Summary
Cilier udvikling er afgørende for korrekt organogenesis. Denne protokol beskriver en optimeret metode til at mærke og visualisere ciliated celler af zebrafisk.
Abstract
I de seneste år opstået zebrafisk embryoet som en populær model til at studere udviklingsmæssige biologi på grund af træk såsom ex utero embryo udvikling og optisk gennemsigtighed. Især er zebrafisk embryo blevet en vigtig organisme at studere hvirveldyr nyre organogenesis samt multiciliated celle (MCC) udvikling. For at visualisere MCC'er i embryonale zebrafisk nyre, vi har udviklet en kombineret protokol af hele-mount fluorescerende i situ hybridisering (FISH) og montere hele immunofluorescens (IF), der giver høj opløsning billeddannelse. Dette manuskript beskriver vores teknik til co lokalisering RNA udskrifter og protein som et redskab til bedre at forstå reguleringen af udviklingsmæssige programmer gennem udtryk af forskellige faktorer, afstamning.
Introduction
Over de sidste mange årtier fremstod zebrafisk (Danio rerio) som en førsteklasses model organisme at studere udviklingsmæssige biologi. Embryonerne udvikle uden for moderen og gennemsigtige optisk. Dannelsen af vitale organer såsom øjet, nyre og forhjernen forekommer også, hurtigt, med strukturer dannet af bare 24 timer post befrugtning (hpf). Vigtigere, er zebrafisk genom meget bevaret med pattedyr1,2,3. Desuden har zebrafisk og pattedyr organer lignende anatomi og fysiologi. Zebrafisk embryonale nyre, eller pronephros, viser værdien af modelsystem til at undersøge genfunktion under begyndelsen nephrogenesis og skæbne bestemmelse af bevarede epitelcelle populationer af hvirveldyr nephron4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. på samme måde zebrafisk embryo er blevet stadig vigtigere i undersøge Ontogeni af MCC'er11,12,13,14,15, 16 , 17.
Som navnet antyder, er MCCs epitelceller karakteriseret ved et bundt af motile cilia beliggende på den apikale overflade17. I zebrafisk, MCCs fungere i flydende flow og er spredt i en "salt" ligesom mode i hele midten af hvert nephron af pronephros af 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. selv om de er kun blevet bemærket i en håndfuld af menneskelige nyre sygdom tilfælde18,19,20,21, MCCs er udbredt i andre pattedyr væv som hjernen og luftrør22,23,24, som indebærer en række udfordringer for eksperimentelt design. Elegant undersøgelser i forskellige hvirveldyr modeller herunder zebrafisk viste en bevaret pathway af MCC skæbne, med hakket signalering pathway som en hæmmer af MCC udvikling12,17,25 ,26,27. Derfor giver zebrafisk pronephros et lettilgængeligt model til at studere de genetiske mekanismer af MCC udvikling i vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Både gennemsigtighed og let genetiske manipulering af zebrafisk embryoner har vist sig for at være uvurderlig karaktertræk, når man studerer den genetiske og molekylære veje, der regulerer celle skæbne, væv vækst og udviklingen af det tidlige embryon1,2 ,3. Som sådan, traditionelle teknikker til at visualisere protein og gen afskrifter, som i situ hybridisering og hele mount IF, har været anvendt til og optimeret til zebrafisk16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Ved at kombinere populære protokoller for fisk og hvis, er det muligt at mærke og analysere MCC'er i vivo16,28,37,38.
Protocol
Følgende protokol bruger zebrafisk voksne bevares og plejes af Center for zebrafisk forskning ved University of Notre Dame. Alle metoder til at arbejde med zebrafisk voksne og embryoner blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg.
1. embryo fiksation
- Indsamle zebrafisk embryoner ved hjælp af tidligere beskrevne metoder39,40. På 24 hpf, tilføje 500 µL af ikke-specifik protease blanding løsning (50 mg/mL) til E3 i embryonet fad Incubate ved stuetemperatur (RT).
- Når embryoner begynder at bryde af chorion, skal du fjerne alle væske fra embryo parabol.
- Vask embryoner 2 - 3 gange med frisk E3 ved at tilføje ca 20 mL af E3, forsigtigt hvirvlende E3 i skålen og derefter dekantering væsken i en flydende affaldsbeholder.
- For at aflive embryonerne før fastsættelse, tilsættes 2 mL 0,2% tricaine til E3.
