Summary
Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.
Abstract
Células madre pluripotentes embrionarias e inducidas pueden uno mismo-renovar y diferenciarse en múltiples tipos de células del cuerpo. Las células pluripotentes así son codiciadas para la investigación en medicina regenerativa y actualmente en ensayos clínicos para enfermedades oculares, diabetes, enfermedades cardíacas y otros trastornos. El potencial de diferenciarse en tipos celulares especializados juntados con los recientes avances en tecnologías, incluyendo el sistema CRISPR/Cas de edición genómica han proporcionado oportunidades adicionales para adaptar el genoma de iPSC para variadas aplicaciones incluyendo las enfermedades al modelado, terapia génica y sesgar las vías de diferenciación, para nombrar unos pocos. Entre las tecnologías disponibles de la edición, el CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes ha surgido como una herramienta de elección para la edición específica del genoma eucariótico. Los CRISPRs son fácilmente accesible, barato y muy eficiente en ediciones específicas de la ingeniería. El sistema requiere una nucleasa Cas9 y una secuencia de guía (20-mer) específica para el objetivo genómico contigua a un 3-nucleotide "NGG" protospacer-adyacente-motivo (PAM) para apuntar Cas9 para el locus genómico deseado, junto con un trazador de enlace Cas9 universal (RNA juntos llamados ARN guía individual o sgRNA). Aquí presentamos un paso a paso el protocolo para la generación eficiente de iPSC alimentador independiente y libre de huella y describir metodologías para la edición del genoma de iPSC usando los complejos de Cas9 ribonucleoproteína (RNP). El genoma edición protocolo es eficaz y puede ser fácilmente multiplexado por sgRNAs pre-secuestrantes para más de un objetivo con la proteína Cas9 y entregar simultáneamente en las células. Por último, se describe un enfoque simplificado para la identificación y caracterización de iPSCs con ediciones deseadas. Tomados en conjunto, las estrategias se deben optimizar la generación y edición de iPSC para múltiples aplicaciones.
Introduction
La reprogramación de células somáticas humanas para el estado de pluripotencialidad por la sobreexpresión de factores de reprogramación ha revolucionado la investigación con células madre con aplicaciones en modelado de enfermedad, medicina regenerativa y desarrollo de medicamentos. Varios métodos de reprogramación no están disponibles para la entrega de factores de reprogramación y generar iPSCs, pero el proceso es mano de obra intensiva y no muy eficiente1. Los métodos virales, aunque eficiente, están asociados con problemas de integración de virus y tumorigenicidad2,3,4. En este manuscrito, Divulgamos el uso de virus Sendai citoplásmico entrega factores y establecer líneas de huella libre iPSC que carecen de integración de cualquier secuencia de vectores virales en sus genomas5. El virus Sendai es un virus ARN que se diluye de pasajes de la célula citoplasma ~ 10 después de la infección y produce factores de reprogramación en abundancia, llevando a la rápida y eficaz reprogramación6,7. IPSCs establecido puede ser transición fácilmente al medio sin alimentador para evitar el uso de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) como células de alimentador8.
En esta publicación, además de que el virus de Sendai mediada por reprogramación, también Describimos un protocolo mejorado para la edición de iPSCs, que tiene el potencial para suministrar células humanas ilimitadas con modificaciones genéticas deseadas para la investigación. Hemos utilizado tecnología CRISPR/Cas9 para la modificación de iPSCs, que ahora está siendo usada para una amplia gama de aplicaciones incluyendo knock-ins y nocauts, deleciones genómicas a gran escala, combinado biblioteca de descubrimiento de genes, ingeniería genética de numerosos organismos modelo y gene terapia9,10,11. Esta técnica consiste en la formación de complejos de Streptococcus pyogenes-derivadas Cas9 nucleasa y 20-mer guía RNAs que logran el reconocimiento de destino a través de bases con secuencia de genomic destino junto a 3' nucleótido protospacer adyacente secuencia de adorno (PAM). La nucleasa Cas9 induce un nucleótidos rotura trenzado doble ~ 3 desde el sitio de PAM, que es posteriormente reparado predominante por no homóloga se terminan uniendo vía (NHEJ) a inserciones o deleciones en el marco de lectura abierto y lo funcional Knockout de genes12.
Nuestro protocolo mejorado incluye los detalles para el cultivo de las células pancreáticas humanas, su reprogramación en mitotically inactivado fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) para lograr una mayor eficiencia de reprogramación, la posterior adaptación a la cultura libre de alimentador sobre Matrigel, caracterización de iPSCs establecida, guiada por CRISPR RNA diseño y preparación, entrega en iPSCs como complejos de RNP, única célula clasificación para generar líneas clonales de iPSCs editado, fácil detección e identificación de ediciones y caracterización de clones de la célula. Deleciones genómicas eficientemente se obtuvieron en este estudio por la introducción de la proteína Cas9 y dos complejos CRISPR sgRNA RNP para inducir roturas trenzados doble (distritales) y supresión de la intervención del segmento. Este método capitaliza el uso de dos guías para generar deleciones en el marco de lectura abierto, alta eficiencia de NHEJ a bajo número de clones necesidad de ser caracterizado y fácil proyección preliminar de clones por el capilar automatizado unidad de electroforesis, analizador de fragmento. Estos genoma eficaz edición de métodos para generar modelos de enfermedades humanas basadas en células madre se convertirá pronto en un enfoque estándar y de rutina en cualquier laboratorio de células madre. Finalmente, la edición del genoma exacto hará posible ir más allá de los modelos de enfermedad de célula de vástago y potencialmente podría ayudar a catalizar las terapias basadas en células.
