Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Effektiv generasjon og redigering av mater-gratis IPSCs fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 System

doi: 10.3791/56260 Published: November 8, 2017

Summary

Denne protokollen beskriver i detalj generering av fotavtrykk-fri indusert pluripotent stamceller (iPSCs) fra menneskelig bukspyttkjertelen celler i arkmateren uten betingelser, etterfulgt av redigering med CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins og karakterisering av endret encellede kloner.

Abstract

Embryonale og indusert pluripotent stamceller kan selv-fornye og skille ut flere celletyper i kroppen. Pluripotent cellene er dermed ettertraktet for forskning i regenerativ medisin og er nå i kliniske studier for øyesykdommer, diabetes, hjertesykdommer og andre sykdommer. Potensial til å skille ut spesialiserte celletyper kombinert med den siste utviklingen i genomet redigering teknologier inkludert CRISPR/Cas systemet har gitt av flere muligheter for skreddersøm genomet av iPSC for blandet kjøring inkludert sykdom modellering, genterapi, og biasing veier av differensiering, for å nevne noen. Blant de tilgjengelige redigering teknologiene, CRISPR/Cas9 fra Streptococcus pyogenes har dukket opp som et verktøy for valg for områdespesifikke redigering av eukaryote genomet. CRISPRs er lett tilgjengelig, billig og svært effektiv i ingeniørfag målrettet redigeringer. Systemet krever en Cas9 nuclease og en guide-sekvens (20-mer) gjelder for genomisk målet tilstøtende en 3-nukleotid "NGG" protospacer-tilstøtende-motiv (PAM) for målretting Cas9 til ønsket genomisk locus, sammen med en universell Cas9 binding tracer RNA ( "kalt sammen enkelt støttelinje RNA eller sgRNA). Her presenterer vi et trinnvist protokoll for effektiv generasjon av mater-uavhengig og fotavtrykk-fri iPSC og beskriver metoder for genomet redigering av iPSC bruker Cas9 ribonucleoprotein (RNP) komplekser. Genomet redigering protokollen er effektivt og kan være lett multiplekset av pre-complexing sgRNAs for flere mål med Cas9 protein og samtidig levere inn i cellene. Til slutt, beskriver vi en forenklet tilnærming for identifikasjon og karakterisering av iPSCs med ønskede endringer. Samlet forventes disponerte strategier å effektivisere generasjon og redigering av iPSC for mange programmer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Omprogrammering av menneskelig somatiske celler pluripotent tilstanden av overuttrykte omprogrammering faktorer har revolusjonert stamcelleforskning programmer sykdom modellering og regenerativ medisin narkotika utvikling. Flere ikke-viral reprogramming metoder er tilgjengelige for levering av reprogramming faktorer og generere iPSCs, men prosessen er arbeidskraft intensiv og ikke veldig effektivt1. Metodene viral, er men effektiv, forbundet med virus integrering og tumorigenicity2,3,4. I dette manuskriptet rapporterer vi bruk av cytoplasmatiske Sendai virus for levere omprogrammering faktorer og etablere fotavtrykk-fri iPSC linjer som mangler integrering av en viral vektor sekvenser i deres genomer5. Sendai virus er en RNA-virus som er utvannet av cellen cytoplasma ~ 10 passeringer etter smitte og produserer omprogrammering faktorer i overflod, fører til rask og effektiv omprogrammering6,7. De etablerte iPSCs kan så lett bli overført til mater-fri medium for å unngå bruk av mus embryonale fibroblaster (MEFs) som mater celler8.

I publikasjonen, i tillegg til disposisjon Sendai viruset mediert reprogramming, beskriver vi også en forbedret protokoll for redigering iPSCs, som har potensial til å levere ubegrenset menneskelige celler med genetiske endringer for forskning. Vi har brukt CRISPR/Cas9-teknologi for ombygging av iPSCs, som nå brukes for en rekke applikasjoner inkludert knock-ins og fortrenging, store genomisk slettinger, gruppert biblioteket screening for gen funnet, genteknologi av mange modell organismer og gene terapi9,10,11. Denne teknikken innebærer dannelsen av komplekser av Streptococcus pyogenes-avledet Cas9 nuclease og 20-mer guide RNAs oppnå målet anerkjennelse via base-sammenkobling genomisk målet sekvens ved 3 nucleotide protospacer tilstøtende motiv (PAM) rekkefølge. Cas9 nuclease induserer en dobbel strandet pause ~ 3 nukleotider fra webområdet PAM, som er senere reparerte hovedsakelig av ikke-homologe enden med (NHEJ) veien fører til innsettinger eller slettinger i åpent lesing rammen, og dermed funksjonelle knockout gener12.

Våre forbedret protokollen inneholder detaljene for kultur av menneskelige bukspyttkjertelen celler, deres omprogrammering på mitotically inaktivert mus embryonale fibroblaster (MEFs) for å oppnå høyere effektivitet med reprogramming, etterfølgende tilpasning til mater-fri kultur på Matrigel, karakterisering av etablerte iPSCs, guidet CRISPR RNA design og forberedelse, leveres til iPSCs som RNP komplekser, enkeltcelle sortering for å generere klonal linjer med redigerte iPSCs, enkel screening og identifikasjon av redigeringer og karakterisering av enkelt celle kloner. Genomic slettinger genereres effektivt i denne studien av innføringen av Cas9 protein og to CRISPR sgRNA RNP komplekser å indusere dobbel strandet bryter (DSBs) og sletting av de mellomliggende segment. Denne metoden kapitaliserer på bruk av to guider for å generere slettinger i åpent lesing rammen, høy effektivitet av NHEJ fører til lavt antall kloner som måtte være preget og lett foreløpige screening av kloner av av automatiserte kapillær geleelektroforese enhet, fragment analyzer. Disse effektiv genomet redigering metoder for å generere modeller for menneskelig stilk cellen-basert sykdom vil snart bli en standard og rutine tilnærming i noen stamcelleforskningen laboratorium. Endelig presis genomet redigering gjør det mulig å gå utover stamcelleforskningen sykdom modellering og potensielt kunne hjelpe katalysere cellen-basert behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. omprogrammering protokollen