- Overførsel af embryoner i en 5 mL hætteglas ved hjælp af en plastik Pasteur pipette. Fjerne de fleste af de tricaine/E3 løsning ved hjælp af en pipette, efter at embryonerne har fast til bunden af hætteglasset.
- Fix 24 hpf embryoner med 5 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) for 2-4 h i RT, uden agitation.
Forsigtig: PFA er giftigt og PFA løsninger skal håndteres under en kemisk hood, mens forskeren Iført øjenbeskyttelse, handsker og en lab coat. Forberedelse af PFA fiksativ fra granuleret PFA pulveret skal udføres med ekstraordinær pleje, som den granuleret PFA tendens til at sprede gennem statisk beregning.
Bemærk: Embryoner kan løse i 4% PFA natten over ved 4 ° C. Forbered 4% PFA ved at opvarme 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til en byld under konstant omrøring løsningen opløses fuldstændigt i granuleret PFA. Når løsningen er afkølet ned til RT, 4% PFA er filter steriliseret ved, at det gennem et 0,45 µm engangs system for vakuum filtrering, derefter og aliquoted i 15 mL eller 50 mL portioner til opbevaring ved-20 ° C. - Fjerne 4% PFA og vask embryoner to gange med 1 X phosphat bufferet saltvand med 0,1% Tween-20 (PBST) på RT. vaske embryoner én gang med 5 mL 100% methanol (MeOH) på RT. tilføje 5 mL frisk 100% MeOH til embryoner og inkuberes ved-20 ° C i mindst 20 min.
Bemærk: Embryoner kan opbevares i 100% MeOH ved-20 ° C indtil klar til embryo forberedelse.
2. Foster forberedelse og hybridisering
- Rehydrere embryoner ved vask en gang i 5 mL 50% MeOH i 1 x PBST i 5 min på RT. Fortsæt rehydrering ved at vaske embryonerne i 5 mL 30% MeOH i 1 x PBST i 5 min på RT. vaske embryoner i 5 mL 1 x PBST to gange for 5 min på RT.
- Permeabilize af embryoner ved at inkubere dem i 5 mL af en oploesning af 1:1,000 proteinase K (pK) (10 mg/mL) i 1 x PBST for 2 min på RT.
Bemærk: Ældre embryoner kan blive udruget længere end 2 min i pK koncentrationen anført ovenfor, men en koncentration på 5 mg/mL og inkubering gang mindre end 2 min er foreslået for embryoner yngre end 24 hpf. - Fjerne pK løsning og vask straks i 5 mL 1 x PBST to gange på RT. Fix embryoner i 5 mL 4% PFA på RT for mindst 20 min.
Bemærk: Embryoner kan løse i 4% PFA natten over ved 4 ° C. - Fjerne PFA og vaskes to gange i 5 mL 1 x PBST på RT.
- Overføre embryoner i 5 mL af 1 x PBST i flad bund microcentrifuge rør placeret oprejst i en microcentrifuge rack på RT for at lette samspillet mellem hver embryo og den efterfølgende hybridisering løsning.
- Vaske embryoner to gange i 1,5 mL af hybridisering (Hyb +) på RT. tilføje 1,5 mL frisk Hyb + og inkuberes embryoner ved 70 ° C i en hybridisering ovn i 4-6 timer.
- Erstatte 1,5 mL Hyb + med mængden af sonden opløsning (10 µL RNA probe/500 µL Hyb +) tilstrækkelig til fuldt ud dække embryonerne.
Bemærk: Syntetisere antisensstoffer RNA sonden ved hjælp af tidligere beskrevet metoder39. - Krydse sonde overnatning i hybridisering ovnen ved 70 ° C med enkelte rør placeret oprejst i microcentrifuge rack, uden rystelser.
3. varm vasker og blokering
Bemærk: Hot vasker udføres ved at sætte den hensigtsmæssige løsning på embryoner og derefter inkubere i hybridisering ovnen ved 70 ° C. For at holde vask løsninger ved 70 ° C, placere 50 mL rør af hver opløsning i hybridisering ovnen når sonden / Hyb + blanding er tilføjet.
- Fjerne sonden. Vask af embryoner to gange ved 70 ° C i 1,5 mL 50% formamid/2 x saltvand-natrium (SSC) citratbuffer for 20-30 min.
