Summary
أهداب التنمية أمر حيوي ل organogenesis السليم. ويصف هذا البروتوكول أسلوب أمثل التسمية ووضع تصور لخلايا عضو من الزرد.
Abstract
وفي السنوات الأخيرة، برز الجنين الزرد كنموذج شعبية لدراسة علم الأحياء التنموي بسبب الصفات مثل تطوير الأجنة خارج الرحم والشفافية الضوئية. على وجه الخصوص، أصبح الجنين الزرد كائن هامة لدراسة organogenesis الكلي الفقارية، فضلا عن تطوير الخلية مولتيسيلياتيد (MCC). تصور MCCs في الكلي الجنينية الزرد، وضعت بروتوكولا مجتمعة من الجامعة-جبل الفلورسنت في الموقع التهجين (الأسماك)، وجبل كاملة الفلورة (إذا كان) التي تمكن من التصوير بدقة عالية. ويصف هذه المخطوطة لدينا للمشترك ترجمة النصوص الرنا والبروتين كأداة فهم أفضل لتنظيم البرامج الإنمائية من خلال التعبير عن مختلف النسب عوامل التقنية.
Introduction
على مدى العقود العديدة الماضية، برز الزرد (دانيو rerio) ككائن نموذج رئيس الوزراء لدراسة علم الأحياء التنموي. وضع خارج الأم الأجنة وهي شفافة بصريا. أيضا، يحدث تشكيل الأجهزة الحيوية في الجسم مثل العين والكلى، وفوريبراين بسرعة، مع هياكل تشكلت قبل 24 ساعة فقط بعد الإخصاب (hpf). الأهم من ذلك، هو الغاية حفظت الجينوم الزرد مع الثدييات1،،من23. بالإضافة إلى ذلك، قد الزرد والثدييات أجهزة مماثلة من التشريح وعلم وظائف الأعضاء. الكلي الجنينية الزرد، أو برونيفروس، يوضح قيمة النظام النموذجي لفحص وظيفة الجينات أثناء نيفروجينيسيس المبكر وتحديد مصير السكان الخلايا الظهارية المصانة كليون الفقارية4، 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10-وبالمثل، أصبح الجنين الزرد متزايد الأهمية في دراسة أونتوجيني MCCs11،،من1213،14،15، 16 , 17.
وكما يوحي اسمها، هي MCCs الخلايا الظهارية التي تتميز بحزمة من أهداب متحركة الموجود على سطح قمي17. في الزرد، MCCs تعمل في تدفق السوائل، ومشتتة في "سالتاندبيبير" مثل الأزياء في جميع أنحاء منتصف كل نفرون من برونيفروس واسطة 24 هبف11،،من1213،14، 15 , 16 , 17-على الرغم من أنهم يلاحظ إلا في حفنة حالات مرض الكلي البشرية18،19،،من2021، وتنتشر مراكز مراقبة الرحلات في أنسجة الثدييات الأخرى مثل المخ و القصبة الهوائية22،،من2324، الذي يطرح مجموعة من التحديات للتصميم التجريبي. وقد أثبتت الدراسات أنيقة في مختلف النماذج الفقاريات، بما في ذلك الزرد طريقا مصانة من مصير لجنة التنسيق الإداري، مع الشق مما يشير إلى المسار كمثبط لجنة التنسيق الإداري التنمية12،17،25 ،،من2627. ولذلك، يوفر برونيفروس الزرد نموذج الوصول إليها بسهولة دراسة الآليات الوراثية من لجنة التنسيق الإداري التنمية في فيفو11،،من1213،14، 15 , 16 , 17.
الشفافية وسهولة التلاعب الجيني للأجنة الزرد أثبتت أن الصفات لا تقدر بثمن عند دراسة المسارات الجينية والجزيئية التي تنظم مصير الخلية والأنسجة النمو والتنمية وقت مبكر الجنين1،2 ،3. كهذه، التقنيات التقليدية تصور النصوص البروتينات والجينات، مثل التهجين في الموقع ، وإذا كان جبل كله، وتم تطبيقها على والأمثل لالزرد16،،من2829، 30،31،32،،من3334،35،36،،من3738. عن طريق الجمع بين البروتوكولات شعبية للأسماك، وإذا كان، فمن الممكن وصف وتحليل MCCs في فيفو16،28،،من3738.
Protocol
يستخدم البروتوكول التالي الكبار الزرد المحافظة والرعاية من قبل المركز بحوث الزرد في جامعة نوتردام. وافق جميع أساليب للعمل مع الكبار الزرد والأجنة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.
1-الجنين التثبيت
- جمع الزرد الأجنة باستخدام الأساليب المذكورة سابقا39،40. في 24 هبف، إضافة 500 ميليلتر حل خليط حوزتي غير محددة (50 ملغم/مل) إلى E3 في جنين طبق إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة (RT).
- حالما تبدأ الأجنة الخروج للمشيمة، إزالة جميع السائل من الطبق الجنين.
- تغسل الأجنة 2-3 مرات مع E3 جديدة بإضافة ما يقرب من 20 مل E3 ويحوم في E3 برفق في الطبق ثم الصب السائل في وعاء نفايات سائلة.
- ل euthanize الأجنة قبل إصلاح، إضافة 2 مل تريكايني 0.2% إلى E3.
- نقل الأجنة في قنينة زجاجية 5 مل باستخدام بلاستيك ماصة باستور. إزالة أكثر من تريكايني/E3 الحل باستخدام ماصة بعد أن استقروا الأجنة إلى أسفل القنينة.
- إصلاح 24 هبف الأجنة مع 5 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA) ح 2-4 في الرايت، دون إثارة الشغب.
تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة وينبغي التعامل مع حلول منهاج العمل تحت غطاء كيميائية بينما يرتدي الباحث حماية العين، والقفازات، ومعطف معمل. ينبغي أن يجري إعداد مثبت PFA من حبيبات المسحوق منهاج عمل بيجين بعناية استثنائية، كمنهاج عمل بيجين حبيبات تميل إلى تفريق من خلال رسوم ثابتة.
ملاحظة: يمكن إصلاح الأجنة في 4% بين عشية وضحاها منهاج عمل بيجين في 4 درجات مئوية. إعداد 4% منهاج عمل بيجين بتدفئة 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) يغلي مع التحريك باستمرار الحل حل تماما حبيبات منهاج عمل بيجين. مرة واحدة قد بردت الحل مرة أخرى وصولاً إلى RT، 4% منهاج عمل بيجين تصفية تعقيم بتمرير ذلك من خلال نظام 0.45 ميكرومتر المتاح للترشيح، وفراغ ثم والكوتيد إلى أجزاء 15 مل أو 50 مل للتخزين في-20 درجة مئوية. - إزالة 4% منهاج عمل بيجين والأجنة يغسل مرتين مع 1 X الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.1% 20 توين (ببست) في الرايت تغسل الأجنة مرة واحدة مع 5 مل من 100 ٪ الميثانول (ميوه) في الرايت إضافة 5 مل من جديد 100% ميوه للأجنة واحتضان في-20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة في 100% ميوه في-20 درجة مئوية حتى جاهزة لإعداد الجنين.
2-الجنين إعداد والتهجين
- ترطيب الأجنة قبل الغسيل مرة واحدة في 5 مل من 50% ميوه في 1 x PBST لمدة 5 دقائق في متابعة الرايت الإماهة بالغسيل الأجنة في 5 مل من 30% ميوه في 1 x PBST لمدة 5 دقائق في الرايت تغسل الأجنة في 5 مل 1 x PBST مرتين لمدة كل 5 دقائق في الرايت
- بيرميبيليزي الأجنة التي تفرخ لهم في 5 مل حل بروتيناز 1:1,000 ك (pK) (10 مغ/مل) في 1 x PBST لمدة 2 دقيقة في الرايت
ملاحظة: يمكن المحتضنة الأجنة الأكبر سنا أطول مما توحي 2 دقيقة في تركيز pK المذكورة أعلاه، ولكن بتركيز 5 ملغ/مل وحضانة الوقت أقل من 2 دقيقة للأجنة الذين تقل أعمارهم عن 24 هبف. - إزالة الحل pK ويغسل فورا في 5 مل من 1 x ببست مرتين في الرايت إصلاح الأجنة في 5 مل 4% منهاج عمل بيجين في RT لمدة 20 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: يمكن إصلاح الأجنة في 4% بين عشية وضحاها منهاج عمل بيجين في 4 درجات مئوية. - إزالة منهاج عمل بيجين ويغسل مرتين في 5 مل 1 x PBST في الرايت
- نقل الأجنة في 5 مل 1 x PBST في أنابيب ميكروسينتريفوجي مسطحة القاع توضع تستقيم في رف ميكروسينتريفوجي على RT لتيسير التفاعل بين كل الأجنة والحل التهجين اللاحقة.
- تغسل الأجنة مرتين في 1.5 مل من محلول التهجين (هيب +) في الرايت إضافة 1.5 مل الطازجة هيب + واحتضان الأجنة عند 70 درجة مئوية في فرن تهجين ح 4-6.
- استبدال مل 1.5 من هيب + بحجم الحل مسبار (10 ميليلتر الحمض النووي الريبي المسبار/500 ميليلتر هيب +) كافية لتغطية كامل الأجنة.
ملاحظة: توليف antisense مسبار الحمض النووي الريبي سابقا باستخدام وصف أساليب39. - هجن التحقيق بين عشية وضحاها في الفرن التهجين عند 70 درجة مئوية مع تستقيم أنابيب فردية المتمركزة في الرف ميكروسينتريفوجي، دون أن تهتز.
3-الساخن يغسل وعرقلة
ملاحظة: يغسل الساخنة وتقوم بوضع الحل المناسب على الأجنة وتفرخ ثم في الفرن التهجين عند 70 درجة مئوية. لإبقاء الحلول الغسيل عند 70 درجة مئوية، بوضع أنابيب 50 مل لكل حل في الفرن التهجين عند التحقيق هو يضاف هيب + الخليط.
- إزالة المسبار. تغسل الأجنة مرتين عند 70 درجة مئوية في 1.5 مل من 50% ميثلامين/2 x العازلة سترات الصوديوم المالحة (SSC) لمدة 20-30 دقيقة.
ملاحظة: يمكن تخزين في هيب + في-20 درجة مئوية التحقيق وإعادة استخدامها في وقت لاحق. - تغسل الأجنة مرة واحدة عند 70 درجة مئوية في 1.5 مل 2 x SSC على 15 دقيقة تغسل الأجنة مرتين عند 70 درجة مئوية في 1.5 مل ال SSC X 0.2 لكل 20-30 دقيقة. X SSC استبدال 0.2 مع 1.5 مل كاشف حظر، وتبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: من الممكن لاحتضان كاشف حظر على RT ح 4 بدلاً من بين عشية وضحاها.
4-جسم الاحتضان ويغسل المخزن المؤقت حمض الماليك
ملاحظة: الاحتفاظ بالأجنة محمية من الضوء المحيط.
- استبدال الكاشف حظر 0.2 مل من مكافحة ديج جراب في كاشف الحظر بنسبة 1:1,000 واحتضانها ح 3 تحت إحباط أو غطاء آخر حجب الضوء في الرايت
ملاحظة: بدلاً من ذلك، الجسم يمكن احتضانها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. - بعد ح 3، تغسل الأجنة في 1.5 مل من حمض الماليك المخزن المؤقت 2-4 مرات ل 10-15 دقيقة كل في الرايت إينكوباتي الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 1.5 مل من حمض الماليك الطازجة المخزن المؤقت.
ملاحظة: ليس الضرورية لاحتضان في المخزن المؤقت لحمض الماليك بين عشية وضحاها، ولكن القيام بذلك يقلل خلفية التحقيق.
5-التحقيق في اكتشاف وإزالة البيروكسيديز
ملاحظة: الاحتفاظ بالأجنة محمية من الضوء المحيط.
- إزالة المخزن المؤقت لحمض الماليك واستبدال مع 1.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. تغسل الأجنة مرتين في 1.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل في الأجنة الرايت إينكوباتي 0.2 مل من Cy3 نيون تلطيخ الحل لمدة 60 دقيقة في الرايت
ملاحظة: قد تختلف وقت الحضانة لتحقيقات مختلفة. - تغسل الأجنة مرة واحدة مع 1.5 مل ميوه النسبة المئوية التالية في برنامج تلفزيوني X 1 لمدة 10 دقائق في RT: 30% ميوه، 50% ميوه، 75% ميوه و 100% ميوه.
- تبني الأجنة مع 1.5 مل من 1 ٪ ح2س2 في ميوه لمدة 30 دقيقة في غسل الرايت الأجنة مرة واحدة مع 1.5 مل الحلول ميوه التالية في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 10 دقائق في الرايت: 75% ميوه، 50% ميوه، و 30% ميوه. تغسل الأجنة مرتين لمدة 5 دقائق في كل في RT 1.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: الأجنة يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
6-الفلورة
ملاحظة: الاحتفاظ بالأجنة محمية من الضوء المحيط.