  1. generasjon av menneskelig iPSC fra primære menneskelige bukspyttkjertelen celler
    1. Coat en 6-godt plate med 1.5 mg/mL kaldt kollagen og la den gel på 37 ° C i 1 h.
    2. Plate tidlig passering menneskelige primære bukspyttkjertelen celler i Prigrow III medium (~ 1-1,5 × 10 5 celler) på en kollagen belagt 6-vel plate på dag -2 å oppnå ca 2,5 × 10 5 celler eller minst 60% confluency per på dag signaltransduksjon (dag 0). For den første studien, plate minst 2-3 brønner for å få en brønn med ønsket confluency på dag 0. Bruke minst en brønn som en kontroll telle celler.
    3. Ved signaltransduksjon (dag 0), varme 1 mL av Prigrow III medium i et vannbad for hver godt å være transduced. Høste celler fra en kontroll i 1 mL av 10% FBS mediet bruker 1 mL av trypsin/EDTA i 5 minutter eller til cellene koble for å utføre en celletall. For å gjøre 10% FBS medium, legger du til DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamin, 1% natrium Pyruvate og 1% ikke-essensielle aminosyrer.
    4. Antall og sjekke levedyktigheten til cellene med cellen telleren og beregne volumet av hver virus nødvendig for å nå målet basert på celle nummer og virus titer. Bruke mangfold av infeksjon (MOI) av KOS = 5, hc-Myc = 5 og hKlf4 = 3 for bukspyttkjertelen celler.
    5. Tøvær ett sett med Sendai vektor rør-80 ° C lagring på is og nøye legge beregnet volum av hver av de tre Sendai vektor rør til 1 mL av Prigrow III medium, pre varmet til 37 ° C. Pipetter forsiktig å blande løsningen. En brønn i en 6-vel plate er nok for transducing med Sendai viral vektorer å generere omprogrammeres celler.
    6. Sug opp Prigrow III mediet cellene, og legge sakte reprogramming virus blandingen fordelt som inneholder cellene. Inkuber cellene over natten i en inkubator 37 ° C med en fuktet atmosfære av 5% CO 2.
    7. Nøye forkaste virus blandingen på celler og erstatte med fersk Prigrow III medium dagen 24 timer etter signaltransduksjon. Kultur celler for 5 d og endre mediet daglig alternative.
    8. På dag 5, forberede MEFs på 0,1% gelatin pre-belagt 10 cm kultur retter (1,3 x 10 6 celler/parabol). Vokse MEFs i T175 flasker til dag 4 og deretter på dag 5, utsette cellene til 6000 rads fra en γ strålingskilder før Såing av celler 13 eller bruk kommersielle MEF kilden.
    9. På dag 6, bruke 1 mL av cellen avdeling løsning for 10 min å koble transduced cellene, plate alle MEF retter i Prigrow III medium med rock hemmer (5 mM lager, 10 µM endelige) og ruge over natten i en inkubator 37 ° C med en fuktet atmosphe Re 5% CO 2.
    10. Endrer Prigrow III mediet til hESC middels neste dag. For å gjøre 500 mL hESC medium, legger du til DMEM/F-12, 20% (v/v) knockout serum erstatning (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 mM l-glutamin; 100 µM unødvendige aminosyrer og 100 µM 2-mercaptoethanol. Endre mediet forsiktig hver dag nå.
    11. Se platene regelmessig for fremveksten av cellen klumper eller kolonier indikativ omprogrammeres celler. Transformert cellene danner klonal aggregat med brosteinsbelagte morfologi og store kjernen og nucleoli. Merke sannsynlige ' iPSC ' kolonier og sjekk dem ofte for vekst.
    12. Nesten fire uker etter signaltransduksjon koloniene er klart for plukking eller overføring, forberede 24-vel MEF plater ved plating 1,3 x 10 6 celler/gelatin pre belegg plate som før for overføring av én kolonier.
      1. Forberede matrix membran (f.eks Matrigel) av aliquoting det basert på fortynningsfaktoren på analysesertifikatet. Legge til en aliquot i 25 mL av DMEM/F-12 til pelsen fire 6-plater (1 mL/vel) og ruge ved romtemperatur (RT) for minst 1 time før bruk. Manuelt velge 12-24 kolonier ved hjelp av en steril pipette-spissen Sug opp dem og overføre på MEF plater i 500 µL av hESC medium.
      2. Sug opp media i brønnen forsiktig forstyrre eller bryte koloniene. Også velge 24-48 kolonier på matrix membran belagt 24-og plater. For membran belagt plater, bruk mTeSR1 (supplert med 10 µM rock hemmer) 24 h og endre hver dag. Innen 6-10 d for å plukke koloniene, de er klar til å overføres til de nye 24-vel og/eller 12-vel membran platene for klonal ekspansjon.
    13. Om nødvendig koble koloniene på MEFs med 1 mg/mL collagenase for 20 min, vask to ganger med hESC/mTeSR1 og overføring til membran plater med teflonbelegg 12 - eller 24-brønnen. Hvis det er nok robust kolonier vokser på matrix membranen fra trinn 1.1.12, fryse koloniene på MEFs bruker iPSC frysing media som produsenten ' s retningslinjer.
    14. Løsne robust koloniene belagt på membranen i trinn 1.1.12 med 500 µL av dispase for 20 min og plate igjen på matrix membran belagt 12-vel plater. Manuelt skrape av differensierte celler eller forurensende MEF mater celler å berike for pluripotent kloner på membranen.
