Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

Published: November 18, 2017 doi: 10.3791/56261
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

Abstract

בשנים האחרונות התפתחה העובר דג זברה מודל פופולרי ללמוד ביולוגיה התפתחותית בשל תכונות כמו האקסית עם רחם התפתחות העובר ועל שקיפות אופטית. בפרט, העובר דג זברה הפך אורגניזם חשוב ללמוד כליות חוליות organogenesis, כמו גם פיתוח תא multiciliated (MCC). כדי להמחיש MCCs בכליות דג זברה עובריים, אנו פיתחו פרוטוקול משולב כולה-הר פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דג), כל הר immunofluorescence (אם) המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה. כתב יד זה מתאר את הטכניקה שלנו עבור שיתוף לוקליזציה תעתיקים RNA וחלבון ככלי להבין טוב יותר את התקנון של תוכניות התפתחותיות דרך הביטוי של שושלת היוחסין גורמים שונים.

Introduction

בעשורים האחרונים, דג זברה (רזבורה rerio) התפתחה כאורגניזם מודל הממשלה ללמוד ביולוגיה התפתחותית. העוברים לפתח מחוץ האמא, שקוף אופטית. כמו כן, היווצרות של איברים חיוניים כגון עיניים, כליות, ו הקדמי מתרחשת במהירות, עם מבנים הנוצרת על-ידי רק 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf). חשוב מאוד כולו הגנום דג זברה עם יונקים1,2,3. בנוסף, דג זברה ואיברים יונקים שיהיה דומה אנטומיה ופיזיולוגיה. הכליה מתחלקים דג זברה, או pronephros, מדגים את הערך של מערכת מודל לבחינת תפקוד הגן במהלך nephrogenesis מוקדם ונחישות הגורל של אוכלוסיות תאים אפיתל שנשמרת נפרון חוליות4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. באופן דומה, העובר דג זברה הפך להיות חשוב יותר ויותר כשבוחנים את ontogeny של MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.

כפי שמרמז שמם, MCCs הם תאים אפיתל מאופיין על ידי צרור של תאי cilia ממוקם על פני שטח הפסגה17. דג זברה, MCCs לתפקד זרימת נוזלים, מופצים ב- "ש" כמו אופנה ברחבי האמצע של כל נפרון של pronephros ע י 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. למרות שהם רק כבר ציינו בקומץ של כליה אנושית למחלה מקרים18,19,20,21, MCCs נפוצים ברקמות יונקים אחרים כמו המוח, קנה הנשימה22,23,24, אשר מהווה שורה של אתגרים עבור תכנון ניסויים. אלגנטי מחקרים במודלים חוליות שונות, כולל דג זברה הראו שביל ההכפלה של גורל MCC, עם החריץ איתות כמו מעכב MCC פיתוח12,17,25 ,26,27. לכן, pronephros דג זברה מספק מודל נגיש בקלות ללמוד את מנגנונים גנטיים MCC פיתוח ויוו11,12,13,14, 15 , 16 , 17.

שקיפות והן מניפולציה גנטית קלה של דג זברה העוברים הוכיחו להיות תכונות שלא יסולא בפז כשלמדתי המסלולים גנטית ומולקולרית המסדירים גורל, רקמה והתפתחות מוקדמת העובר1,2 ,3. בתור שכזה, טכניקות מסורתיות כדי להמחיש תעתיקים וג'ין, חלבון, כמו הכלאה בחיי עיר ואם הר שלמה, יש כבר חלה על אופטימיזציה עבור דג זברה16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. על ידי שילוב פרוטוקולים פופולרי עבור דגים ואם, זה אפשרי לשים תווית ולנתח MCCs ויוו16,28,37,38.

Protocol

להלן כללי התנהגות משתמש מבוגרים דג זברה מתוחזק, המטופלים על ידי המרכז לחקר דג זברה-אוניברסיטת נוטרה דאם. כל שיטות לעבודה עם דג זברה מבוגרים ו עוברי אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה.