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Protocol
1. Protocolo de reprogramación
- generación de iPSC humana de las células pancreáticas humanas primarias
- capa un pozo de 6 placa con 1,5 mg/mL de colágeno fría y déjelo gel a 37 ° C por 1 h.
- Paso temprano humanas células pancreáticas primarias en medio de la Prigrow III (~ 1-1.5 × 10 5 células) en un colágeno cubierta placa de 6 pozos en día -2 para lograr aproximadamente 2.5 × 10 5 células o al menos el 60% de la placa confluency por bien en el día de transducción de señales (día 0). Para el primer estudio, placa de pozos de al menos 2-3 para conseguir un pozo con confluencia deseado en el día 0. Utilizar al menos un pozo como un control para contar las células.
- En el día de transducción (día 0), calentar 1 mL de medio de Prigrow III en un baño de agua de cada pozo para ser transduced. Cosechar las células de un control bien en 1 mL de 10% FBS medio usando 1 mL de tripsina/EDTA por 5 min o hasta que suelte las células para realizar un conteo de células. Para hacer medio de 10% FBS, agregar DMEM, 10% FBS, 1% glutamina, 1% piruvato de sodio 1% no esenciales aminoácidos y.
- Cuenta y comprobar la viabilidad de las células usando el contador de célula y calcular el volumen de cada virus necesita para alcanzar el objetivo basado en la titulación de virus y número de celular. Utilizar multiplicidad de infección (MOI) de KOS = 5, hc-Myc = 5 y hKlf4 = 3 para las células pancreáticas.
- Un sistema de deshielo de Sendai vector tubos de almacenamiento de-80 ° C en hielo y agregue cuidadosamente el volumen calculado de cada uno de los tres tubos de vector de Sendai a 1 mL de Prigrow III medio, previamente calentado a 37 ° C. pipeta suavemente para mezclar la solución. Bien en una placa de 6 pozos basta transducing con vectores virales Sendai para generar células reprogramadas.
- Aspirar el medio de Prigrow III de las células y poco a poco agregue la mezcla de virus reprograma a los pozos que contienen las células. Incube las células durante la noche en una incubadora de 37 ° C con un ambiente humidificado de 5% CO 2.
- Cuidadosamente deseche la mezcla de virus en las células y reemplazar con medio fresco de Prigrow III al día siguiente, 24 horas después de la transducción de señales. Las células de 5 d de la cultura y cambiar el medio cada día alterno.
- El día 5, preparar MEFs 0.1% gelatina cubierto primero 10 cm cultura platos (1.3 x 10 6 células/plato). Crecer MEFs T175 los matraces hasta el día 4 y luego el día 5, exponer las células a 6.000 rads de una fuente de radiación γ antes de sembrar las células 13 o uso la fuente MEF comercial.
- El día 6, utilizar 1 mL de solución de separación celular por 10 min para separar las células transduced, todos ellos platos de MEF en medio Prigrow III placa con inhibidor de la roca (bolsa de 5 m m, final 10 μm) e incubar durante una noche en una incubadora de 37 ° C con una atmósfera humidificada re de 5% CO 2.
- Cambiar el medio de Prigrow III a hESCs medio al día siguiente. Para hacer 500 mL de medio de hESC, agregar DMEM/F-12, reemplazo de suero de nocaut de 20% (v/v) (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 mM l-glutamina; Los aminoácidos no esenciales de 100 μm y 100 μm 2-Mercaptoetanol. Cambiar el medio suavemente cada día ahora.
- Observar las placas regularmente para la aparición de grupos de células o colonias de células reprogramadas. Las células transformadas forman agregados clonales con morfología de adoquines y gran núcleo y los nucleolos. Marca el probable ' iPSC ' colonias y revisa regularmente para el crecimiento.
- Casi cuatro semanas después de la transducción como colonias están listas para la cosecha o transferencia, preparar placas de 24 pocillos MEF 1.3 placa prelacado de 10 6 células/gelatina de la galjanoplastia como antes para la transferencia de colonias solo.
- Prepare la membrana (e.g., Matrigel) matriz por tomar basado en el factor de dilución en el certificado de análisis. Añadir una alícuota de 25 mL de DMEM/F-12 y capa cuatro 6 placas (1 mL/pocillo) e incube a temperatura ambiente (RT) durante al menos 1 h antes de su uso. Escoger manualmente 12-24 colonias utilizando una pipeta estéril para aspirarlos y transferir a las placas MEF en 500 μl de medio de hESCs.