    15. Utvider kloner etter 6-8 d av vokse på membran belagt plater av dissociating med dispase-løsning som før og plating småcellet tilslag på fersk membran belagt 6 - eller 12-godt plate. Endre mTeSR1 medium daglig. Karakterisere omprogrammeres kloner av alkalisk fosfatase flekker, immunostaining for pluripotency markører (OCT3/4 og NANOG), FACS analyse av pluripotent overflate markører og differensiering analyser. Vokse og kultur kloner på membran-belagt plater for alle analyser inkludert CRISPR redigering som forklart ovenfor med mindre annet belegg løsning er spesielt nevnt.
  2. Karakteristikk av menneskelig iPSCs
    1. alkalisk fosfatase flekker
      Merk: en kommersiell kit brukes her. Se tabellen materialer.
      1. Plate antatte menneskelige iPSCs på 24-vel plate og kultur for 4-5 d med daglig media endring.
      2. Starter i fargeprotokoll, Sug opp kultur medium og vaske cellene med 1 mL 1 x PBS 0,05% mellom 20 (PBST).
      3. Legge til 0,5 mL fastsette løsning i kit på cellene og ruge på RT i 2 til 5 min. leveringstanken fastsette løsningen og deretter vaske fast cellene med PBST. Ikke Tillat brønnene tørke.
      4. Legge til 0,5 mL av nylagde AP substratløsningen per brønn ved å blande løsning A, B og C. Incubate cellene i mørket (innpakket med folie eller i en mørk beholder) ved romtemperatur for 5-15 min.
        Merk: Nøye overvåke fargeendring og stoppe reaksjonen når fargen blir lyse å unngå ikke-spesifikk farging.
      5. Stoppe reaksjonen av aspirating substratløsningen AP og vaske brønnene to ganger med 2 mL 1 x PBS.
      6. Observere koloniene under mikroskopet og ta bilder på 4 X eller 10 X forstørrelse noen lysende felt mikroskop med et kamera.
    2. Immunostaining
      1. Plate menneskelige iPSCs i 24-vel plate og kultur for 4-5 d med daglig media endring.
      2. Vask celler når kort med PBS og fastsette for 20 min med 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS.
      3. Vask tre ganger i 10 min (3 x, 10 min) med PBS på RT.
      4. Mette uspesifisert nettsteder med 10% normal geit eller esel serum (NS, avhengig av dyr sekundære antistoffer vokste opp i) i PBS for 40 minutter til RT. For bare intracellulær epitoper, inkluderer 0,3% TX-100 i PBS (TX/PBS) til permeabilize.
      5. Vask 3 x 5 min med PBS på RT.
      6. Fortynne OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 og SOX17 antistoffer i en fersk løsning på 5% NS i PBS og Inkuber for 2t RT eller over natten på 4 ° C.
      7. Vask 3 x i 5 min med PBS på RT.
      8. Fortynne riktig sekundære Alexa Fluor 488 eller 568 antistoffer i 5% NS/PBS og Inkuber celler 1t på RT.
      9. Vask 3 x i 5 min på RT.
      10. Ruge med DAPI i PBS for 10 min og vask 2 x 5 min på RT. Bruk fluorescerende mikroskop å ta bilder.
    3. Fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)
      1. Plate menneskelige iPSCs i en 6-vel plate og kultur til koloniene blitt 80% confluent (minst 10 5 celler/eksempel) med daglig mTeSR1 medium endring.
      2. På dagen for eksperimentet, isolere cellene og oppheve tilknytningen til en enkeltcelle suspensjon som forklart ovenfor i protokollen. Vask med 10% FBS medium.
      3. For overflate markører, resuspend 0,5-1 mL av 10% FBS medium og holde på ice.
      4. For intracellulær markører, resuspend i 1 mL av 4% PFA/PBS og Inkuber i 10 min ved romtemperatur. Vask med 10% FBS medium. Resuspend på 0,1% TX/PBS og Inkuber i 15 min på is. Vask igjen med 10% FBS medium. Resuspend 0,5-1 mL av 10% FBS medium og holde på ice.
      5. Legge til 50 µL av cellen suspensjon til 50 µL av 10% FBS middels inneholder anbefalte TRA-1-60, TRA-1-81 eller SSEA-4 antistoffer og ruge i 30 minutter til 1 h.
      6. Vask to ganger med 10% FBS.
      7. Resuspend i 100 µL av 10% FBS medium med fluorescerende sekundære antistoffer og Inkuber for 30 min. vask to ganger med 10% FBS og resuspend i riktig volum på 10% FBS. Levende celler kan være differensiert fra døde celler av propidium iodide dye lagt på < 1 µg/mL å anslå celle apoptose under prosessen.
    4. Tri-lineage differensiering
      1. frø to 6-vel plater med 1,5-2 x 10 6 iPSCs/godt inn mTeSR1 medium med 10 µM rock inhibitor.
      2. At cellene å vokse for 2-3 d med daglig mTeSR1 medium endring til brønnene er 80-90% confluent.
      3. For ektoderm induksjon, legge neural induksjon medium (NIM) ifølge produsenten ' s instruksjonene i 2-3 brønner i 6-vel platene.
      4. Endre mediet til RPMI som inneholder 2% B27 supplement minus insulin og 12 µM CHIR99021 for mesoderm induksjon i 2-3 brønner plater 14. Legg til bare RPMI som inneholder 2% B27 supplement minus insulin for de neste 24 h. legge 5 µM IWP4 å RPMI mediet med 2% B27 supplement minus insulin for neste 24 h. Etter 72 h, erstatte media med RPMI som inneholder 2% B27 supplement fører til generering av slo cardiomyocytes i 2-3 d.
      5. For endoderm induksjon, endre mediet i brønner av 6-vel platene til MCDB 131 supplert med 1,5 finans natriumbikarbonat, 1 x Glutamax, 10 mM glukose, 0,5% BSA, 100 ng/mL GDF8 og 5µM av CHIR99021 for 24 h. kultur i samme medium uten CHIR99021 for 2-3 d 15.
      6. Følger immunostai-protokollen fra trinn 2 for alle de tre linjene og sjekk for uttrykket av relevante indikatorer.

2. Genomet redigering av menneskelig iPSC bruker CRISPR-Cas9

  1. forberedelse av Cas9 protein og sgRNA
    1. Aliquot Cas9 protein i microcentrifuge rør sterile forhold og lagre dele av frysing rør på-80 ° C.
    2. Design to målretting guide RNAs per genet basert på programvaren fra MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) eller noen andre CRISPR guide design webtool. Målrette første eller andre ekson av genet (basert på åpent lesing ramme) til å generere fortrenging. Velg de to guider slik at de kuttet tett (~ 30-100 bp fra hverandre) og vi kan enkelt visualisere slettingen bruker samme sett med screening primere. Velg guider fra programvare produksjon basert på flere kvalitetspoeng og lavere antall av målområder. Utforme screening primere bruker programmet primer eksplosjonen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Screening primere bør være minst 100 bp fra Cas9 kutte områder og PCR-produktstørelse vµre helst mellom 400-700 bp for enklere forsterkning av PCR.
    3. Design to utfyllende sgRNA oligo DNAs (19-22 nukleotider av guide sekvensen) med en Bsa1 kuttet nettstedet i hver ende. Oligo DNAs kan syntetiseres kommersielt og herdet for å danne dobbel-strand DNA. For avspenning, Legg 1 µL hver 100 µM guider, 25 µL av avspenning buffer (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) og 23 µL av vann. Inkuber i en thermocycler programmert til å starte på 95 ° C i 2 minutter og deretter gradvis kjøling til 25 ° C over 45 min.
    4. Klone den 2 µL av resulterende fragmenter i et Bsa1 begrensning enzym fordøyd 1 µL av interne T7 formidler pCR2.1 vektor med en Cas9 binding området ved hjelp av T4 DNA ligase ifølge produsenten ' s protokollen.
    5. Rekkefølge klonet DNA fragmenter og når gjengivelse er etablert, i vitro transkribere kloner bruker en T7 kit til å generere enkelt guide RNAs. Rens sgRNAs med en kommersiell kit og elute i RNase-fritt vann. Sjekk RNA konsentrasjonen.
  2. Hva av hiPSCs
    1. kultur hiPSCs mTeSR1 medium som beskrevet ovenfor til cellene er 40-50% confluent.
    2. To timer før nucleofection, erstatte mediet med 2 mL prewarmed mTeSR1 medium som inneholder 10 µM rock inhibitor.
    3. En time senere forberede destinasjon brønner for nucleofected celler av aspirating membran, forberedt som ovenfor fra 12-vel plate og erstatte med prewarmed 1 mL av mTeSR1 medium med 10 µM rock inhibitor. Holde på 37 ° C i inkubasjon.
    4. Forberede nucleofection master mix (skala riktig avhengig av prøvene) for hver prøve av tilføyer 16.4 µL P3 primære cellen supplement, 3,6 µL av Supplement 1 fra nucleofector kit, 0,5 µg Cas9 protein og 0,5 µg av hver sgRNA i 22 µL per reaksjon volum. pMAX GFP vektor ble også nucleofected som produsenten ' s anbefalinger i celler omtrent beregne effektiviteten av iPSC transfection.
    5. Vask hver med 2 mL RT PBS etter aspirating mediet som inneholder rock hemmer fra iPSC brønnene. Deretter Sug opp PBS legge 1 mL av cellen avdeling løsning og ruge platen ved 37 ° C i 10 min.
    6. Resuspend cellene i 3 mL mTeSR1 mellomstore og Pipetter forsiktig opp og ned for å generere en enkeltcelle suspensjon. Forflytning dissosiert cellene til en 15 mL sentrifuge rør som inneholder 5 mL mTeSR1 medium.
    7. Telle celler med cellen counter og beregne totale volumet kreves for 0.5 x 10 6 celler/hva. Plasser ønsket antall celler i 15-mL sentrifuge tube, sentrifuge 200 x g i 5 min på RT og Sug opp nedbryting.
    8. Resuspend hver enhet av 0.5 x 10 6 celler i 22 µL av hva master mix i trinn 4. Raskt overføre celler i sentrale kammeret av en godt av en nucleocuvette. Plasser stripen i en nucleofector enhet og nucleofect celler ved hjelp av programmet CB150.
    9. Etter nucleofection, raskt legge til 80 µL av prewarmed mTESR1 medium som inneholder 10 µM rock hemmer hver brønn av nucleofected celler. Bland forsiktig av pipettering opp og ned.
    10. Forsiktig overføre celler fra strip brønner av membran pre belagt 12-vel plate inneholder mTeSR1 medium med rock hemmer i trinn 3.
    11. Etter 1 d, endre til frisk mTeSR1 medium uten rock inhibitor. Høste celler 2-3 d etter nucleofection for enkeltceller sortering.
  3. Encellede isolering av målrettet hiPSCs
    1. dagen før sorteringen, forberede 96-brønns MEF plater av seeding 2 x 10 6 celler/gelatin-belagt plate i 10% FBS medium. Ca 70-80% av kloner overleve etter nucleofection og 2-3 MEF plater kan være forberedt for hver redigering eksperimentet.
    2. Etter den natten inkubering, endre mediet til hESC medium (som beskrevet tidligere) med 100 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (hemmere lagt til media for å forbedre enkeltcelle levedyktighet), og 5 mg/mL fibronectin å fremme vedheft.
    3. Erstatte mediet på hiPSCs i 12-vel platen fra mTeSR1 til mTeSR1 middels supplert med 1 x SMC4 for minst 2 timer før enkeltcelle sortering.
    4. Sug opp mediet hiPSCs og vask cellene forsiktig med PBS. Legg til 500 µL av cellen avdeling løsning i hver brønn og ruge ved 37 ° C i 10 min etter aspirating PBS. Generere encellede suspensjon av tilføyer 1 mL av mTeSR1 (unsupplemented) i hver brønn og pipettering forsiktig opp og ned flere ganger.
    5. Plasserer celle suspensjon i en 15-mL konisk rør og sentrifuge for 5 min på 200 x g ved RT. leveringstanken nedbryting og resuspend cellene i 1 mL av mTeSR1.
    6. Sortere cellene i enkeltceller celle sortering med 100 mm dyse under sterile forhold med én celle i individuelle godt av 96-brønns platene i trinn 1.
    7. Fire dager etter sortering, koloni formasjon bør være tydelig, eller foreløpig erstatte kultur medium med hESC medium med 1 x SMC4.
    8. Åtte dager etter sortering, erstatte medium med hESC medium og kultur for 2 d.
    9. Løsne koloniene bruker 1 mg/mL collagenase for 20 min og overføre dem til 24-vel membran belagt plater i mTeSR1 med rock inhibitor. La encellede kloner vokse og ekstra genomisk DNA etter duplisering eller utvide dem. Bruke genet bestemt primere for å forsterke målet DNA av PCR.
    10. Bruk fragment analyzer kit for første screening PCR forsterket målet genomisk regionen i alle kloner ved å kjøre dem gjennom gel/fargestoff mix som produsenten ' s instruksjoner. Beregne resulterende fragment størrelsen i programvaren PROSize ved å sammenligne den med den riktige stigen, som drives med eksemplene. Sekvens forventet ' endret ' kloner og analysere sekvenser data å bekrefte redigering eller sletting.
    11. For å skille monoallelic og biallelic kloner, forsterke redigerte sekvensen med PCR og klone på pJET1.2 vektor. Send minst 8-10 kloner for sekvensering og kontrollere sekvens for å bekrefte redigering i en eller begge alleler.
    12. Når vellykket målrettet iPSC kloner identifisert gjennom genotyperingteknologi, undersøke for å bekrefte at de ikke har mistet pluripotency eller fått kromosomavvik gjennom prosessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne publikasjonen, har vi fulgt en enkel, men effektiv protokoll for generering av iPSC fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av integrasjon eller fotavtrykk-fri Sendai virus vektorer. Figur 1A viser en skjematisk fremstilling av denne reprogramming protokollen. De menneskelige bukspyttkjertelen cellene ble kjøpt kommersielt, kultivert i Prigrow III medium og transduced med Sendai virus som forklart ovenfor. Transduced spindel formet bukspyttkjertelen celler vise ikke endringer morfologiske ~ 5 dager etter Sendai virus signaltransduksjon dag 0, men deretter blir avrundet med større kjernen og nucleoli. Noen tidlige kolonier ble sett etter en uke etter signaltransduksjon men de var ikke plukket, i vår erfaring, disse kolonier raskt dissociate og er vanligvis 'tidlig delvis omprogrammeres celler' som ikke etablere robuste kolonier. Ca 10-15 dager etter transduction, små lyse kolonier ble observert og ble plukket etter vekst (figur 1B, øverst til høyre). Menneskelige iPSC koloniene er kompakte, tett pakket med klart kanter (betraktet som 'fullt omprogrammeres celler') (figur 1B, dag 23 bunnen midten) og 'delvis omprogrammeres celler' løs med hull i kolonien (figur 1B, dagen 23 nederst til høyre). Omprogrammeres bukspyttkjertelen celle koloniene vokste på dag 18 (figur 1Bvenstre) og var stor nok til å bli plukket manuelt av dag 23 (figur 1B, bunnen midten). Koloniene ble belagt på membran-belagt plater etter plukke å få mater-fri iPSC av dag 30-40 (figur 2A, til venstre). Noen av disse "vederheftig" mater-fri kolonier ble utvidet og preget for uttrykket av alkalisk fosfatase, pluripotency og overflate markører i mater-gratis forhold. Alle kloner testet var positivt for alkalisk fosfatase de viste rød etter analysen (figur 2A, høyre). Pluripotency markører OCT4, NANOG, SSEA4, TRA-1-60 og TRA-1-81 ble også observert skal uttrykkes høyt i alle de andre Klonene av immunostai- eller FACS analyse (figur 2B og figur 3A).

Disse resultatene viser at menneskelige iPSC koloniene generert fra bukspyttkjertelen celler uttrykt pluripotency markører i arkmateren uten betingelser. Pluripotency ble også vurdert av rettet differensiering av menneskelig iPSC tre bakterie lag: ektoderm, mesoderm og endoderm. Kloner på membran potently differensiert TUJ1-positive neurons (ektoderm), NKX2-5-positiv slo cardiomyocytes (mesoderm) og SOX17-positive endodermal celler (figur 3B).

Etter grundig karakterisering, ble 3-robust, mater-fri iPSC klonal linjer valgt for genomet redigering studier. De to guidene med BsaI kuttet områder i ender ble utformet for hver genet å kutte tett sammen (dvs. n under ~ 100 bp). Skjematisk av protokollen er vist i Figur 4. Denne sletting strategien brukes for målet genene tillot oss for enkelt å slette en del av den første eller andre ekson med et. Denne strategien var svært effektivt, og vi kan isolere redigerte kloner i hvert forsøk. Guidene ble klonet BsaI fordøyd vektor og i vitro transkribert som beskrevet ovenfor. Vi nucleofected guider (RNAs) og Cas9 proteiner som RNP komplekser for rask og effektiv redigering. Vi har også sortert cellene som enkeltceller på MEFs utvinning av celler er høyere sammenlignet med cellene sortert enkeltvis på membran-belagte plater. Genomic DNA ble isolert fra alle kloner, delen mål ble forsterket av PCR og løst fragment analyzer til skjermen for endringer i størrelser av målet sammenlignet med kontrollene. Fragment størrelsen ble sammenlignet stigen med prøvene å oppdage 'redigert' kloner (Figur 4, nederst). Dette gjorde screening av kloner lett som vi kunne gå > 90 kloner i en plate og resultatene ble oppnådd med nøyaktigheten av ± 3 bp. De valgte Klonene ble deretter rekkefølge for å bekrefte vill-type og mutert kloner. Wildtype kloner hadde ingen sletting eller tillegg av baser mens mutert kloner hadde tillegg eller sletting i rekkefølge i forhold til wildtype. Kloner viser sletting eller tillegg i sekvensering ble utvidet og klonet inn pJET1.2 vektor å identifisere monoallelic og biallelic kloner av sekvensering av minst 8-10 kolonier per kloning. Monoallelic kloner hadde baser slettet eller lagt til i en allelet og den andre var uendret og lignende til wildtype allelet. Biallelic kloner hadde slettinger i både alleler. Omtrent ble tre hundre kloner vist for alle mål gener, som identifiserte ca 9 monoallelic sletting kloner og 3 biallelic sletting kloner i hvert tilfelle. Dette tilsvarer omtrent 3 ganger reduksjon i frekvensen av generasjon av biallelic kloner sammenlignet monoallelic kloner. Heterogenitet i sletting amplicons reflektert imperfektum og inkonsekvent NHEJ reparasjon. Uttrykket av genet ble endelig bekreftet ved utpakking RNA fra målet celler og utføre RT PCR.

Figure 1
Figur 1: omprogrammering av menneskelige bukspyttkjertelen celler mater-fri pluripotent celler (iPSC). (A) A skjematisk protokoll for generering av iPSC fra menneskelige bukspyttkjertelen celler vises. Bukspyttkjertelen celler ble dyrket på kollagen belagte plater og deretter overført til MEFs etter signaltransduksjon med human Sendai virus vektorer. Helt omprogrammeres koloniene ble deretter overført til hESC kvalifisert membran og preget. (B) Morphological endres etter Sendai virus signaltransduksjon. Før transduction viser bukspyttkjertelen celler typisk spindel-lignende morfologi (øverst til venstre, dag 0). Små, trange kolonier vises på MEFs dag 12, ligner menneskelige pluripotent celle kolonier. Normalt fullt omprogrammeres menneskelige iPSC koloniene har veldig klare grenser og kan bli plukket opp av dag 23-30. En dissociated koloni på dag 23 vises på bunnen rett. Alle bildene ble tatt på 100 X forstørrelse (10 X mål og 10 X okularet). Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av menneskelig iPSC. (A) A typisk fase kontrast bildet av en iPSC koloni etter plukking og kultur i arkmateren uten betingelser (40 X, 4 X mål og 10 X okular, venstre) etter Sendai virus omprogrammering av bukspyttkjertelen celler. Alkalisk fosfatase farget rød iPSC koloni er til høyre. Alkalisk fosfatase farging, iPSC koloniene ble løst og farget rødt etter tillegg av substratløsningen fra kit. Bildene ble tatt på 40 X. (B) immunostai-for pluripotency markører NANOG, og OCT3/4 i arkmateren uten menneskelig bukspyttkjertelen celle-avledet iPSCs. DAPI ble brukt stain kjernen blå som en kontroll. Alle bildene ble tatt på 100 X forstørrelse. Skala bar = 100 µm i alle bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: karakterisering av pluripotency og differensiering potensialet til iPSC. (A) FACS analyse av overflate markører SSEA4, TRA-1-60 og TRA-1-81 i arkmateren uten iPSCs. Cellene var avstand til enkeltcelle suspensjon og farget for overflate markører SSEA-4, TRA-1-60 og TRA-1-81. Lilla toppen inneholder iPSC negative (antistoff kontroll) celler og bukspyttkjertelen iPSC kan hjerneprosesser som grønne toppen. (B) Immunofluorescent imaging av bakterie lag markør gener. Uttrykket markører TUJ1 ektoderm (grønn), NKX2-5 mesoderm (rød) og SOX17 endoderm (rød) i cellene etter rettet differensiering av bukspyttkjertelen iPSC. Tilsvarende kontroll kjernefysiske flekken DAPI er blå. Alle bildene ble tatt på 100 X forstørrelse. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: skjematisk av CRISPR/Cas9 sletting strategi. En sgRNA par var designet (merket rød) med BsaI kuttet nettsteder på slutten (vist som F og R) fortrinnsvis rettet mot den første ekson, herdet, klonet i BsaI fordøyd endret vektor (pCR2.1, BsaI område uthevet grå) sekvensielt og i vitro oversatt. Understreket sekvensen av vektor viser delen slettet etter BsaI fordøyelsen. Plasseringen av screening primere angis i blått. Cas9 og RNAs var nucleofected i arkmateren uten iPSC som en kompleks for genomisk slettinger. iPSCs var så enkelt celle sortert på 96-brønns MEF plater, kultivert, overført til membran, utvidet og vist av fragment analyzer. For å kjøre prøver på analysatoren, var genomisk DNAs av Cas9 og guide transfekterte kloner på membran utdraget og gikk gjennom gel/fargestoff mix i analyzer velge for potensielle 'redigert' kloner (nederst i midten). De relevante stigen markører, WT og potensielle redigerte kloner er merket. Uttrykket av genet ble bekreftet av utdrager RNA og analysere med Q-PCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Omprogrammering av menneskelig somatiske celler til iPSCs har gitt en viktig vitamininnsprøytning til grunnleggende biologi forskning, personlig medisin, sykdom modellering, narkotika utvikling og regenerativ medisin16. Mange nåværende og brukte metoder for menneskelig iPSC generasjon krever bruk av virus med risikoen for integrering i vert genomet eller episomal vektorer med lav omprogrammering effektivitet. Her presenterer vi en effektiv metode for å generere mater-gratis iPSCs fra menneskelige bukspyttkjertelen celler med Sendai-viruset, som fører til "footprint gratis" og effektiv omprogrammering. De resulterende menneskelig iPSCs er viral effekter av transgener, opprettholde pluripotency og unngå bruk av ukjent ytre faktorer. Generering av iPSCs i arkmateren uten forhold har lav omprogrammering effektivitet, så vi omprogrammeres de primære bukspyttkjertelen cellene på materen celler og deretter flyttet koloniene til mater-fri membran for ekspansjon, kultur og karakteristikk. Fusjon av disse teknikkene gir stabil, pålitelig og mer effektiv iPSC programmering.

Vi også genereres iPSCs fra menneskelig fibroblaster og andre primære celler med denne metoden, som antyder at Sendai-virus kan brukes til å omprogrammere rekke celler. Viktige betraktninger: behov for optimal confluency primære celler må omprogrammeres som for få eller for mange celler virkninger omprogrammering effektivitet; en tidligere tidens primære celler når cellene er fortsatt optimalt dele; forsiktig titrering av viral vektorer som resulterer i minimal celle apoptose og en høy effektivitet fører til enkel plukke opp av robust koloniene; kontrollere tap av Sendai vektor transgene uttrykk av PCR på 10-15 ganger å sikre at iPSCs "footprint gratis"; og strenge sterile forhold for kultur av iPSC på membran.

Vi brukte en praktisk og effektiv metode for CRISPR genomet modifisering for å redigere iPSC genomet. Denne teknikken kombinerer Cas9 protein og sgRNA, RNP komplekser å gjenkjenne og cleave de komplementære DNA-sekvensene. Det kan være enkelt tilpasses til å målrette en genomisk sekvens ved å endre 20 bp guiden RNA. Vår metode gir en enkel protokoll for effektiv og reproduserbar redigering av menneskelige iPSCs som de er mer arbeidskrevende, vanskelig å transduce, og dyre å vedlikeholde enn andre celler. Vi designer minst to tilstøtende men ikke-overlappende guider for hvert mål genet slik at ett sett screening primere kan brukes for screening redigerte kloner. I tillegg genererer bruk av to guider ~ 30-100 bp apart en stor sletting, som lett kan visualiseres under foreløpige screening og sikrer uttømming av protein. Førerne kan testes i HEK-293 celler først å beregne effektiviteten før analysen i iPSC. I tillegg er det avgjørende å etablere parametere for rutinemessig transfection reagenser i iPSC. Bruke pMAXGFP plasmider, hva effektiviteten av > 80% og genet målrette/avbrudd effektivitet på 3-10% i iPSCs er rutinemessig oppnådd. Direkte levering av Cas9 RNP komplekser i celler i våre protokollen gir rask handling og rask omsetning og opprettholder høy forekomst av målrettet modifisering. Vår tilnærming sysselsetter enkelt celle sortering etter nucleofection av guider og Cas9 protein, overvinne et betydelig hinder genet målretting i blandet iPSC befolkningen og clonality av cellene. Denne "Roman" helhetlig tilnærming er enkel, lett å multiplex, tar bare noen uker og krever ikke noen antibiotikumet utvalg. Vi ikke observerer tap i effektivitet ved å innføre sekvensielt slettinger av CRISPRs i en celle linje eller iPSCs, selv om karyotype analyse må utføres i slike tilfeller å sikre genomisk stabilitet. Kloner burde likeledes være avkrysset for uttrykk for pluripotency markører. Selv ikke fokus i denne publikasjonen, denne protokollen kan være co-valgt å indusere presis genetisk modifisering av inkludert malen reparasjon i transfection cocktail17,18.

Til slutt, basert på vår erfaring, viktige hensyn for iPSC redigering protokollen er: rasjonell design guider til minimere eller helt unngå av målet mutasjoner spesielt i "frø regionen" eller nær PAM motiv endres; optimalisering av nucleofection effektiviteten i iPSCs å sikre levering av RNPs; verifisere kvaliteten på forberedt guider; titrering guide og Cas9 protein konsentrasjoner og validere sin aktivitet av i vitro biokjemiske cleavage søk eller som beskrevet i denne artikkelen i menneskelige cellssuch som HEK celler som er lettere å kulturen og transfect; Bruk av tidlig passering iPSCs i loggen fasen av vekst og nå ~ 50% confluency; forsiktig håndtering av celler med mild medium endres etter enkeltcelle sortering for å sikre overlevelse av celler.

Vi tror at ovennevnte disponerte protokollen avgrenset i tilstrekkelig detalj vil utstyre leserne med et veikart til å generere og redigere iPSC på reproduserbar måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

BT er medlem av renovere biovitenskap Inc.

Acknowledgments

Arbeid i laboratoriet ble støttet av postdoktorstipend tilskudd til Dr. Anjali Nandal og utforskende grant fra Maryland Stem Cell Research Fund til BT (TEDCO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit Invitrogen A16517 Thaw on ice; S No: 1
Trypsin EDTA Gibco Life Tech 25300-054 0.05%, 100 ml; S No: 2
Rock inhibitor (Y-27632) Milipore SCM075 Use 10 μM; S No: 3
DMEM/F-12 medium Invitrogen 11330-032 S No: 4
Serum replacement (KSR) Gibco 10828028 S No: 5
DMEM Invitrogen 11960069 1X; S No: 6
Fetal bovine serum Thermo Scientific SH30071.03 Aliquot; S No: 7
L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid Thermo Scientific 35050061 1/100; S No: 8
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050 1/100; S No: 9
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 55 mM, 1/1,000; S No: 10
Hausser Hemacytometers Hausser Scientific 02-671-54 S No: 11
0.1% Gelatin Solution STEMCELL Technologies 7903 Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12
SSEA-4 antibody Santacruz sc-21704 1/100; S No: 13
TRA-1-81 antibody Cell Signaling 4745S 1/200; S No: 14
OCT4 antibody Santa Cruz sc-5279 1/1,000; S No: 15
Collagen I, Rat Tail Life Technologies A10483-01 Keep cold; S No: 16
Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) Invitrogen A21202/A10042 1/2,000; S No: 17
DPBS Hyclone SH30028LS 1X; S No: 18
100-mm tissue culture dish Falcon 353003 S No: 20
96-well tissue culture plate Falcon 353078 S No: 21
6-well tissue culture plate Falcon 353046 S No: 22
Dissecting scope  Nikon SMZ745 S No: 23
Picking hood NuAire NU-301 S No: 24
15 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 188271 S No: 25
50 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 227261 S No: 26
Sodium pyruvate Invitrogen 11360 S No: 28
β-mercaptoethanol Sigma M7522 S No: 29
Prigrow III medium ABM TM003 S No: 31
Countess™ Cell Counter Invitrogen C10227 S No: 32
Faxitron X-ray system Faxitron CellRad S No: 33
Accutase Innovative cell Technologies AT-104 S No: 34
Collagenase Life Technologies 17104019 1mg/ml stock; S No: 35
Dispase STEMCELL Technologies 7923 S No: 36
hESC qualified matrigel BD Biosciences 354277 To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37
bFGF R & D 233-FB Stock 10 ug/ml; S No: 38
Paraformaldehyde EMS 15710 4% stock in PBS; S No: 39
TRA-1-60 Santa Cruz sc-21705 1/100; S No: 40
NANOG ReproCELL RCAB0004P-F 1/100; S No: 41
Tween 20 Sigma P9416-100ML S No: 42
Alkaline Phosphatase kit Stemgent 00-0055 S No: 43
Cas9 protein PNA Bio CP01-50 Thaw and aliquot; S No: 44
Goat or donkey serum Sigma D9663/G9023 S No: 45
Triton X-100 Sigma X100-100ML S No: 46
DAPI Thermo Scientific D1306 S No: 47
Tris Sigma 9285-100ML S No: 48
NaCL Sigma S7653-250G S No: 49
EDTA Sigma BP2482-500 S No: 50
T4 DNA ligase NEB M0202T S No: 51
Mega Shortscript T7 kit Thermo Scientific AM1354 S No: 52
Mega Clear kit Thermo Scientific AM1908 S No: 53
SMC4 BD Biosciences 354357 S No: 54
Fibronectin STEMCELL Technologies 7159 S No: 55
CloneJET cloning kit Thermo Scientific K1232 S No: 56
Fragment analyzerTM Advanced Analytical S No: 57
mTeSR1 medium kit STEMCELL Technologies 5850 Warm to room temperature; S No: 58
Freezing medium mFreSR™ STEMCELL Technologies 5855 S No: 59
Freezing medium CryoStor® STEMCELL Technologies 7930 S No: 60
MEFs Globalstem GSC-6301G S No: 61
L-glutamine Invitrogen 25030081 S No: 62
Human pancreatic cells ABM T0159 S No: 63
STEMdiff™ Neural Induction Medium Stemcell Technologies 5835 S No: 64
RPMI Thermofisher 11875-093 S No: 65
2% B27-insulin Thermofisher A1895601 S No: 66
CHIR99021 Stemcell Technologies 72052 S No: 67
IWP4 Stemcell Technologies 72552 S No: 68
2% B27 Thermofisher 17504044 S No: 69
MCDB 131 Life Technologies 10372019 S No: 70
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S8761-100ML S No: 71
Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G S No: 72
BSA Proliant 68700 S No: 73
GDF8 Pepro-Tech 120-00 S No: 74
TUJ1 antibody EMD Milipore AB9354 S No: 75
NKX2-5 antibody Santa Cruz Sc-14033 S No: 76
SOX17 antibody R & D systems AF1924 S No: 77
Propidium iodide Thermo Scientific P3566 S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™ Lonza AAF-1002 S No: 79
FACSAria II (cell sorter) BD biosciences SORP UV S No: 80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
  5. Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. 564612 (2012).
  6. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
  7. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
  9. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
  10. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
  11. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
  12. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
  13. McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
  15. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
  16. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
  17. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
  18. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
Effektiv generasjon og redigering av mater-gratis IPSCs fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nandal, A., Mallon, B., Telugu, B. P. Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System. J. Vis. Exp. (129), e56260, doi:10.3791/56260 (2017).More

Nandal, A., Mallon, B., Telugu, B. P. Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System. J. Vis. Exp. (129), e56260, doi:10.3791/56260 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter