Summary
이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.
Abstract
배아와 유도 만능 줄기 세포는 자기 갱신 하 고 신체의 여러 세포 유형으로 차별화 수 있습니다. 만능 세포는 따라서 재생 의료에서 연구를 위한 탐 낼 고 현재 안과 질환, 당뇨병, 심장 질환 및 다른 질환에 대 한 임상 실험에서. 다양 한 응용 프로그램에 대 한 iPSC의 게놈을 조정 하기 위한 추가적인 기회를 제공 하는 편집 기술 CRISPR/Ca 시스템을 포함 하는 게놈의 최근 발전을 함께 하는 특수 세포 유형으로 차별화 하는 잠재력 모델링, 유전자 치료, 몇 가지 이름을 차별화의 경로 바이어 싱 하는 질병을 포함 하 여. 사용 가능한 편집 기술, 연쇄 상 구 균 pyogenes 에서 CRISPR/Cas9 진 핵 게놈의 사이트 편집에 대 한 선택의 도구로 떠오르고 있다. CRISPRs, 저렴, 쉽게 액세스할 수 있으며 대상된 편집 공학에서 매우 효율적인. Cas9 nuclease 및 가이드 시퀀스 (20-메 르)는 3 뉴클레오티드 "NGG" protospacer-인접-모티브 (PAM) 보편적인 Cas9 바인딩 추적 RNA (함께 원하는 genomic 소재 시에 Cas9을 타겟팅에 대 한 인접 게놈 대상에 특정 시스템 요구 함께 라는 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA). 여기에 우리가 현재는 단계별 급지대 및 발자국 무료 iPSC의 효율적인 생성에 대 한 프로토콜 및 게놈 iPSC Cas9 ribonucleoprotein (RNP) 단지를 사용 하 여 편집에 대 한 방법론을 설명. 프로토콜 편집 게놈 효과적 이며 Cas9 단백질 및 동시에 전달 하는 셀에 하나 이상의 대상에 대 한 사전 complexing sgRNAs에 의해 쉽게 다중화 될 수 있다. 마지막으로, 우리는 식별 및 원하는 수정 Ipsc의 특성화에 대 한 간단한 접근 방법을 설명합니다. 함께 찍은, 개요 전략 생성 및 iPSC 매니폴드 응용 프로그램의 편집을 능률적으로 예상 된다.
Introduction
요소를 프로그래밍의 overexpression에 의해 만능 상태로 인간 체세포의 재프로그래밍 질병 모델링, 재생 의료 및 약물 개발에 응용 프로그램과 함께 줄기 세포 연구를 혁명 있다. 여러 가지 비 바이러스 성 재활 방법을 프로그래밍 요소와 Ipsc, 생성의 배달을 위해 사용할 수 있지만 과정은 노동 집약 하 고 매우 효율적인1. 바이러스 성 방법 비록 효율적 바이러스 통합 및 tumorigenicity2,,34의 문제와 관련 된 있습니다. 이 원고에서 우리 제공 요소를 프로그래밍 하 고 그들의 유전자5에 어떤 바이러스 성 벡터 시퀀스의 통합 부족 발자국 무료 iPSC 라인 설정에 대 한 세포질 센다이 바이러스를 사용 하 여를 보고 합니다. 센다이 바이러스는 RNA 바이러스는 감염 후 세포 세포질 ~ 10 구절에서 희석 하 고 풍부 하 게, 신속 하 고 효율적인 프로그래밍6,7을 선도 재활 요소를 생성 합니다. 설립된 Ipsc 공급기 무료 중간 급지대 셀8로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 사용을 피하기 위해 쉽게 전환 수 다음.
프로그래밍, 센다이 바이러스 중재 한 개요 뿐만 아니라이 책에서 우리 또한 원하는 유전자 수정 연구에 대 한 무제한 인간 세포를 공급 하는 Ipsc 편집에 대 한 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 지금 노크 기능 및 녹아웃, 대규모 게놈 삭제, 유전자 검색, 유전자 공학에 대 한 심사는 풀링된 라이브러리를 포함 한 애플 리 케이 션의 광범위 한 사용 되는 Ipsc의 수정에 대 한 CRISPR/Cas9 기술 사용 수많은 모형 유기 체 및 유전자 치료9,,1011 이 기술은 포함 한다 연쇄 상 구 균 pyogenes의 단지의 형성-20-메 르 및 파생 Cas9 nuclease 가이드 RNAs 게놈 대상 시퀀스 3' 뉴클레오티드 protospacer 인접 한에 인접 한 자료 연결을 통해 대상 인식 하기 위해 모티브 (PAM) 시퀀스입니다. Cas9 nuclease 유도 이후에 주로 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 선도 삽입 또는 열려있는 독서 프레임에서 삭제 하 여 복구 하 고 그로 인하여 기능 팸 사이트에서 이중 좌초 휴식 ~ 3 뉴클레오티드 12유전자 녹아웃
인간의 췌 장 세포의 문화에 대 한 세부 정보를 포함 하는 우리의 향상 된 프로토콜, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 프로그래밍, 피더 무료 문화 이후 적응의 높은 효율을 달성 하기 위해 비활성화 mitotically에 그들의 프로그래밍 Matrigel, 설립된 Ipsc의 특성에 CRISPR 가이드 RNA 설계 및 준비, RNP 단지, 단일 셀 정렬 편집된 Ipsc의 클론 라인 생성 하, 쉽게 심사 및 편집, 식별 및 특성으로 Ipsc에 배달 단일 셀 복제합니다. 게놈 삭제 했다 Cas9 단백질 및 두 배 좌초 틈 (DSBs) 유도 하 두 CRISPR sgRNA RNP 복합물의 도입으로 효율적으로이 연구에서 생성 되 고 삭제는 개입의 세그먼트. 이 메서드는 열려있는 독서 프레임에서 삭제를 생성 하기 위한 두 명의 가이드를 사용 하 여에 대문자로 바꿉니다, 그리고 고효율의 낮은 수 선도 NHEJ의 클론 자동된 모 세관에 의해 그 특성화 될 필요가 그리고 클론의 쉬운 예비 심사 전기 이동 법 단위, 조각 분석기입니다. 이러한 효과적인 게놈 인간 줄기 세포 기반 질병 모델을 생성 하는 방법을 편집 곧 모든 줄기 세포 실험실에서 표준 및 일상적인 접근을 될 것입니다. 마지막으로, 정확한 게놈 편집 그것은 줄기 세포 질병 모델링 넘어가 수 만들고 잠재적으로 촉매 세포 기반 치료를 도울 수 있습니다.
