques 24 puits de matrice membrane enduite. Pour les plaques à membrane enduite, utilisez mTeSR1 (complété avec inhibiteur de roche 10 µM) pendant 24 h et changez tous les jours. Au bout de 6-10 jours de cueillette des colonies, ils sont prêts à être transférés aux nouvelle plaques à membrane 24 puits et/ou 12 puits pour expansion clonale.
- Si nécessaire, détachez les colonies sur MEFs pendant 20 min à l’aide de collagénase de 1 mg/mL, laver deux fois avec CSEh/mTeSR1 et transfert à membrane enduit plaques de 12 ou 24 puits. S’il y a assez robustes colonies qui poussent sur la membrane de la matrice de l’étape 1.1.12, geler les colonies sur MEFs utilisant iPSC médias selon les directives du fabricant de congélation ' directives de s.
- Détacher les colonies robustes plaqués sur la membrane à l’étape 1.1.12 avec 500 µL d’a pendant 20 min et plaque à nouveau sur la membrane de la matrice enduit 12 plats. Gratter le manuellement les cellules différenciées ou des cellules nourricières MEF contaminantes pour enrichir pour pluripotentes clones sur la membrane.
- Étendre les clones après 6-8 d en cultivant sur membrane enduit plaques en dissociant la solution d’a comme avant et placage des agrégats de petites cellules fraîches membrane enduit plaque de 6 ou 12 puits. Milieu de mTeSR1 change tous les jours. Caractériser les clones reprogrammés par coloration, immunomarquage pluripotence marqueurs (OCT3/4 et NANOG), FACS analyse des marqueurs de surface pluripotentes et tests de différenciation de la phosphatase alcaline. Croître et culture des clones sur plaques de revêtement membrane pour toutes les épreuves y compris CRISPR édition comme expliqué ci-dessus, à moins que l’autre solution d’enrobage est spécifiquement mentionnée.
- CISP characterization of Human
- Phosphatase alcaline coloration
Remarque : une trousse commerciale est utilisée ici. Consultez la Table des matières.- Plaque putatif CISP humaine sur plaque 24 puits et de la culture pendant 4-5 jours avec changement de support par jour.
- Pour démarrer le protocole de coloration, d’aspirer le milieu de culture et de laver les cellules avec 1 mL de PBS 1 x 0,05 % Tween 20 (PBST).
- Ajouter 0,5 mL de solution de correctif dans le kit sur les cellules et incuber à RT pour 2 à 5 min. aspirer la solution fix et laver les cellules fixes avec PBST. Ne pas laisser les puits sécher.
- Ajouter 0,5 mL de la Solution fraîchement préparée de substrat d’AP / puits en mélangeant la solution A, B et C. Incuber les cellules dans l’obscurité (enveloppé avec du papier ou dans un conteneur foncé) à température ambiante pendant 5 à 15 min.
Remarque : Le changement de couleur de suivre de près et la réaction s’arrête lorsque la couleur vire lumineuse pour éviter de tacher non-spécifiques. - Arrêter la réaction en aspirer la Solution de substrat AP et laver les puits deux fois avec 2 mL de PBS 1 x.
- Observer les colonies sous le microscope et capturer les images à un grossissement de 10 X à l’aide de n’importe quel microscope en champ lumineux avec un appareil photo ou de 4 X.
- Immunostaining
- plaque humain CISP en plaque 24 puits et de la culture pendant 4-5 jours avec changement de support, chaque jour.
- Laver les cellules une fois brièvement avec PBS et fix pendant 20 min avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS.
- Laver trois fois pendant 10 min (3 x, 10 min) avec du PBS à température ambiante. Sites non spécifiques
- saturer avec 10 % chèvre ou âne sérum normal (NS, selon l’anticorps secondaire animale a été soulevée dans) dans du PBS pendant 40 min à température ambiante. Pour seulement intracellulaires épitopes, incluent 0,3 % TX-100 dans du PBS (TX/PBS) pour permeabilize.
- Lavage 3 x 5 min avec du PBS à température ambiante.
- Diluer les anticorps OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 et SOX17 dans une solution fraîche de 5 % NS dans du PBS et incuber pendant 2 h à ta ou toute la nuit à 4 ° C.
- Laver 3 fois pendant 5 min avec du PBS à température ambiante.
- Diluer approprié secondaire Alexa Fluor 488 ou 568 anticorps chez 5 % NS/PBS et incuber les cellules pendant 1 h à température ambiante.
- Laver 3 fois pendant 5 min à température ambiante.
- Incuber au DAPI dans du PBS 10 min et lavage x 2 pendant 5 min à RT. utiliser un microscope à fluorescence pour prendre des photos.
- Tri cellulaire activés par fluorescence (FACS)
- plaque CISP humaine dans une plaque 6 puits et de la culture jusqu'à ce que les colonies devenue 80 % anastomosé (au moins 10 5 cellules/Echantillon) avec variation moyenne quotidienne de mTeSR1.
- Le jour de l’expérience, isoler les cellules et se dissocier pour une suspension monocellulaire comme expliqué ci-dessus dans le protocole. Laver avec 10 % moyen FBS.
- Pour les marqueurs de surface, resuspendre dans 0,5 à 1 mL de milieu FBS de 10 % et de garder sur Ice.
- Pour les marqueurs intracellulaires, remettre en suspension dans 1 mL de 4 % PFA/PBS et incuber pendant 10 min à température ambiante. Laver avec 10 % milieu de FBS. Resuspendre dans 0,1 % TX/PBS et incuber pendant 15 minutes sur la glace. Lavez à nouveau avec 10 % milieu de FBS. Resuspendre dans 0,5 à 1 mL de milieu FBS de 10 % et de garder sur Ice.
- Ajouter 50 µL de la suspension cellulaire à 50 µL de 10 % BF moyenne contenant quantité recommandée de TRA-1-60, TRA-1-81 ou SSEA-4 anticorps et incuber 30 min à 1 h.
- Laver deux fois avec 10 % BF.
- Remettre en suspension dans 100 µL de 10 % milieu FBS contenant des anticorps secondaires fluorescents et incuber pendant 30 min. Laver deux fois avec 10 % FBS et remettre dans un volume approprié de 10 % FBS. Les cellules vivantes peuvent être différenciés de cellules mortes de colorant de l’iodure de propidium ajouté à < 1 µg/mL pour estimer l’apoptose des cellules au cours du processus.
- Tri-lignée différenciation
- graines de deux plaques 6 puits avec 1,5 à 2 x 10 6 CISP/puits dans le milieu de mTeSR1 avec inhibiteur de roche 10 µM.
- Autoriser les cellules à se développer pendant 2-3 d avec mTeSR1 tous les jours de changement moyen jusqu'à ce que les puits soient 80-90 % anastomosé.
- Pour l’induction de l’ectoderme, ajouter le milieu d’induction neurale (NIM) selon le fabricant ' instructions de s dans 2-3 puits des plaques 6 puits.
- Remplacez le milieu RPMI contenant 2 % B27 supplément moins d’insuline et 12 µM CHIR99021 pour l’induction du mésoderme en 2-3 puits des plaques 14. Ajouter seulement RPMI contenant 2 % B27 supplément moins d’insuline pour les prochaines 24 h. Ajouter 5 mm IWP4 au milieu RPMI avec 2 % B27 supplément moins d’insuline pour les prochaines 24 heures. Après 72 h, remplacez les médias RPMI contenant le supplément de 2 % B27 conduisant à la génération de battre les cardiomyocytes en d. 2-3
- Pour l’induction de l’endoderme, modifier le milieu dans les puits des plaques 6 puits à 131 CMPD additionné de 1,5 g/L de bicarbonate de sodium, 1 x Glutamax, 10 mM de glucose, 0,5 % de BSA, 100 ng/mL GDF8 et 5 µm de CHIR99021 pendant 24 h. Culture dans le même milieu sans CHIR99021 pour 2-3 d 15.