- Aspire los medios de comunicación en el pozo suavemente alteran o rompen las colonias. También toma 24 a 48 colonias en placas de 24 pocillos matriz recubierta de membrana. Para las placas de membrana recubierta, utilice mTeSR1 (complementado con inhibidor de roca de 10 μm) por 24 h y cambiar todos los días. Dentro de 6-10 d de escoger colonias, está listos para ser transferido a las placas de 24 pocillos o bien 12 membrana nueva para la expansión clonal.
- Si es necesario, separar las colonias en MEFs con colagenasa 1 mg/mL por 20 min, lavado dos veces con células/mTeSR1 y transferencia a membrana de cubierta placas de 12 o 24 pocillos. Si hay suficientes colonias robustas crecimiento en la membrana de la matriz de paso 1.1.12, congelación de las colonias en MEFs con iPSC congelación medios según el fabricante ' pautas de s.
- Separar las colonias robustas sobre la membrana en el paso 1.1.12 con 500 μl del dispase por 20 min y placa otra vez en la membrana de la matriz recubiertos de placas de 12 pocillos. Manualmente raspe cualquier células diferenciadas o contaminantes células de alimentador MEF para enriquecer para clones de pluripotent en la membrana de.
- Ampliar los clones después de 6-8 d por cultivo sobre membrana cubierta placas saldándose con una solución de dispase como antes y agregados de células pequeñas en membrana del fresca de la galjanoplastia había revestida placa de 6 o 12 pocillos. Medio de mTeSR1 de cambio diariamente. Caracterizar los clones reprogramados por tinción, immunostaining para la pluripotencia marcadores (OCT3/4 y NANOG), FACS análisis de marcadores de superficie de pluripotent y ensayos de diferenciación de la fosfatasa alcalina. Crecer y los clones en placas recubiertas de membrana para todos los ensayos incluidos CRISPR edición como se explicó anteriormente, a menos que se mencione otra solución de recubrimiento de la cultura.
- Caracterización de humanos iPSCs
- tinción de fosfatasa alcalina
Nota: aquí se utiliza un kit comercial. Consulte la tabla de materiales.- Placa iPSCs putativo humano en placa de 24 pozos y cultura para 4-5 d con el cambio de los medios de comunicación diario.
- Para iniciar el protocolo de tinción, aspirar el medio de cultivo y lavan las células con 1 mL de PBS 1 x con 0,05% Tween 20 (SAFT).
- Añadir 0,5 mL de solución de arreglo en el kit de las células e incubar a temperatura ambiente durante 2 a 5 min aspirar la solución de fix y lavar las células fijas con SAFT. No permita que los pocillos se sequen.
- Añadir 0,5 mL de solución recién preparada de sustrato AP por bien mezclando la solución A, B y C. Incubar las células en la oscuridad (envuelto con papel de aluminio o en un recipiente oscuro) a temperatura ambiente durante 5 a 15 min
Nota: Cerca supervisar el cambio de color y detener la reacción cuando el color se vuelve brillante para evitar la tinción inespecífica. - Detener la reacción aspirando la solución substrato con AP y lavar los pocillos dos veces con 2 mL de PBS 1 x.
- Observar las colonias al microscopio y capturar las imágenes en 4 X o 10 aumentos con cualquier microscopio de campo brillante con una cámara de.
- Immunostaining
- placa iPSCs humano en placa de 24 pozos y cultura para 4-5 d con el cambio de los medios de comunicación diario.
- Lavar las células una vez brevemente con PBS y revisión por 20 min con paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS.
- Lavado tres veces por 10 min (3 x, 10 min) con PBS a TA.
- Saturar los sitios inespecíficos con 10% cabra o burro de suero normal (NS, dependiendo del anticuerpo secundario animal se crió en) en PBS durante 40 min a TA. Para sólo epítopos intracelulares, incluyen 0.3% TX-100 en PBS (TX/PBS) a permeabilizar.
- Lavar 3 veces, 5 minutos con PBS a TA.
- Diluir los anticuerpos OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 y SOX17 en una solución fresca de 5% NS en PBS e incubar por 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS a TA.
- Diluir apropiado secundaria Alexa Fluor 488 o 568 anticuerpos en 5% NS/PBS e incubar células por 1 h a RT.
- Lavar 3 veces durante 5 min a TA.
- Incubar con DAPI en PBS 10 min y lavado 2 x durante 5 minutos a RT. uso un microscopio de fluorescencia para tomar fotos.
- Activado por fluorescencia de la célula clasificación (FACS)
- placa iPSCs humanas en una placa de 6 pozos y cultura hasta las colonias se convierten en 80% confluente (por lo menos 10 5 células /sample) con cambio medio diario de mTeSR1.
- En el día del experimento, aislar las células y disociar a una suspensión unicelular como se explicó anteriormente en el protocolo. Lavar con medio de 10% FBS.
- De marcadores de superficie, resuspender en 0.5-1 mL de 10% FBS medio y mantener en hielo.