1. העובר קיבוע

  1. לאסוף את העוברים דג זברה באמצעות השיטות שתוארו39,40. בגיל 24 hpf, להוסיף 500 µL שאינם ספציפיים פרוטאז פתרון תערובת (50 מ"ג/מ"ל) E3 העובר דיש Incubate בטמפרטורת החדר (RT).
  2. ברגע עוברי מתחיל שבירת chorion, הסר כל נוזל המנה העובר.
  3. לשטוף את העוברים 2 - 3 פעמים עם E3 טריים על ידי הוספת כ 20 מ של E3, בעדינות מתערבל E3 בצלחת אז decanting הנוזל לתוך קיבול פסולת נוזלית.
  4. להרדים את העוברים לפני תיקון, להוסיף 2 מ של 0.2% tricaine E3.
  5. העברת העוברים לתוך בקבוקון זכוכית 5 מ ל באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק. להסיר את מרבית הפתרון tricaine/E3 באמצעות פיפטה לאחר העוברים התיישבו לתחתית המבחנה.
  6. תקן 24 hpf העוברים עם 5 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) עבור 2-4 h ב- RT, בלי עצבנות.
    התראה: PFA רעיל ויש פתרונות PFA לטפל ברדס כימי החוקר הוא לובש הגנה העין, כפפות, מעיל המעבדה. הכנת מקבע כדורגלן מהאבקה PFA מגורען צריכה להתבצע עם טיפול יוצא דופן, כמו כדורגלן מגורען נוטה להתפזר דרך הסטטי.
    הערה: עוברי יכול לתקן ב 4% מחברים בין לילה ב 4 º C. להכין 4% מחברים על ידי חימום 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לרתיחה תוך כדי ערבוב ללא הרף את הפתרון להתמוסס לחלוטין את כדורגלן מגורען. ברגע הפתרון הוא מקורר בחזרה לבית RT, ארבעה אחוזים כדורגלן הוא מסנן מחוטא ע י העברתו באמצעות מיקרומטר 0.45 מערכת חד פעמיים ואקום סינון, ואז, aliquoted 15 mL או 50 מ ל חלקים עבור אחסון ב-20 ° C.
  7. הסר את 4% כדורגלן ו עוברי לשטוף פעמיים עם פוספט X 1 buffered מלוחים עם 0.1% Tween-20 (PBST) ב RT. לרחוץ את העוברים פעם אחת עם 5 מ ל 100% מתנול (MeOH) ב RT. הוסף 5 מ של טרי 100% MeOH על העוברים דגירה ב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות.
    הערה: עוברי שניתן לאחסן ב 100% MeOH ב-20 ° C עד מוכן להכנה העובר.

2. העובר והכנה הכלאה

  1. נתרענן העוברים על ידי שטיפה פעם ב 5 מ של 50% MeOH 1 x PBST במשך 5 דקות ב- RT. המשך התייבשות ע י שטיפת העוברים ב 5 מ של 30% MeOH 1 x PBST במשך 5 דקות ב RT. לרחוץ את העוברים ב 5 מ של 1 x PBST פעמיים במשך 5 דקות כל אחד- RT.
  2. Permeabilize את העוברים על ידי המקננת בהם ב 5 מ ל פתרון של 1:1,000 proteinase K (pK) (10 מ"ג/מ"ל) ב 1 x PBST למשך 2 דקות ב- RT.
    הערה: עוברי מבוגר יכול להיות מודגרות יותר מאשר 2 דקות ירידה בריכוז pK כאמור לעיל, אולם בריכוז של 5 מ"ג/מ"ל, דגירה time פחות מ 2 דקות הוא הציע עבור עוברי צעיר יותר 24 hpf.
  3. להסיר pK פתרון לשטוף מיד ב 5 מ של 1 x PBST פעמיים על RT. לתקן את העוברים ב 5 מ של 4% מחברים ב RT למשך 20 דקות לפחות.
    הערה: עוברי יכול לתקן ב 4% מחברים בין לילה ב 4 º C.
  4. להסיר PFA לשטוף פעמיים בתוך 5 מ של 1 x PBST-RT.
  5. העברת העוברים ב 5 מ של 1 x PBST לתוך צינורות microcentrifuge בתחתית שטוח להציב ישר לתוך ארון microcentrifuge ב RT כדי להקל על אינטראקציות בין כל העובר ופתרון עוקבות הכלאה.
  6. רוחצים את העוברים פעמיים ב- 1.5 מ של הכלאה פתרון (Hyb +)-RT. להוסיף 1.5 מ ל Hyb טריים + את דגירה עוברי-70 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה עבור 4-6 שעות.
  7. החלף mL 1.5 של Hyb + נפח של בדיקה פתרון (10 µL RNA בדיקה/500 µL Hyb +) מספיקות לכיסוי מלא את העוברים.
    הערה: לסנתז antisense RNA בדיקה באמצעות בעבר תיאר שיטות39.
  8. Hybridize את המכשיר במשך הלילה בתנור הכלאה ב 70 ° C עם הצדיקים צינורות בודדים ממוקם בארון microcentrifuge, מבלי לרעוד.