- Se conformer au protocole d’immunomarquage à l’étape 2 pour tous les trois lignées et recherchez l’expression de marqueurs pertinents.
- Phosphatase alcaline coloration
2. IPSC Editing of Human Genome utilisant CRISPR-Cas9
- sgRNA et préparation de Cas9 protéine
- protéine Cas9 aliquotes dans des tubes de microcentrifuge dans des conditions stériles et stocker les aliquotes de geler les tubes à -80 ° C.
- Concevoir deux guide ARN par gène basé sur le logiciel du MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) ou toute autre CRISPR guide conception webtool de ciblage. Cible première ou deuxième exon du gène (basé sur la trame de lecture ouverte) pour générer les entrées défonçables. Choisissez les deux guides pour qu’ils coupent rapprochés (~ 30-100 bp apart) et nous pouvons visualiser facilement la suppression à l’aide de la même série d’amorces de dépistage. Choisissez les guides de la sortie du logiciel sur la base du score de qualité supérieure et de la diminution du nombre de sites hors cible. Concevoir des amorces de dépistage à l’aide de l’explosion de l’apprêt du programme (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Amorces de dépistage doit être au moins 100 bp loin le Cas9 coupe des sites et la taille du produit PCR doit être de préférence entre 400-700 bp plus facile amplification par PCR.
- Concevoir les deux sgRNA complémentaires oligo DNAs (19-22 nucléotides de long selon la séquence de guide) avec un Bsa1 couper site à chaque extrémité. Les oligo DNAs peut être synthétisé dans le commerce et recuit pour former l’ADN double brin. Pour le recuit, ajouter 1 µL de chaque de 100 µM guides, 25 µL de tampon (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, EDTA 1 mM) un recuit et 23 µL d’eau. Incuber dans un thermocycleur programmé pour démarrer à 95 ° C pendant 2 min et ensuite progressivement refroidir à 25 ° C pendant 45 min
- Clone le 2 µL de fragment qui en résulte en une enzyme de restriction Bsa1 digéré 1 µL de vecteur de pCR2.1 maison T7 promoteur avec un site de liaison de Cas9 utilisant T4 DNA ligase selon le fabricant ' protocole de s.
- Séquence les fragments d’ADN clonés et lorsque la fidélité est mis en place, en vitro transcrire les clones utilisant un kit de T7 pour générer des ARN guide unique. Purifier le sgRNAs avec un kit commercial et éluer dans de l’eau exempte de RNase. Vérifier la concentration en ARN.
- Transfection de hiPSCs
- hiPSCs en milieu mTeSR1 la Culture comme décrit ci-dessus jusqu'à ce que les cellules sont de 40-50 % anastomosé.
- Deux heures avant le nucleofection, remplacer le support avec 2 mL de milieu de mTeSR1 préchauffée contenant inhibiteur de roche 10 µM.
- Une heure plus tard, préparer puits de destination nucleofected cellules de membrane aspirante, préparé comme indiqué ci-dessus, de plaque de 12 puits et remplacez-les par préchauffée 1 mL de milieu de mTeSR1 avec inhibiteur de roche 10 µM. Maintenir à 37 ° C pendant l’incubation. Supplément
- Prepare nucleofection mélange principal (échelle de façon appropriée selon les échantillons) pour chaque échantillon en ajoutant 16,4 µL de cellules primaires P3 ; 3,6 µL du supplément 1 de la trousse nucleofector ; 0,5 µg de protéines Cas9 et 0,5 µg de chaque sgRNA dans 22 µL par volume réactionnel. vecteur de pMAX GFP a été également nucleofected selon le fabricant ' recommandations de s dans les cellules pour estimer approximativement l’efficacité de la transfection iPSC.
- Laver chaque bien avec 2 mL de PBS RT après aspiration le milieu contenant l’inhibiteur de la roche par les puits de l’iPSC. Aspirer puis PBS et incuber les plaques à 37 ° C pendant 10 min. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire
- Remettre en suspension les cellules dans 3 mL de milieu mTeSR1 et Pipetez doucement de haut en bas pour générer une suspension de cellules individuelles. Cellules de transfert dissocié d’une centrifugeuse de 15 mL tube contenant 5 mL de milieu de mTeSR1.
- Compter les cellules avec compteur de cellules et de calculer le volume total requis pour 0,5 x 10 6 cellules/transfection. Placer la quantité désirée de cellules dans le tube à centrifuger de 15 mL, centrifuger à 200 x g pendant 5 min à RT et aspirer le surnageant.
- Remettre en suspension dans chaque unité de 0,5 x 10 6 cellules dans 22 µL du mélange maître transfection préparé à l’étape 4. Cellules de transfert rapidement dans la chambre centrale d’un puits d’une bande de nucleocuvette. Placer la bandelette dans un nucleofector périphérique et nucleofect des cellules à l’aide du programme CB150.
- Après nucleofection, rapidement ajouter 80 µL de mTESR1 préchauffée milieu contenant 10 inhibiteur de roche µM dans chaque loge des nucleofected des cellules. Mélanger doucement en pipettant également, up et down.
- Transférer doucement les cellules de la bande au puits de la plaque de 12 puits revêtus de membrane contenant le support de mTeSR1 avec inhibiteur de roche préparé à l’étape 3.
- Après 1 d, changer au milieu de mTeSR1 frais sans inhibiteur de la roche. Récolte des cellules 2-3 jours après nucleofection pour le tri des unicellulaires.
- Unicellulaires isolement des hiPSCs ciblés
- un jour avant le tri, préparer les plaques à 96 puits MEF en ensemençant 2 x 10 6 cellules/gélatine-enduit plaque au milieu FBS de 10 %. Environ 70 à 80 % des clones survivre après nucleofection et 2-3 plaques de MEF peuvent être préparés pour chaque expérience édition.
- Après l’incubation durant la nuit, changer le support au milieu de CSEh (comme décrit précédemment) additionné de 100 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (inhibiteurs ajoutés aux médias afin d’améliorer la viabilité cellulaire unique) et 5 mg/mL la fibronectine pour favoriser l’adhérence.
- Remplacer le support sur le hiPSCs dans la plaque de 12 puits de mTeSR1 à mTeSR1 additionné de 1 x SMC4 pendant au moins 2 h avant le tri monocellulaire.
- Aspirer le milieu de hiPSCs et laver les cellules doucement avec du PBS. Ajouter 500 µL de solution de détachement cellulaire dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 10 min après aspiration du PBS. Générer la suspension monocellulaire en ajoutant 1 mL de mTeSR1 (sans additifs) dans chaque puits et de pipetage monte et descend doucement plusieurs fois.
- Placer suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 200 x g à RT. aspirer surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de mTeSR1.
- Trier les cellules dans des cellules individuelles à l’aide d’un trieur de cellules avec buse de 100 mm dans des conditions stériles avec une cellule dans le puits individuel des plaques 96 puits préparés à l’étape 1.
- Quatre jours après le tri, formation des colonies doit être apparente ; à ce moment remplacer le milieu de culture par CSEh additionné de 1 x SMC4.
- Huit jours après le tri, remplacez moyen moyen de CSEh et de la culture pour 2 d.
- Détacher les colonies à l’aide de collagénase de 1 mg/mL pendant 20 min et transférez-les sur plaques 24 puits membrane enduite en mTeSR1 avec l’inhibiteur de la roche. Laissez les clones de cellules individuelles croître et extraire leur ADN génomique après duplication ou leur expansion. Utiliser des amorces spécifiques de gènes pour amplifier l’ADN par PCR cible.
- Utiliser le kit analyseur de fragment pour analyse initiale de la région génomique de PCR amplifiés cible de tous les clones de leur exécution via le gel/colorant mélange selon le fabricant ' instructions de s. Estimer la taille du fragment résultant dans le logiciel PROSize en le comparant avec l’échelle appropriée, qui est exécuté avec les échantillons. Séquencer le statu ' édition ' clones et analyser les données de séquençage pour confirmer la modification ou la suppression.
- Permettant de différencier les clones monoallelic et bialléliques, amplifier la séquence éditée par PCR et clone dans le vecteur pJET1.2. Envoyer au moins 8-10 clones pour l’ordonnancement et de vérifier la séquence pour confirmer la modification dans un ou les deux allèles.
- Une fois correctement ciblées iPSC clones ont été identifiés par le biais de génotypage, examiner pour confirmer qu’ils n’ont pas perdu pluripotence ou acquise des anomalies chromosomiques à travers le processus.
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Representative Results
Dans cette publication, nous avons suivi un protocole simple mais efficace pour la génération de l’iPSC des cellules du pancréas, à l’aide d’intégration ou vecteurs de virus de Sendai exempte d’empreinte. Figure 1 a montre une représentation schématique du présent protocole reprogrammation. Les cellules pancréatiques humaines ont été achetés dans le commerce, cultivées dans un milieu Prigrow III et transduites avec virus Sendai comme expliqué ci-dessus. Transduite broche en forme de cellules pancréatiques ne montre pas de modifications morphologiques pendant ~ 5 jours après virus Sendai transduction au jour 0, mais puis arrondi avec nucléoles et le plus gros noyau. Quelques premières colonies ont été observés après une transduction après semaine mais ils n’ont pas choisis, comme dans notre expérience, ces colonies rapidement se dissocient et sont généralement les « cellules partiellement reprogrammés début » qui n’établissent pas de colonies robustes. Environ 10-15 jours transduction post, petites colonies brillantes ont été observés et ont été choisis après une croissance (Figure 1 b, en haut à droite). IPSC humaine colonies sont compacts, serrés avec des bords clairs (considérés comme « entièrement reprogrammés cellules ») (Figure 1 b, au milieu en bas jour 23) et « cellules partiellement reprogrammés » sont lâches avec des écarts dans la colonie (Figure 1 b, jour 23 en bas à droite). Les colonies de cellules pancréatiques reprogrammé poussaient le jour 18 (Figure 1 ben bas à gauche) et étaient assez grands pour être cueillies manuellement par jour 23 (Figure 1 b, au milieu en bas). Les colonies ont été cultivées sur des plaques de revêtement membrane après la cueillette pour obtenir exempt de chargeur iPSC par jour 30-40 (Figure 2 a, , gauche). Certaines de ces colonies « robustes » exempt d’engraissement ont été élargies et caractérisées pour l’expression de la phosphatase alcaline, pluripotence et marqueurs de surface dans des conditions sans chargeur. Tous les clones testés étaient positifs pour la phosphatase alcaline, ils s’est avéré rouge vif après l’essai (Figure 2 a, à droite). Les marqueurs de pluripotence OCT4, NANOG, SSEA4, TRA-1-60 et TRA-1-81 ont aussi été observés à être fortement exprimée dans tous les clones par immunomarquage ou analyse de FACS (Figure 2 b et Figure 3 a).
Ces résultats démontrent que les colonies humaines iPSC générés à partir des cellules pancréatiques exprimé marqueurs pluripotence dans des conditions sans chargeur. La pluripotence a également été évaluée par différenciation dirigée de l’iPSC humaine à trois couches de germe : ectoderme, mésoderme et endoderme. Clones sur membrane puissamment différencient aux neurones TUJ1 séropositifs (ectoderme), NKX2-5 positives battant cardiomyocytes (mésoderme) et des cellules endodermiques SOX17 positives (Figure 3 b).
Après la caractérisation complète, 3-robuste et sans chargeur iPSC lignées clonales ont été choisies pour le génome édition études. Les deux guides avec BsaI sites coupées aux extrémités ont été conçus pour chaque gène couper rapprochés (c.-à-d., n moins de ~ 100 bp). Le schéma du protocole est illustré à la Figure 4. Cette stratégie de suppression utilisée pour les gènes cibles nous a permis de supprimer facilement une partie de la première ou la deuxième exon d’un gène. Cette stratégie a été très efficace et nous pouvions isoler les clones édités dans chaque tentative. Les guides ont été clonés dans le vecteur BsaI digéré et in vitro transcrit comme décrit ci-dessus. Nous nucleofected guides (RNAs) et Cas9 protéine sous forme de complexes de RNP pour montage rapide et efficace. Aussi, nous avons trié les cellules comme les cellules individuelles sur MEFs comme la récupération de cellules est plus élevée par rapport à des cellules triées séparément sur des plaques recouvertes de membrane. L’ADN génomique a été isolé chez tous les clones, la partie de la cible a été amplifiée par PCR et résolue sur analyseur de fragment pour dépister les changements de taille des fragments de la cible par rapport à des contrôles. La taille du fragment a été comparée à l’échelle avec les échantillons pour détecter des clones « édités » (Figure 4, en bas). Cela fait dépistage des clones facile comme nous pourrions passer par > 90 clones dans une assiette et les résultats ont été obtenus avec la précision de ± 3 bp. Les clones sélectionnés ont été séquencés puis pour confirmer les clones de type sauvage et mutés. Les clones de type sauvage n’ont aucune suppression ou ajout de bases tandis que les clones mutés ont ajout ou suppression dans l’ordre par rapport au type sauvage. Les clones montrant suppression ou ajout dans le séquençage étaient pJET1.2 élargi et cloné en vecteur d’identifier monoallelic et bialléliques clones par séquençage d’au moins 8-10 colonies par clonage. Clones de Monoallelic avaient des bases supprimé ou ajouté à un allèle et l’autre était inchangée et semblable à l’allèle de type sauvage. Bialléliques clones avaient des destructions dans les deux allèles. Environ trois cents clones ont examiné tous les gènes cibles, qui a identifié environ 9 monoallelic suppression clones et 3 clones de suppression bialléliques dans chaque cas. Cela correspond approximativement à une réduction de 3 fois dans la fréquence de génération des clones bialléliques comparée aux clones de monoallelic. L’hétérogénéité dans les amplicons suppression reflète réparation NHEJ imparfaite et incompatible. L’expression du gène a finalement été confirmée par l’extraction de RNA de cellules cibles et en effectuant la RT-PCR.
Figure 1 : reprogrammation de cellules pancréatiques humaines aux cellules pluripotentes exempte d’engraissement (iPSC). (A) A Protocole schématique pour la génération de l’iPSC de cellules pancréatiques humaines est montré. Les cellules pancréatiques ont été cultivés sur des plaques recouvertes de collagène et puis transférés à MEFs après transduction avec des vecteurs de virus Sendai humain. Les colonies complètement reprogrammé ont été ensuite transférés à membrane CSEh qualifié et caractérisés. (B) morphologiques change après virus Sendai transduction. Avant la transduction, cellules pancréatiques Voir la morphologie typique de broche-like (en haut à gauche, jour 0). Petites colonies serrées forment sur MEFs par jour 12, ressemblant à des colonies de cellules pluripotentes humaines. Normalement les colonies entièrement reprogrammé iPSC humaine ont des limites très claires et peuvent être ramassés par jour 23-30. Une colonie dissociée au jour 23 est illustrée sur fond à droite. Toutes les images ont été capturées à un grossissement de X 100 (objectif X 10 et 10 X oculaire). Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : caractérisation des humain iPSC. (A) A image de contraste phase typique d’une colonie de l’iPSC après la cueillette et de la culture dans des conditions sans alimentation (40 X, objectif 4 X et 10 X oculaire ; gauche) après virus Sendai reprogrammation des cellules du pancréas. Phosphatase alcaline teintée rouge iPSC colonie est sur la droite. Pour la coloration de la phosphatase alcaline, les colonies de l’iPSC ont été fixées et colorées rouge après l’addition de la solution de substrat de la trousse. Les images ont été saisies à 40 X. (B) Immunostaining des marqueurs pluripotence NANOG et OCT3/4 au CISP de culture cellulaire pancréatique humaine exempte d’engraissement. DAPI a été utilisé pour colorer le noyau bleu comme un contrôle. Toutes les images ont été prises à un grossissement de 100 X. Echelle = 100 µm dans toutes les images. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : caractérisation de pluripotence et différenciation potentiels de l’iPSC. (A), FACS analyse des marqueurs de surface SSEA4, TRA-1-60 et TRA-1-81 au CISP exempte d’engraissement. Les cellules ont été dissociées à suspension monocellulaire et colorés pour des marqueurs de surface SSEA-4, TRA-1-60 et TRA-1-81. Le pic pourpre contient des cellules de résultats négatifs (contrôle de l’anticorps) iPSC et iPSC pancréatique peut être visualisée par le pic vert. (B) l’imagerie par immunofluorescence des gènes marqueurs de couche de germe. L’expression de marqueurs TUJ1 ectoderme (vert), de mésoderme NKX2-5 (rouge) et de SOX17 endoderme (rouge) dans les cellules après différenciation dirigée de l’iPSC pancréatique. Correspondant contrôle nucléaire tache DAPI est bleu. Toutes les images ont été prises à un grossissement de 100 X. Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : schéma de la stratégie de suppression CRISPR/Cas9. Une paire de sgRNA a été conçu (rouge marquée) avec BsaI sites coupés à la fin (représenté par F et R) préférence ciblant le premier exon, recuits, cloné dans BsaI digérée mis à jour le vecteur (BsaI site a souligné gris, pCR2.1), séquencé et traduit en vitro . La séquence soulignée du vecteur représente la partie supprimée après digestion BsaI. La position des amorces de dépistage est indiquée en bleu. Cas9 et guider les ARN ont été nucleofected en iPSC exempte d’engraissement comme un complexe pour les destructions de la génomiques. CISP était alors seule cellule trié sur les plaques à 96 puits MEF, cultivées, transféré à membrane, élargi et projeté par l’analyseur de fragment. Pour l’exécution des exemples sur l’analyseur, l’ADN génomique de Cas9 et clones guide transfectée sur membrane ont été extraites et transmises le mélange gel/colorant dans l’analyseur à sélectionner des clones « édités » potentiels (au milieu en bas). Les marqueurs d’échelle pertinente, WT et potentiel clones édités sont marqués. L’expression du gène a été confirmée en extrayant RNA et en analysant avec Q-PCR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Reprogrammation de cellules somatiques humaines au CISP a donné un élan important aux champs de recherche de biologie fondamentale, médecine personnalisée, modélisation de maladies, développement des médicaments et la médecine régénérative,16. Nombreuses méthodes couramment utilisées de génération humaine iPSC nécessitent l’utilisation de virus, avec le risque d’intégration dans le génome hôte ou vecteurs épisomiques avec faible efficacité de reprogrammation. Nous présentons ici une méthode efficace pour générer des CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines avec Sendai-virus, ce qui conduit à « l’empreinte libre » et reprogrammation efficace. Le CISP humaine qui en résultent est libres de transgènes virale, maintenir la pluripotence et éviter l’utilisation de facteurs exogènes inconnus. La génération de la CISP dans des conditions sans alimentation a faible efficacité de reprogrammation, alors nous avons reprogrammé les cellules pancréatiques primaires sur des cellules nourricières et ensuite les colonies à membrane exempte d’engraissement pour l’expansion et la caractérisation et la culture. La fusion de ces techniques offre stable, fiable et plus efficace programmation iPSC.
Nous avons également généré CISP de fibroblastes humains et d’autres cellules primaires avec cette méthode, ce qui suggère que le virus Sendai peut être utilisé pour reprogrammer la grande variété de cellules. Considérations sont importantes : un besoin de confluence optimal des cellules primaires pour être reprogrammé comme trop peu ou trop de répercussions de cellules reprogrammation efficacité ; un passage antérieur des cellules primaires lorsque les cellules se divisent encore de façon optimale ; attention titrage de la virale vecteurs qui résulte dans l’apoptose cellulaire minimal et une efficacité élevée conduisant à relever facile des colonies robustes ; vérification de la perte d’expression de transgènes de vecteur de Sendai par PCR à 10-15 passages pour s’assurer que le CISP est « empreinte libre » ; et, des conditions strictes et stériles pour la culture de l’iPSC sur membrane.
Nous avons utilisé une méthode pratique et efficace de modification du génome CRISPR pour modifier le génome de l’iPSC. Cette technique combine Cas9 protéine et des sgRNA, des complexes de RNP à reconnaître et à s’attacher les séquences d’ADN complémentaires. Il peut être facilement adapté pour cibler une séquence génomique en changeant simplement le guide de bp 20 RNA. Notre méthode fournit un protocole facile, efficace et reproductible d’édition du CISP humain car ils sont plus fastidieuses, difficiles à transmettre et cher à entretenir que les autres cellules. Nous concevons au moins deux guides adjacents mais sans recouvrement pour chaque gène cible afin qu’un seul ensemble d’amorces de dépistage peut être utilisé pour le dépistage des clones édités. En outre, l’utilisation de deux guides ~ 30-100 bp apart génère une grande délétion, qui peut être facilement visualisée au cours de l’examen préalable et assure la déplétion des protéines. Les guides peuvent être testés dans les cellules HEK-293 initialement pour estimer l’efficacité avant de commencer le dosage en iPSC. En outre, il est essentiel d’établir des paramètres pour la transfection systématique des réactifs en iPSC. À l’aide de plasmide pMAXGFP, efficacité de transfection de > 80 % et l’efficacité de ciblage/perturbation de gène de 3 à 10 % au CISP est régulièrement réalisées. La livraison directe des complexes de Cas9 RNP cellules dans notre protocole prévoit une action rapide et chiffre d’affaires rapide et maintient des taux élevés de modification ciblée. Notre approche utilise seule cellule Tri suite nucleofection des guides et des protéines de Cas9, surmonter un obstacle de ciblage de gènes en mixte iPSC population et assurer la clonalité des cellules. Cette approche globale « originale » est simple, facile à multiplex, prend seulement quelques semaines et ne nécessite pas de n’importe quelle sélection antibiotique. Nous n’avons pas observé toute perte dans l’efficacité en introduisant des destructions CRISPRs séquentiellement dans une lignée cellulaire ou la CISP, bien que caryotype analyse doit être effectuée dans de tels cas pour assurer la stabilité génomique. Les clones doivent également être vérifiés pour l’expression des marqueurs pluripotence. Bien que, pas une mise au point de cette publication, le présent protocole peut être coopté pour induire une modification génétique précise en incluant le modèle de réparation dans la transfection cocktail17,18.
Enfin, selon notre expérience, sont des considérations importantes pour iPSC protocole d’édition : conception rationnelle des guides pour minimiser ou éviter complètement hors mutations de cible surtout dans la « région de semences » ou à proximité de motif de PAM modifiée ; optimiser l’efficacité nucleofection le CISP pour assurer la livraison du RNP ; vérification de la qualité des guides préparés ; titrage du guide et les concentrations de protéine Cas9 et valider leur activité par clivage biochimiques in vitro tests ou tel que décrit dans cet article de cellssuch humaine comme HEK, cellules qui sont plus faciles à la culture et transfecter ; l’utilisation des premiers CISP de passage qui se trouvent dans la phase logarithmique de croissance et d’atteindre environ 50 % confluence ; manipulation soigneuse de cellules avec un doux moyen change suivant la seule cellule de tri afin d’assurer la survie des cellules.
Nous croyons que le protocole décrit ci-dessus défini dans une forme suffisamment détaillée équipera les lecteurs avec une feuille de route pour la génération et l’édition iPSC de façon reproductible.
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Disclosures
BT est un membre fondateur de rénover Biosciences Inc.
Acknowledgments
Travail en laboratoire a été pris en charge par stage postdoctoral au Dr Anjali Nandal et bonifiée exploratoire du Maryland Stem Cell Research Fund à BT (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
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