Bemærk: Sonden kan gemmes i Hyb + på-20 ° C og genbruges på et senere tidspunkt. - Vask af embryoner en gang ved 70 ° C i 1,5 mL 2 x SSC i 15 min. vask embryonerne to gange ved 70 ° C i 1,5 mL 0,2 X SSC for 20-30 min. Erstat 0,2 x SSC med 1,5 mL blokerende reagens og inkuberes natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Det er muligt at udruge blokerende reagens på RT for 4 h i stedet for natten.
4. antistof inkubation og maleinsyre Buffer vasker
Bemærk: Hold embryoner beskyttet fra omgivende lys.
- Erstatte den blokerende reagens med 0,2 mL af anti-DIG-POD i blokerende reagens på forholdet mellem 1:1,000 og inkuberes i 3 h under folie eller et andet lys-blokerende dækning på RT.
Bemærk: Alternativt antistoffet kan inkuberes natten over ved 4 ° C. - Efter 3 timer, vask af embryoner i 1,5 mL af maleinsyre buffer 2 - 4 gange i 10-15 min. hver på RT. Incubate embryonerne natten over ved 4 ° C i 1,5 mL frisk maleinsyre buffer.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at udruge i maleinsyre buffer natten over, men gør så falder sonde baggrund.
5. sonden detektering og fjernelse af Peroxidase
Bemærk: Hold embryoner beskyttet fra omgivende lys.
- Fjerne maleinsyre buffer og erstatte med 1,5 mL 1 x PBS. Vaske embryoner to gange i 1,5 mL 1 x PBS for 5 min hver på RT. Incubate embryoner i 0,2 mL af Cy3 fluorescerende farvning løsning for 60 min. ved RT.
Bemærk: Inkubationstiden kan variere for forskellige sonder. - Vask embryoner engang med 1,5 mL af den følgende procent MeOH i 1 X PBS for 10 min på RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH og 100% MeOH.
- Inkuber embryoner med 1,5 mL 1% H2O2 i MeOH for 30 min på RT. Wash embryoner engang med 1,5 mL af følgende MeOH løsninger i 1 x PBS for 10 min på RT: 75% MeOH, 50% MeOH og 30% MeOH. Vask embryoner to gange for 5 min på RT i 1,5 mL 1 x PBS.
Bemærk: Embryoner kan opbevares i PBS natten over ved 4° C.
6. immunfluorescens
Bemærk: Hold embryoner beskyttet fra omgivende lys.
- Vaske embryoner i 1,5 mL af Hedeselskabet2O i 5 min på RT. Wash embryoner i 1,5 mL pre kølet acetone (opbevares ved-20 ° C), for 7 min på RT. vaske embryoner engang i 1,5 mL af Hedeselskabet2O i 5 min på RT. Wash embryoner engang i 1,5 mL af 1 x PBST med 1% DMSO (PBDT) i 5 min på RT.
- Inkuber embryoner i 1,5 mL af PBDT + 10% føtal bovint serum (FBS) på en rocker på RT for 2 h.
- Fjerne PBDT + FBS og erstatte med 1,5 mL primære antistoffer, anti-acetyleret tubulin (fremstillet af musen) og anti-γ-tubulin (fremstillet af kanin), fortyndet sammen på 1: 400 i PBDT + 1% FBS. Inkuber embryoner natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Inkuberingstider kan variere afhængigt af det primære antistof. Afprøvning af forskellige tidsintervaller kan være nødvendigt at optimere mærkning.
7. sekundær antistof
Bemærk: Hold embryoner beskyttet fra omgivende lys.
- For at fjerne overskydende ubundne antistof fra embryoner, vaske i 1,5 mL af PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl for 1 min på RT på en rocker.
- Vask af embryoner 5 gange i 1,5 mL af PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl i 30 min. på en rocker på RT. vaske embryoner i 1,5 mL af PBDT + 1% FBS i 30 min på RT på en rocker.
- Inkuber embryoner natten over ved 4 ° C i 200 µL af de sekundære antistoffer, Alexa 488 ged anti-mus IgG og Alexa 647 ged anti-kanin IgG, fortyndet sammen i PBDT på 1: 500.
8. DAPI farvning
Bemærk: Hold embryoner beskyttet fra omgivende lys.
- Vask af embryoner hurtigt på RT i 1,5 mL af PBDT to gange. Erstat PBDT med 1,5 mL DAPI, fortyndet 1:15000 i 1 X PBST og Inkuber 15 min på RT på en rocker.
- Vask af embryoner i 1,5 mL af PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl tre gange på RT for 15-20 min. Opbevare embryoner i 1,5 mL PBDT ved 4 ° C indtil klar til at montere og billede.
9. montering og Imaging for zebrafisk Pronephros
- Lå embryo lateral på glas dias i en lille mængde, ca. 10 µL af PBDT.
- Klem embryo bag øjnene med et par fine pincet til at fjerne hovedet og nogle af æggeblomme bolden.
- Brug den bøde tang til at forsigtigt skrabe væk resterende æggeblomme bolden fra selve embryo. Fjern de dissocierede æggeblomme og ekstra væske fra dias med en tynd væv.
- Tilsættes en dråbe montering medier til resterende halen af fosteret og Placer så halen er lagt sideværts. Placer en coverslip oven på hale til flade prøven, og Placer den i en overdækket dias boks.
- Billede nyre cilier på 60 X forstørrelse på en Konfokal mikroskop ved hjælp af følgende kanaler: DAPI i blå (laser sæt på 408.0 nm), FITC i grøn (laser sæt på 488.0 nm), Cy3 dye-mærket med rødt (laser sæt på 561.0 nm), og Alexa 680 i hvid (laser sæt på 637.0 nm).
Representative Results
Wild-type zebrafisk embryoner blev fastsat til 24 hpf og straks forberedt som beskrevet ovenfor. Figur 1 viser en eksperimentel workflow sammen med udvalgte illustreret faser. Arbejdsgangen beskrives i trin 1-8 omfatter processerne af prøven indkøb, fiksering og manipulation af faste væv til at mærke endogene udskrifter med antisense riboprobes efterfulgt af immunofluorescens til etiketten de(n) af interesse. Trin 9 i arbejdsgangen refererer til montering og billedbehandling teknikker specielt designet til at optimere visualisering af zebrafisk embryonale stammen. I de tegninger, der ledsager trin 9, viser vi metoden til manipulation af positionering vævet på et glas dias. I dette trin, fosteret hoved og æggeblomme bolden fjernes, indlevering hale sideværts placeret mellem et glas dias og coverslip. Fjernelse af æggeblomme bolden og hoved er foreslået for den bedste billeddannelse af de fastboende MCC befolkning i pronephros, som æggeblomme bolden auto-fluorescerer og hindrer montering proces.
Repræsentative billeder fremstillet ved hjælp af en Konfokal mikroskop leveres i figur 2, som viser den samme wild-type embryon på 60 X Forstørrelse og en digital zoom på samme forstørrelse. De top paneler giver billeder af hver enkelt kanal, mens de nederste to paneler er den sammensatte overlejring af disse billeddiagnostiske data. Den hvide boks (i den venstre kolonne billede) skitserer det område, der er i fokus i den digitale zoom (højre kolonne billedet). Fremhævet i den endelige panel af den digitale zoom, kerner var mærket i DAPI, og MCC'er blev opdaget baseret på en antisense riboprobe designet til at genkende odf3b, hvor antistoffer til γ-tubulin betegne de basale organer og α-tubulin betegner cilierne. I den digitale zoom af den sammensatte overlay angiver den gule stiplede cirkel omkredsen af et MCC, der blev identificeret på grund af besiddelse af odf3b udskrifter, flere basal organer og cilia. Mono-ciliated nabocellen, mærket med en gul stiplede cirkel, var identificeret, baseret på fænotype besidder en enkelt basal krop og en enkelt cilium.
Figur 1: skematisk af eksperimentelle rutediagram. Dette rutediagram viser en eksperimentel arbejdsproces, ledsaget af illustrationer af kritiske faser, hvor snefnug angiver kolde inkubation, de tre buede linjer repræsenterer varme, og uret repræsenterer lang inkubationstid gange. Arbejdsprocessen kan udføres i minimum 6 dage (Se Dagnummer i øverste højre hjørne af hver fase i processen), men nogle trin kan udføres over længere perioder, som det fremgår af protokollen. En detaljeret skildring af montering proces er trukket ud, viser den endelige monterede embryo hale mellem glas dias og coverslip. En sort stiplet boks skitserer det område, der er afbildet på 60 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentant resultat til at visualisere MCCs af zebrafisk pronephros. Maksimale billede fremskrivninger af en 24 hpf vildtype zebrafisk embryo på 60 X forstørrelse samt en digital zoom på Konfokal på 60 X forstørrelse af samme embryonet. De hvide felter angiver området fokuseret på til zoom. Enkelte pletter af DAPI (kerner), odf3b (MCCs), γ-tubulin (basal organer) og α-tubulin (cilier) er markeret og derefter flettes sammen i de to nederste paneler. I den digitale zoom, vi leverer tilnærmelser lokationernes celler som følger: et MCC er skitseret af den stiplede gul cirkel, og den stiplede gul cirkel skitserer en mono-ciliated celle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet ovenfor er optimeret til mærkning MCC'er i pronephros med odf3b afskrifter og α-tubulin i 24 hpf zebrafisk embryoner. For de bedste resultater anbefales det at bruge frisk fast og forberedt embryoner. Embryoner, der er blevet fast og gemt i enten MeOH eller Hyb + ved-20 ° C i længere end en uge kan bruges, men sandsynligheden for uønsket baggrund farvning stiger med det tidspunkt, hvor embryonerne opbevares i opbevaring.
Ændringer og fejlfinding af denne teknik er nødvendige for at tilpasse denne metode for andre suites særlige markører, fx andre antisense riboprobes og andre antistoffer. Mange metoder til at justere parametrene for trin ved at hele mount i situ hybridisering har været tidligere dokumenteret af vores gruppe og andre31,34,36,38, 39. Ligeledes hvert protein antistof vil kræve nogle fejlfinding i form af farvning gange, og omtrentlige intervaller af fortyndinger og inkuberingstider for hver primære antistof skønnes bedst ved evaluering af dokumenterede resultater28, 35. for embryoner yngre end 24 hpf, pK behandling bør være kortere end 2 min, hvor embryoner ældre end 24 hpf bør behandles med pK i længere tid end 2 min. Også, embryoner ældre end 24 hpf bør blive bleget af pigment før pK behandling.
Efter farvning med fluorescerende Farvningsopløsningen, er det kritisk at fjerne eventuelle resterende farvning, antistof og peroxidases ved at udføre serien af methanol og hydrogenperoxid vasker. PBS vasker umiddelbart efter er afgørende for at fjerne overskydende metanol fra embryoner. Vigtigere, før du fortsætter med hvis antistoffer, har vi fundet, at acetone og deioniseret vand vasker gøre embryoner mindre tilbøjelige til at overholde hinanden og/eller centrifugeglas. I vores erfaring, antistoffer for bestemte transkriptionsfaktorer og andre gener, selvom de kan arbejde effektivt Western blotting, virker ikke godt for hvis i zebrafisk. Dog fungerer særdeles velbevarede, og rigelige proteiner, såsom α-tubulin og β-catenin, godt i zebrafisk for hvis16,37.
Med fisk er det muligt at visualisere RNA udskrifter af gener, der endnu ikke har specifikke antistoffer i zebrafisk. Ved at kombinere fisk med hvis, som det fremgår af denne protokol, kan Co lokalisering af RNA udskrifter og protein være set i vivo (figur 2). Fleksibiliteten i protokollen giver mulighed for hurtig fejlfinding for visualisering af forskellige RNA udskrifter og proteiner i mange væv og tidspunkter. Når det kombineres med de allerede respekterede træk af zebrafisk embryoner, giver denne protokol af fisk + hvis et andet værktøj til at udforske udtryk af gener og proteiner vigtigt at udviklingsmæssige pathway forordning.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet i en del af tilskuddet R01DK100237 til R.A.W. og feltet National Science Foundation Graduate Research Fellowship. DGE-1313583 til A.N.M. Vi takker også College af videnskab sommer Undergraduate Research Fellowship Program for støtte til M.U. Vi vil gerne takke centeret for zebrafisk forskning ved University of Notre Dame for deres dedikeret pleje af vores zebrafisk. Vi vil også gerne takke Biologisk Institut samt medlemmerne af vores lab for alle deres støtte og værdifulde indsigter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
| E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
| embryo dishes | VWR | 351029 | |
| 5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
| disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
| 10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
| 1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
| methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
| flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
| hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
| hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
| 20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
| blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
| maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
| anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
| Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
| molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
| acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
| monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
| anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
| odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
| NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
| Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
| confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
| rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
- Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
- Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18 (2007).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
- Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
- Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
- Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
- Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
- Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
- Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
- Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
- Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
- Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
- Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
- Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
- Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
- Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
- Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
- Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
- Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
- Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060 (2013).
- Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
- Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604 (2014).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063 (2014).