- De marcadores intracelulares, resuspender en 1 mL de 4% PFA/PBS e incubar 10 min a temperatura ambiente. Lavar con medio de 10% FBS. Resuspender en 0.1% TX/PBS e incubar por 15 min en hielo. Lavar nuevamente con medio de 10% FBS. Resuspender en 0.5-1 mL de 10% FBS medio y mantener en hielo.
- Añadir 50 μl de la suspensión celular en 50 μl de medio conteniendo de 10% FBS recomendado cantidad de TRA-1-60, TRA-1-81 o SSEA-4 anticuerpos e incubar por 30 min a 1 h.
- Lavar dos veces con 10% FBS.
- Resuspender en 100 μl de 10% medio FBS que contiene anticuerpos secundarios fluorescentes e incubar durante 30 min lavado dos veces con 10% FBS y resuspender en volumen apropiado del 10% FBS. Las células vivas se pueden distinguir de las células muertas por tinte de yoduro de propidio en < 1 μg/mL para estimar la apoptosis de las células durante el proceso de.
- Tri-linaje diferenciación
- de semilla de dos placas de 6 pocillos con 1.5-2 x 10 6 iPSCs/pozo en medio de mTeSR1 con inhibidor de roca de 10 μm.
- Permite a las células a crecer de 2-3 d con diario mTeSR1 cambio medio hasta que los pozos son 80-90% confluente.
- Para la inducción de ectodermo, añadir medio de inducción neural (NIM) según el fabricante ' instrucciones en 2-3 pocillos de las placas de 6 pozos.
- Cambiar el Medio RPMI conteniendo 2% B27 suplemento menos insulina y 12 μm CHIR99021 para la inducción del mesodermo en 2-3 pozos de placas 14. Agregar solamente RPMI conteniendo 2% B27 suplemento menos insulina para el próximo 24 h. Añadir 5 μm IWP4 al Medio RPMI con un 2% B27 suplemento menos insulina para las próximas 24 horas. Después de 72 h, sustituir los medios de comunicación con RPMI conteniendo 2% B27 suplemento conduce a la generación de vencer a cardiomiocitos en 2-3 d.
- Para la inducción del endodermo, cambiar el medio en los pocillos de las placas de 6 pozos para MCDB 131 complementado con bicarbonato de sodio 1,5 g/L, 1 x Glutamax glucosa 10 mM, 0,5% BSA, 100 ng/mL GDF8 y 5μm de CHIR99021 de cultura en el mismo medio sin CHIR99021 de 24 h. para 2-3 d 15.
- Seguir el protocolo de immunostaining del paso 2 para los tres linajes y busque la expresión de marcadores relevantes.
- tinción de fosfatasa alcalina
2. IPSC edición de humano genoma usando CRISPR-Cas9
- sgRNA y preparación de Cas9 proteína
- proteína Cas9 alícuotas en tubos de microcentrífuga en condiciones estériles y almacenar las alícuotas por congelamiento de los tubos a -80 ° C.
- Diseño dos objetivo guía RNAs por gene basadas en el software del MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) o cualquier webtool de diseño otros guía CRISPR. Objetivo primer o segundo exón del gene (basado en el marco de lectura abierto) para generar agujeros ciegos. Elegir los dos guías que cortaron juntas (~ 30-100 bp aparte) y fácilmente podemos visualizar la eliminación mediante el mismo conjunto de iniciadores de detección. Elegir a las guías de la salida del software sobre la base de puntuación de mayor calidad y menor número de sitios objetivo. Diseño de cartillas de proyección mediante la explosión de la cartilla del programa (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Cartillas de detección debe ser al menos 100 bp de la Cas9 corta páginas y el tamaño del producto PCR debe ser preferiblemente entre 400-700 bp para más fácil amplificación por PCR.
- Diseño el oligo sgRNA complementaria dos DNAs (19-22 nucleótidos de longitud dependiendo de la secuencia de la guía) con un Bsa1 cortar sitio en cada extremo. El oligo DNAs puede ser sintetizada comercialmente y recocido para formar DNA de doble cadena. Para recocido, añadir 1 μl de 100 μm guías, 25 μl de buffer (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) de recocido y 23 μl de agua. Incubar en un termociclador programado para iniciar a 95 ° C durante 2 minutos y luego gradualmente de refrigeración a 25 ° C durante 45 min
- Clon 2 μl del fragmento resultante en una enzima de restricción Bsa1 digerido 1 μl de vector de pCR2.1 de promotor de T7 interno con un sitio de unión de Cas9 con T4 ADN ligasa según el fabricante ' Protocolo s.
- La secuencia de los fragmentos de ADN clonados y cuando se establezca la fidelidad, en vitro transcribir los clones usando un kit de T7 para generar solo guía RNAs. Purificar el sgRNAs con un kit comercial y eluir en agua libre de ARNasa. Compruebe la concentración de RNA.
- Transfección de hiPSCs
- hiPSCs en medio mTeSR1 de la cultura como se describe anteriormente hasta que las células son confluentes de 40-50%.