- تغسل الأجنة في 1.5 مل من ddH2س لمدة 5 دقائق في غسل الرايت الأجنة في 1.5 مل الأسيتون مبردة مسبقاً (أبقى في-20 درجة مئوية) ليغسل 7 دقيقة في الرايت الأجنة مرة في 1.5 مل من ddH2س لمدة 5 دقائق في غسل الرايت الأجنة مرة في 1.5 مل 1 x PBST مع [دمس] 1% (ببدت) لمدة 5 دقائق في الرايت
- تبني الأجنة في 1.5 مل ببدت + 10% مصل بقرى الجنين (FBS) على الروك في RT ح 2.
- إزالة ببدت + FBS واستبدال مع 1.5 مل من الأجسام المضادة الأولية، توبولين أسيتيلاتيد المضادة (المنتجة من الماوس) ومكافحة-γ-tubulin (المنتجة من الأرانب)، تضعف معا في 1: 400 في ببدت + 1% FBS. تبني الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: قد تختلف أوقات الاحتضان اعتماداً على جسم الأولية. اختبار لفترات زمنية مختلفة قد تكون ضرورية لتحسين وضع العلامات.
7-الثانوية جسم
ملاحظة: الاحتفاظ بالأجنة محمية من الضوء المحيط.
- لإزالة الأجسام المضادة غير منضم الزائدة من الأجنة، يغسل في 1.5 مل ببدت + 1% FBS + 0.1 كلوريد الصوديوم م لمدة 1 دقيقة على RT على الروك.
- تغسل الأجنة 5 مرات في 1.5 مل ببدت + 1% FBS + 0.1 كلوريد الصوديوم م مدة 30 دقيقة على الروك في الرايت تغسل الأجنة في 1.5 مل ببدت + 1% FBS مدة 30 دقيقة في RT على الروك.
- تبني الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 200 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية، 488 أليكسا الماعز الماوس المضادة IgG و 647 أليكسا الماعز المضادة أرنب مفتش، المخفف معا في ببدت في 1: 500.
8-DAPI تلطيخ
ملاحظة: الاحتفاظ بالأجنة محمية من الضوء المحيط.
- تغسل الأجنة بسرعة في RT 1.5 مل من ببدت مرتين. استبدال ببدت 1.5 مل DAPI، وتضعف 1:15000 في 1 X ببست، واحتضان 15 دقيقة في RT على الروك.
- تغسل الأجنة في 1.5 مل بدبت + 1% FBS + 0.1 M كلوريد الصوديوم ثلاث مرات على RT لمدة 15-20 دقيقة. تخزين الأجنة في 1.5 مل ببدت في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للتحميل وصورة.
9-تصاعد والتصوير برونيفروس الزرد
- وضع الجنين الجانبي على الشريحة الزجاجية في كمية صغيرة، حوالي 10 ميليلتر، من ببدت.
- ضغط الجنين وراء العينين مع زوج من غرامة الملقط لإزالة الرأس وبعض من الكرة صفار البيض.
- استخدام الملقط غرامة كشط بعيداً بلطف الكرة صفار المتبقية من جسم الجنين. إزالة صفار منفصلان والسوائل الإضافية من الشريحة مع أنسجة رقيقة.
- إضافة قطره من تركيب وسائط إلى ذيل المتبقية للجنين والموقف حتى الذيل وضعت أفقياً. ضع ساترة على رأس الذيل تسطيح العينة، ثم ضع في مربع شريحة مغطاة.
- صورة أهداب الكلي في 60 X التكبير في مجهر [كنفوكل] استخدام القنوات التالية: DAPI باللون الأزرق (ليزر مجموعة في 408.0 شمال البحر الأبيض المتوسط)، فيتك باللون الأخضر (ليزر مجموعة في 488.0 شمال البحر الأبيض المتوسط)، Cy3 صبغ المسمى باللون الأحمر (ليزر مجموعة في 561.0 شمال البحر الأبيض المتوسط)، و 680 أليكسا في الأبيض (ليزر مجموعة في 637.0 شمال البحر الأبيض المتوسط).
Representative Results
كانت ثابتة الزرد البرية من نوع الأجنة في 24 هبف وفورا على استعداد كما هو موضح أعلاه. ويصور الشكل 1 سير تجريبية جنبا إلى جنب مع مراحل مصورة مختارة. ويشمل سير العمل الموضحة في الخطوات 1-8 عمليات المشتريات عينة، وتثبيت، والتلاعب بالانسجة الثابتة لتسمية النصوص الذاتية مع العقاقير ريبوبروبيس تليها الفلورة إلى التسمية protein(s) من الفائدة. الخطوة 9 في سير العمل تشير إلى تصاعد والتصوير تقنيات مصممة خصيصا لتحسين التصور الجذع الجنينية الزرد. في المخططات التي ترافق الخطوة 9، نحن لتوضيح طريقة التلاعب للأنسجة لتحديد المواقع على شريحة زجاج. في هذه الخطوة، تتم إزالة الجنين رأسه وصفار الكرة، تاركة الذيل أن توضع أفقياً بين الشرائح الزجاجية وساترة. هو اقترح إزالة صفار الكرة ورئيس لتصوير أفضل للسكان المقيمين في لجنة التنسيق الإداري في برونيفروس، كما الكرة صفار فلوريسسيس السيارات، ويعوق عملية التركيب.
وترد في الشكل 2، والذي يظهر نفس البرية من نوع الجنين في 60 X التكبير وتكبير رقمي في التكبير نفسه الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر [كنفوكل]. توفر اللوحات أعلى الصور لكل قناة الفردية، بينما فريقي القاع يتم تراكب مركب من هذه البيانات التصوير. المربع الأبيض (في صورة العمود الأيسر) يحدد المجال الذي يركز عليه التكبير/التصغير الرقمي (الصورة العمود الأيسر). أبرز الفريق النهائية للتكبير/التصغير الرقمي، نواة تم المسمى في DAPI، وتم اكتشاف MCCs استناداً ريبوبروبي العقاقير المصممة للاعتراف odf3b، حيث الأجسام المضادة إلى γ-tubulin الدلالة الهيئات القاعدية ويدل α-tubulin أهداب. التكبير الرقمي من تراكب المركب، الدائرة المتقطعة الصفراء تشير إلى محيط لجنة التنسيق الإداري، التي تم تحديدها بسبب حيازة النصوص odf3b ، والعديد من الهيئات القاعدية، واهداب. تم تحديد الخلية المجاورة مونو-عضو، المسمى بدائرة صفراء منقط، استناداً إلى النمط الظاهري امتلاك هيئة القاعدية واحدة وهدب واحد.
رقم 1: التخطيطي لمخطط انسيابي التجريبية. هذا يبين المخطط الانسيابي لسير عمل تجريبي، مصحوبة بالرسوم توضيحية مراحل الحرجة التي يدل الثلج حضانة الباردة، تمثل ثلاثة خطوط منحنية الحرارة، وعلى مدار الساعة يمثل مرات حضانة طويلة. يمكن إجراء سير العمل في الحد أدنى من 6 أيام (انظر رقم اليوم في الزاوية العليا اليمنى لكل مرحلة من مراحل هذه العملية)، على الرغم من أن يمكن تنفيذ بعض الخطوات على مدى فترات زمنية أطول، كما ورد في البروتوكول. ويوجه تصوير مفصل لعملية التركيب، مما يدل على ذيل الجنين المحملة النهائي بين الشرائح الزجاجية وساترة. يظهر مربع منقط أسود تحدد المنطقة التي يتم تصويرها في 60 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: النتائج ممثلة لتصور MCCs برونيفروس الزرد. صورة الأقصى إسقاطات جنينا الزرد البرية من نوع هبف 24 في 60 × التكبير فضلا عن تقريب رقمي على [كنفوكل] في 60 X التكبير للجنين نفسه. المربعات البيضاء تشير إلى المنطقة وركزت على التكبير. بقع الفردية DAPI (نويات)، odf3b (MCCs)، γ-tubulin (الهيئات القاعدية) و α-tubulin (أهداب) المسمى وثم دمجها معا في لوحات أسفل اثنين. في التكبير الرقمي، نحن نقدم تقديرات تقريبية لمواقع الخلايا كما يلي: يرد لجنة التنسيق الإداري بدائرة صفراء متقطع، ويحدد دائرة صفراء منقطة خلية أحادية عضو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
البروتوكول بالتفصيل أعلاه هو الأمثل لوسم MCCs في برونيفروس مع النصوص odf3b و α-tubulin في 24 هبف الزرد الأجنة. للحصول على أفضل النتائج، من المستحسن استخدام أجنة طازجة الثابتة واستعداد. ويمكن استخدام الأجنة التي تم إصلاحها والمخزنة في ميوه أو هيب + في-20 درجة مئوية لمدة أطول من أسبوع واحد، لكن احتمال خلفية غير المرغوب فيه تلطيخ يزداد مع الوقت الذي يتم الاحتفاظ الأجنة في مخزن.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها هذه التقنية ضرورية لتكييف هذا الأسلوب لمجموعات أخرى من علامات معينة، مثل ريبوبروبيس العقاقير الأخرى وغيرها من الأجسام المضادة. العديد من الأساليب لضبط معلمات خطوات عملية جبل كله التهجين في الموقع قد تم توثيقها مسبقاً من مجموعتنا وغيرها31،34،،من3638، 39. وبالمثل، كل جسم البروتين سوف تتطلب بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها فيما يتعلق تلطيخ مرات، ونطاقات التقريبي لتخفيف ومرات حضانة لكل جسم الأولية تقدر أفضل تقييم للنتائج الموثقة28، 35-للأجنة الذين تقل أعمارهم عن 24 هبف، ينبغي أن تكون المعاملة pK أقصر من 2 دقيقة، حيث الأجنة تزيد أعمارهم عن 24 هبف ينبغي أن تعامل مع pK لمدة أطول من 2 دقيقة. كما أن الأجنة تزيد أعمارهم عن 24 ينبغي المبيضة هبف الصباغ قبل العلاج pK.
بعد تلطيخ مع الحل المصبوغة الفلورسنت، من المهم لإزالة أي تبقى وصمة عار وجسم، وبيروكسيداسيس عن طريق إجراء سلسلة يغسل الميثانول وفوق أكسيد الهيدروجين. يغسل برنامج تلفزيوني فور ذات أهمية حيوية لإزالة الميثانول الزائدة من الأجنة. الأهم من ذلك، قبل المتابعة مع الأجسام المضادة إذا، وجدنا أن الأسيتون ويغسل المياه تجعل الأجنة أقل احتمالاً للتمسك ببعضها البعض و/أو أنابيب الطرد المركزي. في التجربة، والأجسام المضادة لعوامل النسخ المحددة وجينات أخرى، على الرغم من أنهم قد العمل بكفاءة في اسطوانات الغربية يقوم، لا تعمل بشكل جيد إذا كان في الزرد. ومع ذلك، العمل المصانة عاليا، ووفرة البروتينات، مثل α-tubulin وبيتا-كاتينين، جيدا في الزرد لحالة16،37.
مع الأسماك، فإنه من الممكن تصور النصوص الحمض النووي الريبي للجينات التي لا تملك بعد الأجسام المضادة المحددة في الزرد. من خلال الجمع بين السمك مع IF، كما يتبين من هذا البروتوكول، يمكن أن يكون التعريب المشارك من البروتين والحمض النووي الريبي النصوص ينظر في فيفو (الشكل 2). الطابع المرن للبروتوكول يتيح استكشاف الأخطاء وإصلاحها سريعاً للتصور من النصوص الجيش الملكي النيبالي والبروتينات في العديد من الأنسجة والنقاط الزمنية المختلفة. عندما جنبا إلى جنب مع سمات الفعل احترام الأجنة الزرد، يوفر هذا البروتوكول من الأسماك + إذا أداة أخرى لاستكشاف التعبير عن الجينات والبروتينات الهامة لتنظيم المسار التنموي.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها جزئيا منح R01DK100237 R.A.W. و "الوطنية العلم مؤسسة الدراسات العليا بحوث الزمالات رقم" DGE-1313583 إلى A.N.M. ونشكر أيضا كلية "العلوم الصيف الجامعية بحوث برنامج المنح" لدعم م نود أن نشكر المركز الزرد البحوث في جامعة نوتردام لرعايتهم مكرسة لأعمالنا الزرد. كما نود أن نشكر قسم "العلوم البيولوجية"، فضلا عن أعضاء لدينا مختبر للجميع لدعمهم وأفكاراً قيمة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
| E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
| embryo dishes | VWR | 351029 | |
| 5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
| disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
| 10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
| 1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
| methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
| flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
| hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
| hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
| 20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
| blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
| maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
| anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
| Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
| molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
| acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
| monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
| anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
| odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
| NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
| Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
| confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
| rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
- Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
- Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18 (2007).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
- Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
- Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
- Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
- Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
- Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
- Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
- Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
- Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
- Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
- Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
- Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
- Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
- Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
- Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
- Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
- Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
- Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060 (2013).
- Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
- Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604 (2014).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063 (2014).