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Protocol
1. 프로그래밍 프로토콜
- 기본 인간의 췌 장 세포에서 인간 iPSC의 세대
- 6-잘 1.5 mg/mL 차가운 콜라겐 접시 하 고 1 h. 위해 37 ° C에서 젤 코트
- 접시 인간의 기본 췌 장 세포는 콜라겐에 Prigrow III 매체 (~ 1-1.5 × 10 5 셀)에 코팅 6 잘 플레이트에 하루 약 2.5 × 10 5 셀 또는 적어도 60%를 달성 하기 위해-2 초기 통로의 날에 잘 당 confluency 변환 (0 일)입니다. 첫 번째 연구를 위해 0에 원하는 confluency 하나 잘 얻을 적어도 2-3 웰 스 접시. 셀 하나 이상 잘 컨트롤 사용.
- 변환 (0 일)의 날, 따뜻한 불리고 수를 각 잘 물 욕조에 Prigrow III 매체의 1 mL. 수확 10 %FBS 매체 1 mL의 트립 신/EDTA를 사용 하 여 5 분의 1 mL에 한 컨트롤에서 셀 또는 셀 셀 수 수행을 분리 하는. 10 %FBS 매체, 추가 DMEM, 10 %FBS, 1 %L-글루타민, 1% 나트륨 Pyruvate와 1% 비 본질적인 아미노산.
- 수 셀 카운터를 사용 하 여 세포의 생존 능력을 확인 하 고 계산 셀 번호 및 바이러스 titer에 따라 목표에 도달 하는 데 필요한 각 바이러스의 볼륨. KOS의 감염 (MOI)의 다양성을 사용 하 여 = 5, hc-Myc = 5, hKlf4 = 췌 장 세포에 대 한 3.
- 센다이의 해 동 한 세트 얼음-80 ° C 저장에서 튜브를 벡터와 신중 하 게 Prigrow III 매체의 1 mL를 각각 3 센다이 벡터 튜브의 계산 된 볼륨을 추가 37 미리 예 열 ° C. 피 펫 혼합 솔루션을 부드럽게. 6 잘 플레이트 한 잘 재설정된 세포 생성에 센다이 바이러스 성 벡터와 시험에 대 한 충분 하다.
- 셀에서 Prigrow III 중간 발음 하 고 천천히 셀을 포함 하는 우물을 재활 바이러스 혼합물을 추가 합니다. 5% CO 2의 습도 분위기 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어.
- 신중 하 게 세포에 바이러스 혼합물을 삭제 하 고 날, 변환 후 24 시간 신선한 Prigrow III 매체를 바꿉니다. 셀 d 5에 대 한 문화와 매체 대체 매일 변경.
- 5 일에 0.1% 젤라틴 미리 코팅 10 cm 문화 요리 (1.3 x 10 6 셀/접시)에 MEFs을 준비. 하루 4까지 플라스 크 T175에서에서 MEFs를 성장 하 고 다음 날 5, 셀 13 또는 사용 상업 MEF 소스 뿌리기 전에 γ 방사선 소스에서 6000 래 드 셀 노출.
- 6 일에를 사용 하 여 세포 분리 솔루션의 1 mL 10 분 transduced 세포를 분리, Prigrow III 매체에서 MEF 요리에 그들의 모든 바위 억제제 (5 m m 재고, 최종 10 µ M) 접시 습도 atmosphe와 37 ° C 배양 기에서 밤새 품 어 다시 5% CO 2.
- 는 HESC 매체 다음날 Prigrow III 매체를 변경합니다. HESC 매체의 500 mL를 만들기 위한 추가 DMEM/F-12, 20% (v/v) 녹아웃 혈 청 교체 (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 m m l-글루타민; 100 µ M 불필요 한 아미노산 그리고 100 µ M 2-mercaptoethanol. 지금 매일 부드럽게 매체 변경.
- 재설정된 셀을 나타내는 세포 덩어리 또는 식민지의 출현에 대 한 정기적으로 번호판을 관찰합니다. 변환 된 셀 조약돌 형태학 및 큰 핵 nucleoli 클론 집계를 형성합니다. 표시는 가능한 ' iPSC ' 식민지 성장을 위해 그들을 정기적으로 확인 하 고.
- 변환 후에 거의 4 주 식민지 따기 또는 전송에 대 한 준비가 단일 식민지의 전송에 대 한 이전과 1.3 x 10 6 셀/젤라틴 미리 코팅된 접시를 도금 하 여 24-잘 MEF 접시 준비.
- 분석 증명서에 희석 비율에 따라 aliquoting에 의해 (예를 들어, Matrigel) 준비 매트릭스 막
- . 4 6 잘 플레이트 (1 mL/음) 하 고 사용 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 실 온 (RT)에서 품 어 코트 DMEM/F-12의 25 mL에 한 약 수를 추가 합니다. 수동으로 그들을 발음 하는 hESC 매체의 500 µ L에서 MEF 접시에 전송 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 12-24 식민지를 선택 하십시오.
- 발음에 부드럽게 방해 또는 식민지를 분리 잘 미디어. 또한 매트릭스 코팅 막 24-잘 접시에 24-48 식민지를 선택 하십시오. 막 코팅 판에 대 한 24 시간에 대 한 mTeSR1 (10 µ M 바위 억제제 보충)를 사용 하 고 매일 변경. 식민지를 따기의 6-10 d, 내 클론 확장에 대 한 새로운 24-잘 / 12 잘 막 격판덮개 전송 준비가 되.
- 필요한 경우, MEFs 1mg/mL 콜라를 사용 하 여 20 분 동안에 식민지를 분리, 세척 두 번 hESC/mTeSR1와 막에 코팅 12 또는 24 잘 접시. 성장 단계의 1.1.12 매트릭스 막에 충분 한 강력한 식민지 경우 동결 iPSC 냉동 제조 업체에 따라 미디어를 사용 하 여 MEFs에 식민지 ' s 지침.
- 단계 1.1.12 20 분에 대 한 dispase의 500 µ L를 사용 하 여에서 막에 도금 강력한 식민지를 분리 하 고 접시 다시 매트릭스 막에 코팅 된 12-잘 접시. 수동으로 어떤 차별화 된 셀 이나 만능 클론 멤브레인에 대 한 풍부 하 게 오염 MEF 급지대 셀 다쳤어요.
- 는 멤브레인에 성장 하 여 6-8 d dispase 솔루션으로 앞으로 해리 하 여 플레이트를 코팅 하 고 6 또는 12 잘 플레이트 코팅 도금 신선한 막에서 작은 셀 집계 후 클론을 확장 합니다. 변경 mTeSR1 매체 매일입니다. 얼룩, pluripotency 마커 (OCT3/4 및 분석용 NANOG), FACS 만능 표면 마커 및 차별화 분석 실험의 immunostaining 알칼리 성 인산 가수분해 효소에 의해 재설정된 클론을 특징. 성장 하 고 CRISPR 다른 코팅 솔루션은 구체적으로 언급 하지 않는 한 위에서 설명 편집을 비롯 한 모든 분석에 대 한 막 코팅 판에 클론 문화.
- 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩
참고: 상업 키트는 여기에 사용 됩니다. 자료 테이블을 참조 하십시오.- 매일 미디어 변경 24-잘 접시에 4-5 d 문화 상 상속 인간의 Ipsc 접시.
- 얼룩 프로토콜을 시작, 문화 매체를 발음 0.05 %1 x PBS의 1 mL로 세포 세척을 트윈 20 (PBST).
- 키트 셀에 수정 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 고 2 ~ 5 분 Aspirate 수정 솔루션에 대 한 RT에서 품 어 다음 PBST와 고정된 셀을 씻어. 건조 우물을 허용 하지 않습니다.
- 솔루션 A, B 및 C. 품은 어둠 속에서 (호 일 또는 어두운 컨테이너에 포장) 5 ~ 15 분에 대 한 실 온에서 전지를 혼합 하 여 잘 당 갓된 AP 기판 솔루션의 0.5 mL을 추가
참고: 밀접 하 게 모니터 색상 변경 하 고 색상 일반적인 얼룩 피하기 위해 밝은 때 반응을 중지. - AP 기판 솔루션 발음 및 1 x PBS의 2 mL로 두 번 우물을 세척 하 여 반응을 중지.
- 현미경 식민지를 관찰 하 고 4 배 또는 10 배 확대 어떤 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 카메라에서 이미지를 캡처.
- Immunostaining
- 매일 미디어 변경 24-잘 접시에 4-5 d 문화 인간의 Ipsc 접시.
- PBS와 PBS에서 4 %paraformaldehyde (PFA)와 20 분에 대 한 수정에 짧게 한 번 셀 세척.
- 실시간에 PBS 가진 10 분 (3 x, 10 분)에 대 한 세 번 세척
- Saturate 일반적인 사이트 10% 일반 염소 또는 당나귀 혈 청 (NS, 동물 이차 항 체에 따라 발생에) PBS에서 실시간에서 40 분 세포내 epitopes만 포함 0.3 %PBS (TX/PBS) permeabilize 하에서 TX-100.
- 워시 실시간에 PBS 가진 3 x 5 분
- 5%의 신선한 솔루션에서 OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5와 SOX17 항 체 희석 PBS에서 NS 및 2 시간 또는 하룻밤 4 RT에서 품 어 ° c.
- 실시간에 PBS 가진 5 분 동안 배를 씻어
- 적절 한 보조 알 렉 사 Fluor 488 또는 5%에 568 항 체 희석 NS/PBS 및 실시간에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어
- 실시간에서 5 분 동안 배를 씻어
- 1 PBS에 DAPI 함께 품 어0 분 및 세척 2 x 사진을 찍어 실시간 사용 형광 현미경에서 5 분.
- 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)
- 식민지까지 문화와 6 잘 플레이트에 플레이트 인간의 Ipsc 될 80% 합칠 (적어도 10 5 셀 /sample) 매일 mTeSR1 중간 변화.
- 실험 당일, 세포를 분리 하 고 프로토콜에 위에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액에 해리. 10 %FBS 매체와 세척.
- 0.5-1에서 resuspend 표면 표식에 대 한 10 %FBS 매체 및 계속 얼음의 mL
- 세포내 표식에 대 한 4%의 1 mL에 resuspend PFA/PBS 및 실 온에서 10 분 동안 품 어. 10 %FBS 매체와 세척. 0.1%에서 resuspend TX/PBS와 얼음에 15 분 동안 품 어. 10 %FBS 매체와 다시 세척. 0.5-1에서 resuspend 10 %FBS 매체 및 계속 얼음의 mL
- 10 %FBS 중간 포함의 50 µ L에 세포 현 탁 액의 추가 50 µ L TRA-1-60, TRA-1-81 또는 SSEA-4 항 체의 양을 권장 하 고 30 분 1 헤 알을 품고합니다
- 10%로 두 번 씻어 FBS.
- Resuspend 10%의 100 µ L에서 FBS 매체 형광 이차 항 체를 포함 하 고 10 %FBS 적절 한 양의 10%에 resuspend로 두 번 30 분 세척에 대 한 품 어 FBS. 라이브 셀 propidium 요오드 화물 염료에 추가 하 여 죽은 세포에서 분화 될 수 있다 < 세포 apoptosis 과정 추정 1 µ g/mL.
- 트라이-혈통 차별화
- 10 6 Ipsc/10 µ M 바위 억제제와 mTeSR1 매체에 잘 x 1.5-2 2 6 잘 플레이트 씨앗.
- 성장 mTeSR1 중간 변화 매일 2-3 d 우물은 80-90%까지 confluent 세포 허용.
- Ectoderm 유도 신경 유도 매체 (님)는 제조업체에 따라 추가 ' 6 잘 플레이트의 2-3 스에서 s 지시.
- RPMI 인슐린 마이너스 2 %B27 보충 및 12 µ M를 포함 하는 매체 변경 접시 14의 2-3 스에서 mesoderm 유도 대 한 CHIR99021. 다음 24 h. 추가 5 µ M에 대 한 인슐린 마이너스 2 %B27 보충을 포함 하는 추가 유일한 RPMI RPMI 보통 2 %B27 IWP4 다음 24 h에 대 한 인슐린을 뺀 보충. 72 h 후 바꿉니다 미디어 2-3 디 cardiomyocytes 박동의 생성으로 이어지는 2 %B27 보충 포함 된 RPMI
- Endoderm 유도 MCDB 131 1.5 g/L 나트륨 중 탄산염, Glutamax, 포도 당 10 m m, 0.5 %BSA, 100 ng/mL GDF8, 및 24 h. CHIR99021 없이 동일한 매체에 문화에 대 한 CHIR99021의 5µM x 1와 보완에 6 잘 플레이트의 우물에서 매체 변경 2-3 d 15.
- 모든 3 개의 계보에 대 한 2 단계에서 immunostaining 프로토콜을 수행 하 고 관련 마커의 식 확인.
2. 게놈 인간의 편집 iPSC 사용 하 여 CRISPR Cas9
- 준비의 Cas9 단백질 및 sgRNA
- 메 마른 조건에서 microcentrifuge 튜브 Aliquot Cas9 단백질-80에서 튜브를 고정으로 aliquots를 저장 하 고 ° c.
- 는 유전자 당 RNAs MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/)에서 소프트웨어 또는 다른 CRISPR 가이드 디자인 webtool 기반 가이드를 대상으로 두 개의 디자인. 녹아웃을 생성 하는 유전자 (열려있는 독서 프레임 기준)의 첫 번째 또는 두 번째 엑손 대상. 두 그렇게 그들은 가깝게 잘라 가이드 선택 (30 ~ 100 bp 간격) 우리가 쉽게 뇌관을 심사의 동일한 세트를 사용 하 여 삭제를 시각화 수 있습니다. 더 높은 품질 평가 점수 및 오프 대상 사이트의 낮은 수를 기반으로 소프트웨어 출력에서 가이드를 선택 하십시오. 상영 프로그램 뇌관 폭발 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용 하 여 뇌관 디자인. 100 이상 이어야 한다 뇌관 심사는 Cas9에서 bp 사이트 잘라내어 PCR 제품 크기 PCR에 의해 쉽게 확대를 위한 400-700 bp 사이 여야 선호.
- 디자인 두 개의 상호 보완적인 sgRNA 올리고 사이트 양쪽 끝을 잘라 Bsa1로 DNAs (19-22 뉴클레오티드 길이에 따라 가이드 시퀀스). 올리고 DNAs 상업적으로 합성 및 이중 가닥 DNA를 단련 될 수 있습니다. 어 닐 링, 추가 1 µ L 각 100 µ M 가이드, 버퍼 (10 mM Tris, pH7.5 ~ 8.0, 50 m m NaCl, 1 mM EDTA) 어 닐 링의 25 µ L 및 물 23 µ L. Thermocycler 2 분 및 그 후에 점차적으로 25 ° C 이상 45 분을 냉각에 대 한 95 ° C에서 시작 하는 프로그램에서 품 어
- 클론 Bsa1 제한 효소로 결과 조각의 2 µ L는 T4 DNA 리가 제조자에 의하여를 사용 하 여 Cas9 바인딩 사이트와 사내 T7 발기인 pCR2.1 벡터의 1 µ L를 소화 ' s 프로토콜.
- 복제 된 DNA 파편을 연속 하 고 생체 외에서 T7 키트를 사용 하 여 단일 가이드 RNAs를 생성 하는 클론을 녹음 충실도 설정. 상업적인 키트 sgRNAs를 정화 하 고 RNase 무료 물에 elute. RNA 농도 확인 하십시오.
- Transfection hiPSCs의
- 셀 40-50% 합칠 때까지 위에서 설명한 대로 hiPSCs mTeSR1 매체에 문화.
- 2 시간 nucleofection, 전에 10 µ M 바위 억제제를 포함 하는 prewarmed mTeSR1 매체의 2 mL 매체 바꿉니다.
- 1 시간 후, 준비 대상 웰 스 nucleofected 셀 발음 막, 위, 12-잘 접시에서 준비 하 고 10 µ M 바위 억제제와 mTeSR1 매체의 prewarmed 1 mL을 바꿉니다. 부 화에 대 한 37 ° C에서 유지.
- 준비 nucleofection 마스터 믹스 (샘플에 따라 적절 하 게 스케일) P3 1 차 셀의 16.4 µ L 추가 하 여 각 샘플에 대 한 보충, 보충 1 nucleofector 키트, Cas9 단백질의 0.5 µ g의 3.6 µ L 및 각 sgRNA의 0.5 µ g 반응 양 당 22 µ L에서. pMAX GFP 벡터는 또한 제조자에 의하여 nucleofected ' 대략 iPSC transfection 효율 추정 하 셀에 s 권고.
- 씻어 각 iPSC 우물에서 바위 억제제를 포함 하는 매체를 발음 후 RT PBS의 2 mL와 잘. 다음 발음 PBS, 세포 분리 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어
- 는 MTeSR1 매체의 3 mL에 셀 resuspend 그리고 부드럽게 위아래로 단일 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 플라스틱. 15 mL 원심 분리기를 전송 해리 셀 튜브 포함 5 mL mTeSR1 매체.
- 셀 셀 카운터 하 고 총 볼륨 0.5 x 10 6 셀/transfection에 필요한 계산. 원하는 양의 셀에 15 mL 원심 분리기 튜브, RT에 5 분 동안 200 x g에서 원심 하 고 상쾌한 발음.
- X 10 6 세포 transfection 마스터 믹스 4 단계에서 준비의 22 µ L에서 0.5의 각 단위를 resuspend. 신속 하 게 nucleocuvette 스트립의 한의 중앙 챔버로 셀을 전송. 프로그램 CB150를 사용 하 여 nucleofector 장치 및 nucleofect 세포로 스트립을 놓습니다.
- Nucleofection, 후 신속 하 게 nucleofected 셀의 각 음에 10 µ M 바위 억제제를 포함 하는 prewarmed mTESR1 매체의 80 µ L을 추가. 부드럽게 위아래로 pipetting 혼합.
- 부드럽게 웰 스 판의 막 미리 코팅 12-잘 록 제 3 단계에서 준비 된 mTeSR1 매체를 포함 하는 스트립에서 셀 전송.
- 후 1 d 록 억제제 없이 신선한 mTeSR1 매체를 변경 합니다. 수확 nucleofection 단일 셀 정렬 후 2-3 d 세포.
- 타겟된 hiPSCs의 단일 셀 격리
- 정렬, 전에 1 일 시드 2 x 10 6 셀/젤라틴 코팅 접시 10 %FBS 매체에 의해 96 잘 MEF 접시를 준비. 클론의 약 70-80 %nucleofection 후 생존과 2-3 MEF 접시 각 편집 실험을 위해 준비 될 수 있다.
- 100 보충 hESC 매체 (앞에서 설명한) 매체 변경 다음 하룻밤 인큐베이션 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (억제제 단일 세포 생존 능력을 향상 시키기 위해 미디어에 추가), 그리고 접착 홍보 5 mg/mL fibronectin.
- MTeSR1 매체 1 보충을 mTeSR1에서 12-잘 접시에 hiPSCs에 매체를 대체할 단일 셀 정렬 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 x SMC4.
- 는 HiPSCs에서 매체를 발음 하 고 부드럽게 PBS로 세포를 씻어. 각 잘에서 세포 분리 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 PBS 발음 후 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 단일 세포 현 탁 액을 각 영역 (unsupplemented) mTeSR1의 1 mL을 추가 하 고 pipetting 아래로 부드럽게 여러 번 여 생성.
- 세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 실시간 Aspirate 상쾌한에 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기에 고 resuspend mTeSR1의 1 mL에 셀.
- 1 단계에서 준비 된 96 잘 접시의 한 셀에 개별 잘 살 균 조건 하에서 100 m m 노즐 셀 정렬을 사용 하 여 단일 셀에 셀 정렬.
- 정렬 후 4 일 1 보충 하는 hESC 매체와 문화 매체를 대체이 시점에서 식민지 형성 명백한; 해야 x SMC4.
- 정렬 후 8 일 hESC 매체와 2에 대 한 문화 매체를 대체 디
- 1 mg/mL 콜라를 사용 하 여 20 분에 대 한 식민지를 분리 하 고 록 억제제와 mTeSR1에서 24-잘 막 코팅 접시에 그들을 전송. 단일 셀 클론 성장 하 고 복제 또는 그들을 확장 후 그들의 게놈 DNA를 추출 하자. 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 대상 DNA PCR에 의해 증폭.
- 사용 조각 분석기 키트 젤/염료를 통해 그들을 실행 하 여 모든 클론의 PCR 증폭된 대상 게놈 지역의 초기 심사에 대 한 제조 업체에 따라 믹스 ' s 지시. 예제와 함께 실행 되는 적절 한 사다리 그것을 비교 하 여 소프트웨어 PROSize에서에서 결과 조각 크기를 예상 하고있다. 예상 순서 ' 편집 ' 복제 및 시퀀싱 데이터를 확인 하는 편집 또는 삭제 분석.
- Monoallelic 및 biallelic 클론 차별화에 대 한 증폭 PCR와 pJET1.2 벡터에 복제 편집된 시퀀스. 시퀀싱에 대 한 적어도 8-10 클론 보내고 하나 또는 둘 다 대립 유전자에서 편집 확인 순서를 확인 하십시오.
- 성공적으로 타겟된 iPSC 클론 유전형을 통해 확인 되었습니다, 일단 검사는 그들이 하지 pluripotency 손실 또는 염색체 이상이 과정을 통해 얻은 것인지.
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Representative Results
이 책에서 우리 통합 또는 발자국 무료 센다이 바이러스 벡터를 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서 iPSC의 세대에 대 한 간단 하지만 효율적인 프로토콜을 따라 했습니다. 그림 1A 이 재활 프로토콜의 도식 적인 표현을 보여준다. Prigrow III 매체에 경작 하 고 센다이 바이러스 위에서 설명한 대로 불리고 인간의 췌 장 세포가 상업적으로, 구매 되었다. 췌 장 세포를 형성 하는 불리고 스핀 0, 당일 센다이 바이러스 변환 후 ~ 5 일에 대 한 모든 형태학 상 변화를 보여주지 않았다 하지만 다음 더 큰 핵과 nucleoli 반올림 될. 일부 초기 식민지 주 후 변환 후 보였다 하지만 그들은 했다 하지, 우리의 경험, 이러한 식민지 신속 하 게 분열 하 고는 일반적으로 '초기 부분적으로 재설정된 셀'을 강력한 식민지를 설정 하지 않습니다. 약 10-15 일 후 변환, 작은 밝은 식민지 관찰 했다 고 성장 (그림 1B, 오른쪽 상단) 후 선택 했다. 인간의 iPSC 식민지는 소형, 단단히 분명 가장자리 ('완전히 재설정된 셀'로 간주)와 함께 포장 (그림 1B, 하루 23 하단 중간)과 '부분적으로 재설정된 셀'은 식민지 (그림 1B, 간격으로 느슨한 하루 23 하단 오른쪽)입니다. 재설정된 췌 장 세포 식민지 하루 18 (그림 1B왼쪽 아래)에 성장 했다 고 하루 23 (그림 1B, 하단 중간) 수동으로 뽑 충분히 큰 했다. 식민지는 하루 30-40 (왼쪽그림 2A, )에 의해 iPSC 공급기 무료를 따기 후 막 코팅 판에 도금 했다. 이러한 '강력한' 피더 없는 식민지의 일부 확장 되었고 알칼리 성 인산 가수분해 효소, pluripotency 및 급지대 무료 조건에서 표면 마커의 표현에 대 한 특징. 테스트 모든 클론 그들은 분석 결과 (그림 2A, 오른쪽) 후 밝은 빨간색으로 알칼리 성 인산 가수분해 효소에 대 한 긍정적인 했다. Pluripotency 마커 OCT4, NANOG, SSEA4, TRA-1-60과 TRA-1-81 매우 표현 될 모든 클론에서 immunostaining 또는 FACS 분석 (그림 2B 와 그림 3A)를도 관찰 되었다.
이 결과 췌 장 세포에서 생성 된 인간의 iPSC 식민지 pluripotency 마커 급지대 무료 조건에서 표현 하는 방법을 보여 줍니다. Pluripotency는 또한 3 개의 세균 층을 인간의 iPSC의 감독된 차별화 하 여 평가 되었다: ectoderm, mesoderm endoderm. 멤브레인에 클론 potently TUJ1 양성 신경 (ectoderm) NKX2-5-긍정적인 박동 cardiomyocytes (mesoderm), SOX17-긍정적인 endodermal 세포 (그림 3B) 분화.
철저 한 특성, 후 3 강력한, 피더 무료 iPSC 클론 라인 게놈 연구 편집에 대 한 선정 됐다. BsaI 끝에 컷된 사이트 가깝게 잘라 각 유전자에 대 한 설계 되었습니다 두 가이드 (즉, n ~ 100 bp). 프로토콜의 회로도 그림 4에 표시 됩니다. 이 삭제 전략 사용 허용 대상 유전자 쉽게 유전자의 첫 번째 또는 두 번째 엑손의 일부를 삭제. 이 전략은 매우 효율적 이었다 그리고 우리는 모든 시도에 편집된 클론 분리 수 있습니다. 가이드는 소화 BsaI 벡터와 체 외에서 위에서 설명한 대로 복사할 복제 했다. 우리 nucleofected 가이드 (RNAs)와 Cas9 단백질 RNP 단지 신속 하 고 효과적인 편집으로. 우리는 또한 복구 세포의 세포 막 코팅 접시에 단독으로 정렬에 비해 더 높은으로 MEFs 단일 셀으로 셀 정렬. 게놈 DNA 모든 클론 으로부터 격리, 대상 부분 PCR에 의해 증폭 되었고 조각 분석기 컨트롤 비교 대상 파편의 크기에 변화에 대 한 화면에서 해결. 조각 크기 '편집된' 클론 (하단그림 4, )를 감지 하는 샘플을 실행 하는 사다리와 비교 되었다. 이 만든 클론의 쉬운 우리를 통해 갈 수 > 한 접시에 결과 90 클론 ± 3 혈압의 정확도와 가져온. 선택 된 클론 다음 야생 형 및 돌연변이 클론 것인지 시퀀싱 했다. 변이 된 클론은 wildtype에 비교 하 여 시퀀스에 추가 또는 삭제 했다 Wildtype 클론 삭제 또는 기지의 추가 했다. 시퀀싱에서 삭제 또는 추가 보여주는 클론 복제 당 적어도 8-10 식민지의 연속 monoallelic 및 biallelic 클론을 식별 하기 위해 확장 하 고 복제에 pJET1.2 벡터 했다. Monoallelic 클론 기지 삭제 또는 1 개의 대립 유전자에 추가 했으며 다른 변형 되었고 wildtype 대립 유전자와 비슷합니다. Biallelic 클론 두 대립 유전자에서 삭제 했다. 약 3 백 클론 약 9 monoallelic 삭제 클론 및 3 biallelic 삭제 각 경우에서를 확인 하는 모든 대상 유전자에 대 한 상영 했다. 이 약 monoallelic 클론에 비해 biallelic 클론의 발생의 주파수에 3 감소에 해당 합니다. 삭제 amplicons 내이 불완전 하 고 일관성이 NHEJ 수리 반영. 유전자의 표정은 마침내 확인 대상 세포에서 RNA를 추출 하 여 RT-PCR을 수행 하 여.
그림 1: 피더 무료 만능 세포 (iPSC) 인간의 췌 장 세포의 재프로그래밍. IPSC 인간의 췌 장 세포에서의 세대에 대 한 (A) A 도식 프로토콜 표시 됩니다. 췌 장 세포 콜라겐 코팅 접시에 성장 하 고 인간의 센다이 바이러스 벡터와 변환 후 MEFs를 전송 했다. 완전히 재설정 식민지 hESC 자격 막 전송 그리고 특징 했다. (B) Morphological 센다이 바이러스 변환 후 변경합니다. 변환 하기 전에 췌 장 세포는 전형적인 스핀 들 모양의 형태 (맨 왼쪽, 0)를 표시 합니다. 작은, 꽉 식민지 하루 12, 닮은 인간 만능 세포 식민지에 의해 MEFs에 나타납니다. 일반적으로 완전히 재설정된 인간의 iPSC 식민지 매우 명확한 경계 있고 하루 23-30에 의해 선택 될 수 있습니다. 하루 23에 해리 식민지 오른쪽 하단에 표시 됩니다. 모든 이미지는 100 배 확대 (10 X 목표 및 10 X 접 안 렌즈)에 점령 되었다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 인간의 iPSC의. 급지대 무료 조건에서 문화와 따기 후 iPSC 식민지의 (A) A 전형적인 단계 대조 이미지 (40 X 4 X 목표 및 10 X 접 안 렌즈, 왼쪽) 센다이 바이러스 췌 장 세포의 프로그래밍 후. 빨간 iPSC 식민지 스테인드 알칼리 성 인산 가수분해 효소는 오른쪽에 있습니다. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 iPSC 식민지 고정 및 키트에서 기판 솔루션의 추가 후 레드 스테인드. 이미지는 40 X에 점령 했다. (B) Immunostaining pluripotency 마커 NANOG에 대 한 그리고 급지대 무료 인간의 췌 장 세포 유래 Ipsc OCT3/4. DAPI 핵 컨트롤로 블루 얼룩에 사용 되었다. 모든 이미지 100 배 확대에서 찍은 사진. 눈금 막대에 모든 이미지 100 µ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: pluripotency와 차별화의 iPSC의 잠재적인. (A) FACS Ipsc 공급기 무료에 표면 마커 SSEA4, TRA-1-60과 TRA-1-81의 분석. 셀 단일 세포 현 탁 액에 해리 그리고 표면 마커 SSEA-4, TRA-1-60과 TRA-1-81에 대 한 스테인드. 보라색 피크 iPSC 네거티브 (항 체 제어) 세포를 포함 하 고 췌 장 iPSC 녹색 피크로 visualised 수 있습니다. (B) 세균 레이어 마커 유전자의 Immunofluorescent 이미지입니다. 췌 장 iPSC의 감독된 차별화 후 마커 TUJ1 ectoderm (녹색), NKX2-5 mesoderm (빨간색)와 셀에 SOX17 endoderm (빨간색)의 식입니다. 해당 제어 핵 얼룩 DAPI 파란색입니다. 모든 이미지 100 배 확대에서 찍은 사진. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: CRISPR/Cas9 삭제 전략의 도식. 1 개 sgRNA 쌍은 설계 (표시 된 빨간색) 컷된 사이트는 끝에 (F와 R로 표시) 선호 단련 첫 번째 엑손을 대상으로 하는 BsaI와 BsaI 소화 수정된 벡터 (pCR2.1, BsaI 사이트 강조 회색), 시퀀스에서 복제 하 고 생체 외에서 번역. 벡터의 밑줄이 그어진된 순서 BsaI 소화 후 삭제 부분을 보여줍니다. 뇌관을 심사의 위치는 파란색으로 표시 됩니다. Cas9 가이드 RNAs iPSC 공급기 무료에 게놈 삭제에 대 한 복잡 한 nucleofected 했다. Ipsc 그리고 교양, 96-잘 MEF 플레이트에 정렬 된 단일 셀 막에 전송, 확장 조각 분석기로 상영 했다. 분석기에서 샘플을 실행 하기 위한 멤브레인에 Cas9의 게놈 DNAs 및 가이드 페 추출 되었고 잠재적인 '편집된' 클론 (아래 중간)에 대 한 선택 하려면 분석기에서 젤/염료 혼합을 통해 전달. 관련 사다리 마커, WT 및 잠재적인 편집된 클론 표시 됩니다. 유전자의 표현 RNA를 추출 하 고 Q PCR와 분석에 의해 확인 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Ipsc 인간의 체세포의 재프로그래밍 기본적인 생물학 연구, 맞춤된 의학, 질병, 약물 개발 모델링과 재생 의학16의 분야에 큰 향상을 제공 하고있다. 호스트 게놈으로 통합의 위험 바이러스의 사용을 필요로 하는 인간의 iPSC 세대의 많은 현재 및 널리 사용 되는 방법 또는 episomal 벡터와 낮은 효율을 프로그래밍. 여기, 우리는 Ipsc 공급기 무료 센다이 바이러스, ' 무료 '와 효율적인 프로그래밍 리드와 인간의 췌 장 세포에서 생성 하는 효율적인 방법 제시. 결과 인간의 Ipsc는 무료로 바이러스 transgenes, pluripotency를 유지 하 고 알 수 없는 외 인 요인의 사용을 방지. 그래서 우리는 피더 세포에 기본 췌 장 세포를 재설정 다음 식민지 확장, 문화 및 특성에 대 한 막 급지대 무료 이동 Ipsc 공급기 무료 조건에서의 세대 낮은 재활 효율이 있다. 이러한 기술의 융합 신뢰할 수 있는 안정적이 고 보다 효율적인 iPSC 프로그래밍을 제공합니다.
우리 또한 제안의 센다이 바이러스 세포의 광범위 한 프로그램을 사용할 수 있습니다이 방법으로 인간의 섬유 아 세포 및 다른 1 차 셀에서 Ipsc를 생성. 중요 한 고려 사항: 1 차 셀의 최적의 confluency에 대 한 필요 프로그래밍 효율; 너무 적은 또는 너무 많은 세포 영향으로 재설정 1 차 셀 셀은 여전히 최적 분리; 하는 경우의 이전 통로 바이러스의 주의 적정 벡터 최소 세포 apoptosis에 그 결과 고효율의 강력한 식민지; 쉽게 픽업을 선도 센다이 벡터 transgene 식은 Ipsc '자유 공간'; 되도록 10-15 구절에서 PCR에 의해 손실을 확인 그리고, 막에 iPSC의 문화에 대 한 엄격한 무 균 조건.
우리는 편리 하 고 효율적인 CRISPR 게놈 수정 방법 편집를 사용 iPSC 게놈. 이 기술은 Cas9 단백질 및 sgRNA, 인식 하 고 보완 DNA 시퀀스를 쪼개 다 RNP 복합물 결합 합니다. 그것은 쉽게 단순히 변경 20 bp 가이드 RNA 게놈 시퀀스를 대상에 적용할 수 있습니다. 우리의 방법은 효율적 및 재현성은 transduce, 하기 어려운, 더 많은 인간의 Ipsc의 편집 하 고 다른 세포 보다 유지 보수 비용이 쉬운 프로토콜을 제공 합니다. 우리 디자인 각 대상 유전자에 대 한 두 개 이상의 인접 한 하지만 겹치지 가이드 그래서 뇌관을 심사의 단일 집합 편집된 클론을 선별 사용할 수 있습니다. 또한, 두 명의 가이드 ~ 30-100 bp 간격의 사용 큰 삭제는 예비 심사 하는 동안 쉽게 구상 될 수 있다 고 단백질의 고갈 생성 합니다. 가이드는 iPSC의 분석 결과 시작 하기 전에 효율성 추정에 처음 HEK 293 세포에서 테스트할 수 있습니다. 또한, 그것은 iPSC로 시 약의 일상적인 transfection에 대 한 매개 변수를 설정 하는 중요 한입니다. PMAXGFP 플라스 미드, transfection 효율의를 사용 하 여 > 80%와 Ipsc에서 3-10%의 유전자를 대상 으로/중단 효율성 정기적으로 달성 된다. 우리의 프로토콜에 셀으로 Cas9 RNP 단지의 직접 배달 빠른 행동과 빠른 회전율을 제공 하 고 대상된 수정의 높은 속도 유지. 우리의 접근 방식을 고용 단일 셀 가이드 및 Cas9 단백질의 nucleofection 다음 정렬, iPSC 인구 혼합 유전자에 표적으로 하기의 중요 한 장애물을 극복 하 고 셀의 clonality. 이 '소설' 전반적인 접근, 다중화 하기 쉬운, 몇 주 소요 이며 어떤 항생제 선택 필요 하지 않습니다. 우리 않았다 관찰 하지 손실 효율에서 셀 라인 또는 Ipsc, CRISPRs에 의해 삭제를 순차적으로 도입 하 여 비록 karyotype 게놈 안정성을 보장 하기 위해 같은 경우에 수행 해야 분석. 클론은 pluripotency 마커의 표현에 대 한도 확인 한다. 하지만, 안이 게시,이 프로토콜의 초점 공동 transfection 칵테일17,18에 복구 서식 파일을 포함 하 여 정확한 유전 수정 유도를 선택한 수 있습니다.
마지막으로,는 우리의 경험을 바탕으로, iPSC 프로토콜 편집에 대 한 중요 한 고려 사항: 최소화 또는 아예 대상 돌연변이 "씨앗 지역"에 (서) 특히 나 팸 모티브 수정; 가까이 떨어져 방지 가이드의 합리적인 디자인 RNPs;의 배달 되도록 Ipsc nucleofection 효율성 최적화 준비 가이드;의 품질 확인 가이드 및 Cas9 단백질 농도 체 외 생 화 확 적인 분열에 의해 그들의 활동 분석 실험 또는 세포 HEK로 인간의 cellssuch에서이 문서에 설명 된 대로 확인의 적정은 문화를 쉽게 그리고에 transfect; 성장과 50 %confluency; 도달의 로그 단계에 이른 통행 Ipsc의 사용 부드러운 매체와 셀의 주의 깊은 처리 단일 셀 정렬 셀의 생존을 위해 다음과 같은 변경 합니다.
우리는 적절 한 정보에 지정 하려면 위의 설명된 프로토콜은 생성 및 편집 재현 방식에서 iPSC 로드맵 함께 독자 쉬도 록 생각 합니다.
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Disclosures
BT는 쳐도 생물 과학 주식 회사의 창립 멤버
Acknowledgments
실험실에서 박사 Anjali Nandal에 박사 후 펠로 십 그랜트와 탐험 그랜트에 의해 지원 되었다 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 BT (TEDCO)에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
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