- Dos horas antes nucleofection, sustituir el medio con 2 mL de medio de mTeSR1 precalentado con inhibidor de roca de 10 μm.
- Una hora más tarde, preparar pozos de destino para las células nucleofected por membrana aspiración, preparado como el anterior, de placa de 12 pozos y sustitución con precalentado 1 mL de medio de mTeSR1 con inhibidor de roca de 10 μm. Mantenga a 37 ° C para la incubación de. Suplemento de
- Prepare nucleofection master mix (escala apropiadamente según las muestras) para cada muestra por adición 16.4 μL de P3 primaria celular; 3.6 μl de 1 suplemento del kit de nucleofector, 0.5 μg de proteína Cas9 y 0,5 μg de cada sgRNA en 22 μL volumen de reacción. vector de pMAX GFP también fue nucleofected según el fabricante ' recomendaciones de s en las células más o menos estimar la eficiencia de la transfección iPSC.
- Lave cada uno con 2 mL de PBS de RT después de aspirar el medio que contiene el inhibidor de la roca de los pozos de iPSC. Luego aspirar PBS, añadir 1 mL de solución de separación celular e incubar la placa a 37 ° C durante 10 minutos
- Resuspender las células en 3 mL de medio de mTeSR1 y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para generar una suspensión unicelular. Células de transferencia disociada a una centrífuga de 15 mL del tubo que contiene medio de mTeSR1 de 5 mL.
- Contar las células con el contador de célula y calcular el volumen total requerido de 0.5 x 10 6 células/transfección. Coloque la cantidad deseada de las células en el tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugar a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar sobrenadante.
- Resuspender cada unidad de 0.5 x 10 6 células en 22 μL de la mezcla principal de transfección preparada en el paso 4. Transferir rápidamente las células en la cámara central de un pozo de una tira de nucleocuvette. Coloque la tira en un nucleofector necesario y nucleofect las células mediante programa CB150.
- Después nucleofection, agregar rápidamente 80 μl de medio mTESR1 precalentado con inhibidor de roca de 10 μm en cada pocillo de las células nucleofected. Suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
- Transferir suavemente las células de la tira a los pocillos de la placa de 12 pozos prelacado membrana, que contiene medio de mTeSR1 con inhibidor de la roca preparada en el paso 3.
- Después de 1 d, cambie a medio fresco mTeSR1 sin inhibidor de la roca. Cosecha de células 2-3 d después nucleofection sola célula clasificación.
- Sola celda aislamiento de hiPSCs específicos
- un día antes de la clasificación, preparación de placas de 96 pocillos MEF por la siembra de 2 x 10 6 células/gelatina-placas cubiertas de en medio de 10% FBS. Aproximadamente el 70-80% de los clones sobrevivir después nucleofection y 2-3 placas MEF se pueden preparar para cada experimento edición.
- Después de la incubación durante la noche, cambiar el medio a medio de hESCs (como se describe anteriormente) suplementado con 100 ng /bFGF mL, 1 x SMC4 (inhibidores de añadido a los medios de comunicación para mejorar la viabilidad de la célula) y 5 mg/mL fibronectina para promover adherencia.
- Reemplazar el medio en el hiPSCs en la placa de la pozo 12 de mTeSR1 a mTeSR1 suplementado con 1 x SMC4 durante al menos 2 h antes de la única célula clasificación.
- Aspirar el medio de hiPSCs y lavar las células con PBS. Añadir 500 μl de solución de la separación de células en cada pozo e incubar a 37 ° C durante 10 min después de la aspiración del PBS. Generar la suspensión unicelular agregando 1 mL de mTeSR1 (sin suplemento) a cada pocillo y pipeteo arriba y abajo suavemente varias veces.
- Suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 200 x g a RT. aspirar sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de mTeSR1.
- Clasificar las células en las células usando un clasificador de células con boquilla de 100 mm en condiciones estériles con una celda en el pozo individual de las placas de 96 pocillos preparadas en el paso 1.
- Cuatro días después de su clasificación, formación de la Colonia debe ser evidente; reemplazar en este momento el medio de cultivo con hESC suplementado con 1 x SMC4.
- Ocho días después de su clasificación, sustituir medio con células medio y cultura 2 d.
- Separar las colonias mediante colagenasa 1 mg/mL por 20 min y transfiere a placas de 24 pocillos membrana revestida en mTeSR1 con inhibidor de la roca. Que los clones de unicelulares crecen y extraer su ADN genómico después de duplicar o expandirlos. Uso de iniciadores específicos gene para amplificar el ADN mediante PCR Diana.
- Kit de analizador de fragmento de uso para la detección inicial de la región genómica de PCR amplificado destino de todos los clones mediante la ejecución a través del gel/tinte mezcla según el fabricante ' instrucciones. Estimar el tamaño de fragmento resultante en el software PROSize comparando con la escala apropiada, que se ejecuta con las muestras. De secuencia esperado ' editado ' clones y analizar datos de secuenciación para confirmar la edición o canceladuras.
- Para diferenciar clones monoallelic y biallelic, amplificar la secuencia editada con PCR y clonado en el vector de pJET1.2. Enviar por lo menos 8-10 clones para secuenciación y comprobamos si la secuencia para confirmar la edición en uno o ambos alelos.
- Una vez se han identificado clones de iPSC con éxito dirigidas mediante genotipificación, examinar para confirmar que no han perdido la pluripotencia o ganado anormalidades cromosómicas a través del proceso.
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Representative Results
En esta publicación, hemos seguido un protocolo simple pero eficiente para la generación de iPSC de células pancreáticas humanas mediante integración o vectores de virus Sendai huella libre. Figura 1A se muestra una representación esquemática de este protocolo de reprogramación. Las células pancreáticas humanas fueron compradas comercialmente, cultivados en medio de Prigrow III y transduced con virus Sendai como se explicó anteriormente. Transduced huso en forma de células pancreáticas no mostraron cambios morfológicos por ~ 5 días después de la transducción de señales de virus Sendai en el día 0, pero luego es redondeado con nucleolos y el núcleo más grande. Algunas colonias tempranas fueron vistos después de una semana después de transducción pero no fueron seleccionados, como en nuestra experiencia, estas colonias se disocian rápidamente y suelen ser las 'células reprogramadas parcialmente tempranas' que no establecen colonias robustas. Aproximadamente 10-15 días post-transducción de señales, pequeñas colonias brillantes observaron y fueron detenidas después de crecimiento (figura 1B, parte superior derecha). Colonias de iPSC humanas son compactas, firmemente embalado con bordes claros (considerados como 'células totalmente reprogramadas') (figura 1B, dia 23 inferior en medio) y 'células reprogramadas parcialmente' son sueltas con boquetes en la Colonia (figura 1B, día 23 abajo a la derecha). Las colonias de células pancreáticas reprogramadas fueron creciendo el día 18 (figura 1Bparte inferior izquierda) y eran lo suficientemente grandes para ser seleccionado manualmente por día 23 (figura 1B, mitad inferior). Las colonias fueron plateadas sobre placas de cubierta de membrana después de cosecha para obtener iPSC de alimentador-libre por día 30-40 (a la izquierdafigura 2A, ). Algunas de estas colonias libres de alimentador 'robustas' se ampliaron y se caracteriza por la expresión de fosfatasa alcalina, pluripotencia y marcadores de superficie en condiciones libres de alimentador. Todos los clones probados eran positivos para fosfatasa alcalina como que dio vuelta a rojo brillante después del ensayo (figura 2A, a la derecha). Los marcadores de pluripotencia OCT4 y NANOG, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 también fueron observados para ser expresado altamente en todos los clones por inmunotinción o análisis FACS (figura 2B y Figura 3A).
Estos resultados demuestran que las colonias de humanos iPSC generadas a partir de las células pancreáticas expresaran marcadores de pluripotencia en condiciones libres de alimentador. La pluripotencia también evaluaron la diferenciación dirigida de iPSC humana a tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo. Clones en membrana diferenciado potentemente las neuronas TUJ1 positivas (ectodermo), NKX2-5-positive paliza cardiomiocitos (mesodermo) y las células endodermales SOX17-positivas (figura 3B).
Después de cuidadosa caracterización, líneas clonales iPSC 3-robusto, libre de alimentador fueron elegidas para la edición estudios de genómica. Las dos guías con BsaI sitios de corte en los extremos se diseñaron para que cada gen cortar juntas (es decir, n menos de ~ 100 bp). El esquema del Protocolo se muestra en la figura 4. Esta estrategia de eliminación utilizado para los genes de la blanco nos permitidos fácilmente eliminar una porción del primer o segundo exón de un gene. Esta estrategia fue muy eficiente y podríamos aislar clones editados en cada intento. Las guías se clonaron en vectores BsaI digerido y en vitro transcritos como se describió anteriormente. Nos guías nucleofected (ARN) y proteína Cas9 como complejos de la RNP para edición rápida y eficaz. También nos ordena las células como las células en MEFs como recuperación de las células es mayor en comparación con las células que se ordenan individualmente en placas recubiertas de membrana. La DNA de Genomic fue aislada de todos los clones, la porción de destino fue amplificada por la polimerización en cadena y resuelto en analizador de fragmento para detectar cambios en los tamaños de los fragmentos del destino en comparación con los controles. El tamaño del fragmento se comparó con la escala con las muestras para detectar clones 'editados' (abajo a lafigura 4, ). Esto facilita detección de clones como pudimos pasamos por > 90 clones en una placa y los resultados se obtuvieron con la precisión de ± 3 bp. Los clones seleccionados fueron luego ordenados para confirmar clones de tipo salvaje y mutadas. Clones de tipo salvaje no tenían ninguna supresión o adición de bases mientras que clones mutados o adición o deleción en la secuencia en comparación con el tipo salvaje. Los clones mostrando eliminación o adición de la secuencia fueron pJET1.2 ampliado y clonados en vectores para identificar clones monoallelic y biallelic por la secuencia de por lo menos 8-10 colonias por clonación. Monoallelic clones tenían bases borradas o agregar en un alelo y el otro era similar al alelo de tipo salvaje y sin modificaciones. Biallelic clones tenían deleciones en los alelos de ambos. Aproximadamente 300 clones fueron defendidos de los genes diana, que identificaron aproximadamente 9 clones de canceladura monoallelic y 3 clones de eliminación de biallelic en cada caso. Aproximadamente corresponde a una 3-fold reducción en la frecuencia de generación de clones de biallelic en comparación con monoallelic clones. Heterogeneidad dentro de los amplicones de eliminación refleja reparación NHEJ imperfecto e inconsistente. La expresión del gene finalmente fue confirmada por la extracción de RNA de las células diana y mediante la realización de RT-PCR.
Figura 1: reprogramación de las células pancreáticas humanas a células pluripotentes libre de alimentador (iPSC). Se muestra (A) A mismo protocolo para la generación de iPSC de células pancreáticas humanas. Las células pancreáticas fueron cultivadas en placas recubiertas de colágeno y después transferidas a MEFs después de transducción con vectores del virus humano de Sendai. Las colonias completamente reprogramado luego transferidas a la membrana de células calificadas y caracterizadas. Morfológicas (B) cambia después de transducción de señales de virus Sendai. Antes de la transducción de señales, células pancreáticas muestran morfología típica del huso-como (parte superior izquierda, día 0). Colonias pequeñas, apretadas en MEFs aparecen por día 12, que se asemeja a las colonias de células pluripotentes humanas. Normalmente las colonias totalmente reprogramadas iPSC humana tienen límites muy claros y pueden ser recogidas por el día 23-30. Una colonia disociada en el día 23 se muestra en la parte inferior derecha. Todas las imágenes fueron captadas con 100 aumentos (objetivo de 10 X y ocular de 10 X). Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: caracterización de iPSC humana. (A) A imagen de contraste de fase típico de una colonia de iPSC después de cosecha y de la cultura en condiciones libres de alimentación (40 X, objetivo de 4 X y ocular de 10 X; izquierda) después de virus Sendai la reprogramación de las células pancreáticas. Fosfatasa alcalina manchada rojo iPSC Colonia está a la derecha. Para tinción de fosfatasa alcalina, las colonias de iPSC se fijaron y mancharon rojo después de la adición de solución de sustrato del kit. Las imágenes fueron capturadas a 40 X. (B) Immunostaining para marcadores de pluripotencia NANOG y OCT3/4 humano libre de alimentador iPSCs pancreático mástil-célula-derivados. DAPI se utilizó para teñir el núcleo azul como un control. Todas las imágenes fueron tomadas a 100 aumentos. Barra de escala = 100 μm en todas las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: caracterización de la pluripotencia y diferenciación potencial de iPSC. (A) FACS análisis de marcadores de superficie SSEA4 y TRA-1-60, TRA-1-81 en iPSCs alimentador-libre. Las células fueron disociadas a suspensión unicelular y manchadas de marcadores de superficie SSEA-4, TRA-1-60 y TRA-1-81. El pico morado contiene células negativas (control del anticuerpo) de iPSC y iPSC pancreático se puede visualizar como el pico verde. (B) la proyección de imagen inmunofluorescente de genes marcadores de capa del germen. La expresión de marcadores TUJ1 ectodermo (verde), mesoderm NKX2-5 (rojo) y SOX17 endodermo (rojo) en las células tras la diferenciación dirigida de iPSC pancreático. Correspondiente control nuclear DAPI es azul. Todas las imágenes fueron tomadas a 100 aumentos. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: esquema de la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9. Un par de sgRNA fue diseñada (marcada en rojo) con BsaI sitios de corte en el extremo (mostrado como F y R) preferentemente dirigida al primer exón, recocidos, reproducido en BsaI digerido modificado vector (pCR2.1, BsaI sitio destacado gris), secuenciado y en vitro . La secuencia subrayada del vector muestra el fragmento eliminado después de la digestión BsaI. La posición de proyección cartillas está indicada en azul. Cas9 y guía RNAs fueron nucleofected en iPSC alimentador-libre como un complejo para deleciones genómicas. iPSCs entonces fueron unicelular clasificado en placas de 96 pocillos MEF, cultivadas, transferido a la membrana, ampliado y defendido por el analizador de fragmento. Para correr las muestras en el analizador, DNAs genomic de Cas9 y clones de guía transfectada en membrana extrajo y pasó a través de la mezcla de gel/tinte en el analizador para seleccionar posibles clones 'editados' (mitad inferior). Los marcadores de escala pertinente, WT y posibles clones editados están marcados. La expresión del gene fue confirmada por la extracción de RNA y analizando con Q-PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Reprogramación de células somáticas humanas iPSCs ha proporcionado un gran impulso a los campos de investigación de la biología básica, medicina personalizada, enfermedades modelado, desarrollo de medicamentos y medicina regenerativa16. Muchos métodos actuales y ampliamente utilizados de generación de iPSC humano requieren el uso de virus con el riesgo de la integración en el genoma del anfitrión o episomal vectores con baja eficiencia de reprogramación. Aquí, presentamos un método eficiente para la generación de iPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas con virus de Sendai, que conduce a 'espacio libre' y reprogramación eficaz. El iPSCs humanos resultantes están libres de los transgenes virales, mantener la pluripotencialidad y evitar el uso de factores exógenos desconocidos. La generación de iPSCs en condiciones libres de alimentador tiene baja eficiencia de reprogramación, por lo que reprogramaron las células pancreáticas primarias en las células de alimentador y luego se trasladó a las colonias a membrana libres de alimentador de extensión, cultura y caracterización. La fusión de estas técnicas proporciona estable, confiable y más eficiente programación de iPSC.
También generamos iPSCs de fibroblastos humanos y otras células primarias con este método, lo que sugiere que virus de Sendai puede usarse para reprogramar gran variedad de células. Consideraciones son importantes: una necesidad de confluencia óptima de células primarias a introducirse como muy pocos o demasiados impactos células reprogramación eficiencia; un paso anterior de células primarias cuando las células están dividiendo aún óptimo; Valoración cuidadosa de la viral vectores que resulta en la apoptosis de la célula mínima y una alta eficiencia a fácil recogida de colonias robustas; verificación de la pérdida de Sendai vector transgene expresión por PCR en 10-15 pasos para asegurar que las iPSCs 'espacio libre'; y estrictas condiciones estériles para cultivo de iPSC en la membrana.
Utilizamos un método cómodo y eficaz de la modificación del genoma CRISPR para modificar el genoma de iPSC. Esta técnica combina proteína Cas9 y sgRNA, RNP complejos para reconocer y unirse las secuencias de ADN complementarias. Puede ser fácilmente adaptada a una secuencia genómica de destino simplemente cambiando la guía de bp 20 RNA. Nuestro método proporciona un protocolo fácil de eficiente y reproducible edición de iPSCs humana ya que son más intensivas, difícil de transducir y caro de mantener que otras células. Diseñamos a al menos dos guías adyacentes pero no superpuestos para cada gene de la blanco para que un único conjunto de cartillas de evaluación puede utilizarse para la detección de los clones editados. Además, el uso de dos guías ~ 30-100 bp aparte genera una canceladura grande, que puede ser fácilmente visualizada durante la investigación preliminar y asegura el agotamiento de la proteína. Las guías se pueden probar en células HEK-293 inicialmente estimar eficiencias antes de iniciar el ensayo en iPSC. Además, es fundamental establecer parámetros para la rutina de la transfección reactivos en iPSC. Utilizando el plásmido pMAXGFP, eficacias de transfección de > 80% y eficiencias de gene targeting/interrupción de 3-10% en iPSCs se alcanzan rutinariamente. La entrega directa de complejos de Cas9 RNP en las células en nuestro protocolo proporciona rápida acción y rápida facturación y mantiene altas tasas de modificación específica. Nuestro enfoque emplea sola célula clasificación tras nucleofection de guías y Cas9 proteína, superando un obstáculo importante de gene targeting en población de iPSC mixta y asegurando el clonality de las células. Este 'nuevo' enfoque general es sencillo, fácil de conectar, tarda sólo unas pocas semanas y no requiere cualquier selección antibiótica. No observamos ninguna pérdida en la eficiencia introduciendo secuencialmente eliminaciones por CRISPRs en una línea celular o iPSCs, aunque las necesidades de análisis a realizar en tales casos a garantizar la estabilidad genómica del karyotype. Los clones deben revisarse también la expresión de marcadores de pluripotencia. Aunque no un enfoque de esta publicación, este protocolo puede ser cooptado para inducir la modificación genética exacta incluyendo la plantilla de reparación en la transfección cóctel17,18.
Por último, basándonos en nuestra experiencia, son consideraciones importantes para iPSC edición protocolo: diseño racional de guías para minimizar o evitar en conjunto de mutaciones de destino especialmente en la región de"semilla" o cerca de adorno PAM ser modificado; optimizar la eficiencia nucleofection en iPSCs para garantizar entrega de RNPs; verificación de la calidad de guías preparados; titulación de guía y las concentraciones de proteína Cas9 y validar su actividad por clivaje bioquímicos in vitro ensayos o como se describe en este artículo en cellssuch humano como HEK células son más fáciles de la cultura y transfectar; el uso de principios iPSCs de paso que se encuentran en fase logarítmica de crecimiento y llegar a la confluencia de ~ 50%; el tratamiento cuidadoso de las células con medio suave cambia siguiendo la clasificación de célula para asegurar la supervivencia de las células.
Creemos que el anterior protocolo delineado delineado en suficiente detalle equipa a los lectores con una hoja de ruta para la generación y edición de iPSC de manera reproducible.
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Disclosures
BT es un miembro fundador de renovar Biosciences Inc.
Acknowledgments
Trabajo en el laboratorio fue apoyado por beca de postdoctorado para Dr. Anjali Nandal y concesión exploración del fondo de investigación de la célula de vástago de Maryland a BT (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
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