3. חמים שוטף וחסימת

הערה: מנקי חם מבוצעות על ידי לשים את הפתרון המתאים על העוברים ולאחר מכן המקננת בתנור הכלאה ב- 70 מעלות צלזיוס. כדי לשמור את פתרונות כביסה ב 70 ° C, במקום 50 מ ל צינורות של כל פתרון בתנור הכלאה כאשר המכשיר / Hyb + תערובת נוספת.

  1. להסיר את המכשיר. לשטוף את העוברים פעמיים ב 70 ° C ב- 1.5 מ של 50% formamide/2 x תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) מאגר למשך 20-30 דקות.
    הערה: החללית יכול להיות מאוחסנים Hyb + ב-20 ° C, בו שימוש חוזר במועד מאוחר יותר.
  2. לשטוף את העוברים פעם ב 70 ° C ב- 1.5 מ ל 2 x SSC במשך 15 דקות לשטוף את העוברים פעמיים ב 70 ° C ב- 1.5 מ של 0.2 X האס למשך 20-30 דקות. החלף 0.2 x SSC עם 1.5 מ של ריאגנט חסימה דגירה בין לילה ב 4 º C.
    הערה: זה אפשרי דגירה ריאגנט חסימה ב- RT במשך 4 שעות במקום בן לילה.

4. נוגדן הדגירה ולאחר חומצה Maleic מאגר שוטף

הערה: לשמור על העוברים מפני אור מקיף.

  1. החלף הכימית חסימה 0.2 מ של אנטי-DIG-POD ב ריאגנט חסימה ביחס של 1:1,000 ואת תקופת דגירה של 3 שעות תחת נייר כסף או אחרת הכיסוי חסימת-אור RT.
    הערה: לחלופין, הנוגדן ניתן דגירה בין לילה ב 4 º C.
  2. לאחר 3 שעות, יש לשטוף את העוברים ב- 1.5 מ ל חומצה maleic מאגר 2 - 4 פעמים במשך דקה 10-15 כל-Incubate RT. העוברים בין לילה ב 4 ° C ב- 1.5 מ ל חומצה maleic טריים מאגר.
    הערה: זה לא הכרחי כדי דגירה במאגר חומצה maleic בן לילה, אבל עושה אז מקטינה בדיקת רקע.

5. בדיקה באיתור ובהסרה של Peroxidase

הערה: לשמור על העוברים מפני אור מקיף.

  1. להסיר את מאגר חומצה maleic והחלף 1.5 מ ל 1 x PBS. לשטוף עוברי פעמיים ב- 1.5 מ ל 1 x PBS למשך 5 דקות כל-RT. Incubate עוברי ב 0.2 מ"ל של Cy3 פלורסנט מכתים פתרון עבור 60 דקות ב- RT.
    הערה: זמן הדגירה עשויים להשתנות עבור הגששים שונים.
  2. לשטוף את העוברים פעם אחת עם 1.5 מיליליטר MeOH אחוז הבאים ב- PBS 1 X 10 דקות ב RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH ו- 100% MeOH.
  3. דגירה העוברים עם 1.5 מ של 1% H2O2 ב- MeOH למשך 30 דקות בשטיפת RT. העוברים פעם אחת עם 1.5 מ ל הפתרונות MeOH הבאים ב- PBS 1 x 10 דקות ב RT: 75% MeOH, 50% MeOH ו- 30% MeOH. לשטוף את העוברים פעמיים במשך 5 דקות ב RT ב- 1.5 מ ל 1 x PBS.
    הערה: עוברי יכול להיות מאוחסן PBS בן לילה ב 4 º C.

6. immunofluorescence

הערה: לשמור על העוברים מפני אור מקיף.

  1. לשטוף העוברים ב- 1.5 מ של ddH2O עבור 5 דקות בשטיפת RT. העוברים ב- 1.5 מ של אצטון טרום מקורר (שמרו ב-20 ° C) במשך 7 דקות-RT. לרחוץ העוברים פעם ב- 1.5 מ של ddH2O עבור 5 דקות בשטיפת RT. העוברים פעם ב- 1.5 מ של 1 x PBST עם 1% דימתיל סולפוקסיד (PBDT) עבור 5 דקות ב- RT.
  2. דגירה העוברים ב- 1.5 מ של PBDT + 10% סרום שור עוברית (FBS) על כיסא נדנדה-RT כבר שעתיים.
  3. להסיר PBDT + FBS ולהחליף עם 1.5 מ של נוגדנים העיקרי, anti-acetylated טובולין (המופק העכבר) ו- anti-γ-טובולין (המופק ארנב), מדולל יחד בכל 1:400 PBDT + 1% FBS. דגירה העוברים בין לילה ב 4 º C.
    הערה: הדגירה פעמים עשוי להשתנות בהתאם נוגדן ראשוני. בדיקה של מרווחי זמן שונים, ייתכן שיהיה צורך לייעל את תיוג.

7. משני נוגדן

הערה: לשמור על העוברים מפני אור מקיף.

  1. כדי להסיר עודפי נוגדנים לא מאוגד העוברים, לרחוץ ב- 1.5 מ של PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl עבור 1 דקות ב- RT על כיסא נדנדה.
  2. לשטוף את העוברים 5 פעמים ב 1.5 מ של PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl למשך 30 דקות כל אחד על כיסא נדנדה-RT. לרחוץ את העוברים ב- 1.5 מ של PBDT + 1% FBS למשך 30 דקות ב- RT על כיסא נדנדה.
  3. דגירה העוברים בין לילה ב 4 ° C ב- 200 µL של הנוגדנים משני, אלקסה 488 עז אנטי-העכבר IgG ו- 647 אלקסה עז נגד ארנב IgG, מדולל יחד ב- PBDT בשעה שבערך.

8. דאפי מכתים

הערה: לשמור על העוברים מפני אור מקיף.

  1. לשטוף את העוברים במהירות ב RT ב- 1.5 מ של PBDT פעמיים. להחליף את PBDT עם 1.5 מ של דאפי, מדולל 1:15000 ב 1 X PBST ו דגירה 15 דקות ב RT על כיסא נדנדה.
  2. לשטוף את העוברים ב- 1.5 מ של PDBT + 1% FBS + 0.1 M NaCl 3 פעמים ב RT למשך 15-20 דקות כל אחד. לאחסן העוברים מ 1.5 ל PBDT ב 4 ° C עד מוכן הר ותמונה.

9. הרכבה והדמיה עבור דג זברה Pronephros

  1. העובר על פרופיל לרוחב בשקופית זכוכית באמצעי אחסון קטן, כ 10 µL, של PBDT.
  2. מחצי העובר מאחורי העיניים עם זוג מלקחיים בסדר כדי להסיר את הראש, חלק הכדור חלמון.
  3. השתמש בסדר המלקחיים בעדינות לגרד משם הכדור חלמון הנותר מהגוף העובר. הסר את החלמון הפומבית ואת נוזלי נוסף השקופית עם רקמה דקה.
  4. להוסיף טיפה של הרכבה מדיה ועד הזנב הנותרים של העובר והצב אז הזנב מונחת רוחבית. המקום של coverslip מעל הזנב כדי לשטח את המדגם, ומניחים בקופסה לשקופיות מכוסה.
  5. תמונה כליות cilia בהגדלה X 60 במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות הערוצים הבאים: דאפי בכחול (לייזר ערכת 408.0 ננומטר), FITC בירוק (לייזר ערכת 488.0 ננומטר), Cy3 צבע-באדום (לייזר ערכת 561.0 ננומטר), ו אלקסה 680 בלבן (לייזר ערכת 637.0 ננומטר).

Representative Results

פראי-סוג דג זברה עוברי תוקנו-24 hpf מיד מוכן כמתואר לעיל. איור 1 מציג זרימת עבודה ניסויית יחד עם שלבים מאויר שנבחרו. זרימת העבודה המתוארות בשלבים 1-8 כוללת תהליכי רכש לדוגמה קיבוע, מניפולציה של רקמות קבוע לתייג תעתיקים אנדוגני עם antisense riboprobes ולאחר מכן immunofluorescence תווית protein(s) עניין. שלב 9 בזרימת העבודה מתייחס את ההרכבה והדמיה טכניקות שתוכננה במיוחד כדי למטב ויזואליזציה של גזע עובריים דג זברה. בציורים המלווים צעד 9, אנו ממחישים את השיטה של מניפולציה כדי למקמם הרקמה על משטח זכוכית. בשלב זה, מוסרים את הכדור הראש ואת החלמון של העובר, עוזב את הזנב למקם רוחבית בין שקופיות זכוכית coverslip. הסרת החלמון הכדור ואת הראש הוא הציע עבור ההדמיה הטובה ביותר של האוכלוסייה MCC תושב pronephros, כמו הכדור חלמון שזוהר אוטומטית מונעת את תהליך ההרכבה.

להחליפן בתמונות שהושג באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ניתנים איור 2, אשר מראה העובר פראי-סוג זהה בהגדלה X 60 ו- a זום דיגיטלי בהגדלה אותו. הלוחות המובילים לספק תמונות של כל ערוץ בודדים, ואילו הלוחות שני התחתון הכיסוי ללא הפרדות צבע של נתונים הדמיה אלה. התיבה הלבנה (בתמונה בעמודה הימנית) מתאר את האזור בו הוא המוקד של זום דיגיטלי (התמונה בעמודה הימנית). מודגש בחלונית הסופי של זום דיגיטלי, גרעינים הודבקו תוויות של דאפי, MCCs התגלו מבוסס על riboprobe antisense שנועדו לזהות odf3b, כאשר נוגדנים γ-טובולין מציינות הגופים הבזליים וα-טובולין מציין את cilia. זום דיגיטלי הכיסוי ללא הפרדות צבע, למעגל מקווקו צהוב מציינת להיקף פוקסי, אשר זוהה בשל הבעלות של odf3b תעתיקים, מספר הגופים הבזליים cilia. בתא מונו-ciliated הסמוך, עם עיגול צהוב מנוקד, תוויות מזוהה בהתבסס על פנוטיפ של אחזקת גוף בזאלי אחד, עם ריסי יחיד.

Figure 1
איור 1: סכימטי של זרימה ניסיוני. זה תרשים זרימה מראה זרימת עבודה ניסויית, בליווי איורים של השלבים הקריטיים שבהם פתית השלג מציין הדגירה קר, שלושת הקווים מעוקל מייצגים החום ומייצג השעון דגירה ארוך פעמים. זרימת העבודה יכולה להתבצע במינימום של 6 ימים (ראה מספר יום בפינה הימנית העליונה של כל שלב בתהליך), אך ניתן לבצע כמה צעדים במשך פרקי זמן ארוכים יותר, כאמור בפרוטוקול. תיאור מפורט של תהליך הרכבה מצויר, הממחיש את הזנב הסופי רכוב העובר בין שקופיות זכוכית coverslip. שתיבה מקווקוות שחור מתווה את האזור בו נמצא עם תמונה בהגדלה X 60. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג תוצאות להמחשת MCCs של pronephros דג זברה. השלכות תמונה מרבי של העובר פראי-סוג דג זברה hpf 24 60 X הגדלה, כמו גם a זום דיגיטלי-קונפוקלי בהגדלה X 60 של העובר אותו. בתיבות לבן מצביעים על אזור ממוקד עבור מרחק מתצוגה. כתמים בודדים של דאפי (גרעינים), odf3b (חשמליים Mcc), וγ-טובולין (basal גופות) וα-טובולין (cilia) שכותרתו, ואז התמזגה יחד הפאנלים התחתון שני. ב זום דיגיטלי, אנו מספקים הערכות של המיקומים תא כדלקמן: MCC תחומה על-ידי העיגול הצהוב מקווקו, ומתאר למעגל צהוב מנוקד תא מונו-ciliated. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול שתוארו לעיל ממוטב תיוג MCCs ב pronephros עם odf3b תעתיקים וα-טובולין ב 24 hpf דג זברה עוברי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מומלץ להשתמש העוברים טריים קבועים ובלתי מוכן. עוברי קבוע, מאוחסנים או MeOH או Hyb + ב-20 ° C יותר מאשר שבוע אחד יכול לשמש, אך ההסתברות של הרקע הבלתי רצויים מכתים גדל עם הזמן העוברים נשמרים במחסן.

שינויים ופתרון בעיות של טכניקה זו יש צורך להתאים שיטה זו עבור חבילות אחרות של סמני מסוים, למשל אחרים riboprobes antisense, נוגדנים אחרים. שיטות רבות על התאמת הפרמטרים של שלבים בתהליך הר שלמה בחיי עיר הכלאה היו שתועד בעבר על ידי הקבוצה שלנו ועוד31,34,36,38, 39. באופן דומה, כל נוגדן חלבון ותחייב פתרון בעיות כלשהו מבחינת צביעת פעמים ולאחר טווחים משוער של דילולים והשעות הדגירה עבור כל נוגדן ראשוני הכי מוערך על ידי הערכה של תוצאות מתועדים28, 35. עבור עוברי צעיר יותר 24 hpf, pK הטיפול צריך להיות קצר יותר מאשר 2 דקות, שבו עוברי שגילם 24 hpf צריכים להיות מטופלים עם pK יותר מ 2 דקות. בנוסף, העוברים שגילם 24 hpf צריך להיות מולבן של פיגמנט לפני הטיפול pK.

לאחר צביעת עם הפתרון מכתימים פלורסנט, חיוני כדי להסיר כל הנותרים הכתם נוגדן, peroxidases על-ידי ביצוע הסדרה של מנקי מתנול, מימן על-חמצני. מנקי PBS מיד לאחר הכרחיים כדי להסיר מתנול עודפי העוברים. חשוב לציין, לפני שתמשיך עם נוגדנים אם, מצאנו כי אצטון על יונים מים שוטף לעשות את העוברים פחות סביר לדבוק אחד לשני ו/או הצינורות צנטריפוגה. הניסיון שלנו, נוגדנים עבור גורמי שעתוק ספציפיים, גנים אחרים, למרות שהם יפעלו ביעילות אצל לחומה המערבית, לא עובד היטב עבור אם דג זברה. עם זאת, חלבונים שנשמרת מאוד, שופע, כגון טובולין α וβ-catenin, עובד היטב את דג זברה עבור אם16,37.

דג זה אפשר לדמיין RNA תעתיקים של גנים אשר עדיין אין נוגדנים ספציפיים ב- דג זברה. על ידי שילוב של דגים עם אם, כפי שמתואר על ידי פרוטוקול זה, שותף לוקליזציה של תעתיקים RNA וחלבון ניתן לראות ויוו (איור 2). הטבע גמיש של הפרוטוקול מאפשר פתרון מהיר עבור הפריט החזותי של RNA תעתיקים שונים חלבונים ברקמות רבות, נקודות זמן. בשילוב עם התכונות כבר מכובד של דג זברה העוברים, פרוטוקול זה של דגים + אם מספק כלי נוסף כדי לחקור את הביטוי של גנים, חלבונים חשובים את מסלול התפתחותי רגולציה.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי המענק R01DK100237 ועד R.A.W. הלאומי למדע קרן לתואר שני מחקר מלגת לנתיב הימני. DGE-1313583 אל A.N.M. אנו מודים גם המכללה של המדע הקיץ לתואר ראשון מחקר תכנית העמיתים לתמיכה M.U. ברצוננו להודות למרכז לחקר דג זברה-אוניברסיטת נוטרה דאם לטיפול ייעודי שלהם של דג זברה שלנו. כן נרצה להודות במחלקה למדעי הביולוגיה, כמו גם חברי המעבדה שלנו לכולם על התמיכה ועל תובנות בעלות ערך.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
non-specific protease mixture solution Roche 11459643001, pronase from Streptomyces griseus Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C
E3 solution Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Fluka A5040-250G To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL
embryo dishes VWR 351029
5 mL glass vials Wheaton 225012
disposable plastic Pasteur pippettes VWR 414004-004
4% paraformaldehyde (PFA) solution Electron Microscopy Services 19210 Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use.
10X PBS American Bioanalytical AB11072 Dilute in distilled water to make a 1X stock
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038 Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) Sigma P9416 0.1% Tween-20 in 1X PBS
methanol (MeOH) Sigma 34860-4L
proteinase K Roche 3115879001 Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C
flat bottom microcentrifuge tubes VWR 87003-300; 87003-298
formamide American Bioanalytical AB00600 store at -20°C
hybridization solution (HYB+) 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C
hybridization oven Fisher Scientific 13-247-10Q
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution American Bioanalytical AB13156 dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks
blocking reagent solution Roche 11096176001 dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C
maleic acid buffer solution Sigma M0375 and S7653 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments Roche 11207739910 store at 4°C
Cy3 fluorescent staining solution PerkinElmer, Inc. NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer
Hydrogen peroxide (H2O2) Sigma H1009-500mL store at 4°C
molecular grade distilled water (ddH2O) Mediatech 25-055-CM
acetone American Bioanalytical AB00636-01000 store an aliquot at -20°C
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438-034 aliquot and store at -20°C
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 Sigma-Aldrich T6793 aliquot and store at -20°C
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit Sigma-Aldrich T5192 aliquot and store at -20°C
odf3b cDNA clone MGC:63985 OpenBiosystems IMAGE:6792478 store bacterial glycerol stock at -80°C
NaCL American Bioanalytical AB01915-05000
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG Life Technologies A21245 store at 4°C; protect from light
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG Life Technologies A11029 store at 4°C; protect from light
DAPI Life Technologies D1306 aliquot and store at -20°C
glass slide Thermo-Fisher 4445
glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
mounting media Polysciences, Inc. 18606, Aqua-Poly/Mount store at 4°C
confocal microscope and associated software We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software
rocker Bio-Rad 1660710EDU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  3. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  4. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  5. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  6. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  7. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
  9. Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  10. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  11. Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  12. Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
  13. Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18 (2007).
  14. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
  15. Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
  16. Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
  17. Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
  18. Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
  19. Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
  20. Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
  21. Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
  22. Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
  23. Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
  24. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
  25. Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
  26. Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
  27. Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
  28. Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
  29. Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
  30. Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
  31. Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
  32. Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
  33. Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
  34. Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
  35. Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060 (2013).
  36. Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
  37. Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  38. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
  39. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604 (2014).
  40. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063 (2014).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 129 Cilia דג זברה multiciliated תא פלורסנט בחיי עיר הכלאה immunofluorescence pronephros כליות
להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה <em>בחיי עיר</em> הכלאה, Immunofluorescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marra, A. N., Ulrich, M., White, A., … More

Marra, A. N., Ulrich, M., White, A., Springer, M., Wingert, R. A. Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (129), e56261, doi:10.3791/56261 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter