Summary
속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.
Abstract
최근 몇 년 동안, zebrafish 태아 배아 개발 utero 전 및 광학 투명도 같은 특성으로 인해 개발 생물학 공부를 인기 모델로 떠오르고 있다. 특히, zebrafish 태아 척추 신장 organogenesis multiciliated 셀 (MCC) 개발 공부 하는 중요 한 유기 체 되고있다. 배아 zebrafish 신장에서 MCCs를 시각화, 우리 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)의 결합 된 프로토콜을 개발 했습니다 하 고 전체 고해상도 이미징 수 있도록 면역 형광 (IF)를 탑재. 이 원고 공동 다양 한 혈통 요소의 표현을 통해 발달 프로그램의 규칙을 이해 하는 도구로 서 RNA 사본 및 단백질을 지역화 우리의 기술을 설명 합니다.
Introduction
지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 개발 생물학을 공부 하는 주요 모델 생물으로 떠오르고 있다. 태아는 어머니 이상으로 개발 하 고 광학 투명. 또한, 눈, 신장, 개 등 중요 한 장기의 형성, 그냥 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된 구조와 발생 합니다. 중요 한 것은, zebrafish 게놈이 포유류1,2,3높은 보존 된다. 또한, 제 브라와 포유류 장기 비슷한 해부학과 생리학 있다. 제 브라 미 발달 신장, 또는 pronephros, 초기 nephrogenesis 및 척추 nephron4, 의 보존된 상피 세포 인구의 운명 결정 하는 동안 유전자 기능을 조사 하기 위한 모델 시스템의 값을 보여 줍니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 마찬가지로, zebrafish 태아 MCCs11,12,13,,1415, 의 그렇습니다 검사에 점점 더 중요 해지고 있다 16 , 17.
그들의 이름에서 알 수 있듯이, Mcc는 상피 세포 꼭대기 표면17에 있는 운동 속눈썹의 특징 이다. Zebrafish에서 MCCs 유체 흐름에서 작동 하 고 24 hpf11,12,,1314, "salt-and-pepper"는 pronephros의 각 nephron의 중간에 걸쳐 패션에 분산 되어 있는 15 , 16 , 17. 비록 그들은 단지 한 줌에 지적 되었습니다 인간 신장의 질병 케이스18,,1920,21, MCCs 두뇌 같은 다른 포유류 조직에서 유행 하 고 기관22,23,24, 실험 설계에 대 한 도전의 호스트 포즈는. Zebrafish를 포함 한 다양 한 척추 동물 모델에서 우아한 연구 노치 신호 전달 경로 고객 센터 개발12,,1725 의 억제제로 보존된 통로 MCC 운명의 증명 ,2627. 따라서, zebrafish pronephros MCC 개발 vivo에서11,12,,1314, 의 유전 메커니즘을 연구 하 쉽게 접근할 수 있는 모델 제공 15 , 16 , 17.
투명성과 zebrafish 태아의 쉬운 유전자 조작 입증 귀중 한 특성 세포 운명, 조직 성장, 및 초기 배아1,2 개발 유전과 분자 경로 공부를 할 때 ,3. 현장에서 교 잡 등 전체 마운트 경우 단백질 및 유전자 내용은 시각화에 적용 되었고 zebrafish16,,2829에 대 한 최적화를, 전통적인 기법으로 30,31,32,33,34,35,36,,3738. 물고기와 IF에 대 한 인기 있는 프로토콜을 결합 하 여 레이블 및 Mcc vivo에서16,28,,3738분석 하 가능 하다.
Protocol
다음 프로토콜 사용 zebrafish 성인 Zebrafish의 Notre Dame 대학에서 연구를 위한 센터에 의해를 걱정 하 고 유지 합니다. Zebrafish 성인 및 태아에 대 한 모든 방법은 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 배아 고정
- Zebrafish 태아 앞에서 설명한 방법39,40을 사용 하 여 수집 합니다. 24 hpf, 배아에 E3에 일반적인 효소 혼합물 해결책 (50 mg/mL)의 500 µ L 상 온 (RT) 품 요리를 추가.
- 배아는 chorion의 돌발을 시작, 일단 태아 요리에서 모든 액체를 제거 합니다.
- E 3의 약 20 mL를 추가 하 고, 부드럽게 접시에는 E3 소용돌이 다음 액체 폐기물 용기에 액체를 decanting 여 2-3 회 신선한 E3와 배아를 씻어.
- 수정 하기 전에 배아를 안락사는 e 3에 0.2 %tricaine 2 개 mL를 추가 합니다.
- 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 5 mL 유리 유리병에 배아를 전송 합니다. 배아는 유리병의 바닥에 정착 후는 피 펫을 사용 하 여 tricaine/E3 솔루션의 대부분을 제거 합니다.
- 4 %paraformaldehyde (PFA)의 5 mL와 함께 동요 없이 RT에 2-4 h 24 hpf 배아 수정.
주의: PFA 독성 하 고 연구원 눈 보호, 장갑, 그리고 실험실 외 투를 착용 하는 동안 화학 후드 PFA 솔루션을 처리 해야 합니다. 입자가 굵은 PFA 파우더 PFA 정착 액의 준비 입자가 굵은 PFA 정전기를 통해 분산 경향으로 우수한 치료와 함께 수행 되어야 한다.
참고: 배아 4% PFA 4 ° c.에 하룻밤 사이에서 고칠 수 있다 준비 4 %PFA 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 종 x 1 지속적으로 해결책을 교 반 하면서가 열 하 여 완전히 입자가 굵은 PFA 해산. 일단 솔루션은 실시간, PFA는 0.45 μ m 진공 여과 위한 일회용 시스템을 통해 그것을 전달 하 여 살 균 필터 4% 아래로 다시 냉각 후 및 저장-20 ° c.에 대 한 15 mL 또는 50 mL 부분으로 aliquoted - 4 제거 %PFA 및 1 X 인산 염 버퍼와 두 번 세척 배아 0.1% 식 염 수 트윈-20 (PBST)에서 실시간 실시간 추가 5 mL 신선한 100%에서 100% 메탄올 (MeOH)의 5 mL로 한 번 태아를 씻어 MeOH 배아를 고 적어도 20 분 동안-20 ° C에서 품 어.
참고: 배아는 100%에 저장할 수 있습니다 MeOH 배아 준비를 위한 준비까지-20 ° C에서.
2. 태아 준비와 교 잡
- 50%의 5 mL에 한번 세척 하 여 배아를 rehydrate MeOH 1에서 30%의 5 ml에서는 배아를 세척 하 여 실시간 계속 재에서 5 분 동안 x PBST 1에서 MeOH 실시간에 5 분 동안 x PBST 1의 5 mL에 배아를 씻어 5 분 각각에 대해 두 번 x PBST 실시간
- 1에서 1:1,000 가수분해 K의 솔루션 (pK) (10mg/mL) 5 mL에 그들을 배양 하 여 배아를 permeabilize 실시간에서 2 분 x PBST
그러나 참고: 이전 배아 수 있습니다 알을 품을 5 mg/mL 및 외피의 농도 시간 2 분 미만, 위에 명시 된 pK 농도에서 2 분 24 미만 태아에 대 한 제안 보다 더 이상 hpf. - PK 솔루션 및 세척 즉시에 1 x PBST 실시간에 두번 수정 배아 4%의 5 mL의 5 mL을 제거 PFA RT 적어도 20 분 동안에.
참고: 배아 4% PFA 4 ° c.에 하룻밤 사이에서 고칠 수 있다 - PFA 및 세척 두 번에 1의 5 mL을 제거에서 실시간 x PBST
- 1의 5 mL에 배아를 전송 평면 바닥 microcentrifuge 튜브 x PBST microcentrifuge 선반에 각 배아와 후속 교 잡 솔루션 간의 상호 작용을 촉진 하는 RT에 똑바로 배치.
- 신선한 Hyb + 실시간 추가 1.5 mL에서 교 잡 솔루션 (Hyb +)의 1.5 mL에 두 번 배아를 세척 하 고 4-6 h 동안 교 잡 오븐에서 70 ° C에 태아를 품 어.
- 프로브 솔루션의 볼륨의 Hyb + 1.5 mL를 바꿉니다 (10 µ L RNA 프로브/500 µ L Hyb +)는 배아를 완벽 하 게 커버 하기에 충분.
참고: 음성 antisense RNA 프로브를 사용 하 여 이전에 설명한 방법39합성. - 동요 하지 않고 microcentrifuge 랙에 위치 개별 관 직으로 70 ° C에서 교 잡 오븐에서 밤새 조사를 교배.
3. 뜨거운 세척 및 차단
참고: 뜨거운 세척 배아에 적절 한 솔루션을 추가 하 고 다음 70 ° c.에서 교 잡 오븐에 잠복기에 의해 수행 됩니다. 70 ° C에 세척 솔루션을 지키려고 장소 50 mL 튜브 각 솔루션의 교 잡 오븐 때 프로브 / Hyb + 혼합물 추가 됩니다.
- 프로브를 제거 합니다. 20-30 분 각 염-나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼 x 50 %formamide / 2의 1.5 mL에서 70 ° C에서 두 번 배아를 씻어.
참고: 프로브-20 ° C에서 Hyb +에 저장 되며 나중에 다시 사용 될 수 있습니다. - 2의 1.5 mL에서 70 ° C에서 배아를 한 번 씻어 15 분에 대 한 x SSC 20-30 분 각 0.2 X SSC의 1.5 mL에서 70 ° C에서 두 번 배아를 씻어. 차단 시 약의 1.5 mL와 바꾸기 0.2 x SSC 및 4 ° c.에서 밤새 품 어
참고: 그것은 하룻밤 대신 4 h에 대 한 실시간에 차단 시 품 어 수 있습니다.
4. 항 체 외피와 Maleic 산 버퍼 세척
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
- 1:1,000의 비율로 차단 시에 반대로 DIG-포드의 0.2 mL 차단 시 약 교체 및 3 h 호 일 또는 실시간에 다른 빛 차단 커버 아래에 품 어
참고: 또는, 항 체 수 품 어 하룻밤에 4 ° c. - 3 h 후 배아를 maleic 산 2-4 회 10-15 분 각 실시간 품 배아 1.5 ml 신선한 maleic 산 버퍼의 4 ° C에서 하룻밤에 대 한 버퍼의 1.5 ml에서 씻으십시오.
참고: 그것은 하룻밤 사이, maleic 산 버퍼에서 품 어 필요가 없습니다 하지만 하 고 이렇게 조사 배경 감소.
5. 프로브 탐지 및 과산화 효소의 제거
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
- Maleic 산 버퍼를 제거 하 고 1x PBS의 1.5 mL를 바꿉니다. 실시간에서 60 분에 대 한 솔루션을 얼룩이 지기 형광 5 분 동안 각각 0.2 mL에 실시간 품 배아에서 Cy3의 1 x PBS의 1.5 mL에 두 번 배아를 씻어
참고: 보육 시간 다른 프로브에 대 한 달라질 수 있습니다. - RT에서 10 분에 대 한 1 X PBS에 다음 %MeOH 1.5 mL를 한번 배아를 세척: 30 %MeOH, 50% 75 %MeOH 100% MeOH MeOH.
- RT에서 10 분의 1 x PBS에 다음 MeOH 솔루션의 1.5 mL를 한번 배아 실시간 세척에서 30 분 동안 MeOH에 1% H2O2 의 1.5 mL와 함께 태아를 품 어: 75 %MeOH, 50 %MeOH, 및 30 %MeOH. 1 x PBS의 1.5 ml에서 RT에서 5 분 동안 두 번 배아를 씻어.
참고: 배아에에서 저장할 수 있습니다 PBS 하룻밤에 4 ° c.
6입니다. 면역 형광 검사
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
- DdH2O 5 분의 1.5 ml 배아 실시간 세척에 미리 냉장된 아세톤 (-20 ° C에서 보관 하는)의 1.5 ml 배아 한 세척 실시간에서 7 분 1.5에 한번 배아 실시간 세척에 배아 ddH2O 5 분의 1.5 mL에 한 번 세척 1 mL 실시간 5 분의 1 %DMSO (PBDT)와 x PBST
- 2 시간에 대 한 실시간에 로커에 PBDT + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 1.5 mL에 태아를 품 어.
- PBDT + FBS를 제거 하 고 기본 항 체, 안티 acetylated tubulin (마우스에서 생산) 및 안티-γ-tubulin (토끼에서 생산), 함께 1:400 PBDT + 1%에 희석의 1.5 mL를 바꿉니다 FBS. 밤새 4 ° c.에 태아를 품 어
참고: 보육 시간 1 차 항 체에 따라 달라질 수 있습니다. 다른 시간 간격의 테스트 라벨 최적화를 해야 수 있습니다.
7. 이차 항 체
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
- FBS + 로커에 RT에 1 분 동안 0.1 M NaCl 배아에서 초과 언바운드 항 체를 제거 하려면 PBDT + 1%의 1.5 ml에서 씻으십시오.
- 배아를 씻어 PBDT + 1%의 1.5 mL에 5 번 FBS + 실시간에 로커에 각 30 분 0.1 M NaCl 배아에에서 씻어 1.5 mL PBDT + 1 %FBS 로커에 RT에서 30 분.
- 이차 항 체의 200 µ L에 4 ° C에서 하룻밤 태아를 품 어 알 렉 사 488 염소 반대로 마우스 IgG와 알 렉 사 647 염소-토끼 IgG, 1: 500에 PBDT에 함께 희석.
8. DAPI 얼룩
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
- 워시 배아 신속 하 게 RT에서 PBDT의 1.5 mL에 두 번. PBDT DAPI의 1.5 mL, 희석 1:15000 1 X PBST에 고는 로커에 RT에서 15 분을 품 어.
- 1.5 ml PDBT + 1%의 배아를 씻어 FBS + 0.1 M NaCl 3 번 15-20 분에 대 한 실시간에. 마운트 및 이미지 준비가 될 때까지 4 ° C에서 PBDT의 1.5 mL에 배아를 저장 합니다.
9. 장착 및 Zebrafish Pronephros 이미지
- 작은 볼륨, PBDT의 약 10 µ L에에서 유리 슬라이드에 누워 태아 측면.
- 한 켤레 미세 집게는 머리를 제거 하 고 노 른 자 공의 일부와 눈 뒤에 배아를 짠 다.
- 미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 긁어 떨어진 태아 몸에서 남은 노 른 자 공. 얇은 티슈로 슬라이드에서 천연된 노 른 자 및 여분 액체를 제거 합니다.
- 미디어는 태아의 나머지 꼬리를 장착 한 방울을 추가 하 고 위치는 꼬리 옆으로 누워. 샘플, 병합 다음 커버 슬라이드 상자에 꼬리 위에 coverslip을 놓습니다.
- 신장 속눈썹에 다음과 같은 채널을 사용 하 여 confocal 현미경 60 배 확대에 이미지: 파란색에서 DAPI (408.0 설정 레이저 nm), 녹색에서 FITC (488.0 설정 레이저 nm), Cy3 염료-표시 된 빨간색에서 (561.0 설정 레이저 nm), 및 흰색에서 알 렉 사 680 (637.0 설정 레이저 nm).
Representative Results
야생-타입 zebrafish 태아 24 고정 hpf 바로 위에서 설명한 대로 준비 하 고. 그림 1 선택한 그림된 단계 함께 실험적인 워크플로 보여 줍니다. 1-8 단계에서 설명 하는 워크플로 샘플 조달, 고정, 및 면역 형광 라벨 protein(s) 관심의 뒤 센스 riboprobes와 생 성적표를 고정된 조직의 조작의 과정을 포함 합니다. 워크플로의 단계 9 장착 및 이미징 zebrafish 배아 트렁크의 시각화를 최적화 하도록 특별히 설계 된 기술을 말합니다. 9 단계를 동반 하는 도면에서 우리 유리 슬라이드에 조직의 위치에 대 한 조작 방법을 설명 합니다. 이 단계에서 태아 머리와 노 른 자 볼 꼬리 옆으로 유리 슬라이드와 coverslip 사이 위치를 떠나 제거 됩니다. 노 른 자 공과 헤드의 제거와 노 른 자 공 자동 fluoresces 장착 과정을 방해 pronephros, 거주 고객 센터 인구 최고의 이미징에 대 한 제안입니다.
Confocal 현미경을 사용 하 여 얻은 대표 이미지 그림 2, 60 X 확대 같은 야생-타입 배아와 동일한 배율에서 디지털 줌 표시에 제공 됩니다. 상위 패널 아래쪽 두 패널은 이러한 이미지 데이터의 복합 오버레이 각 개별 채널의 이미지를 제공 합니다. (왼쪽된 열 이미지)에서 백색 상자 영역을 디지털 줌 (오른쪽 이미지)의 초점을 설명 합니다. 디지털 줌의 마지막 패널에 강조 표시, 핵, DAPI에서 표시 했다 그리고 MCCs odf3b, γ-tubulin에 항 체 나타내는 기초 시체와 α-tubulin는 속눈썹을 인식 하도록 하는 센스 riboprobe에 따라 감지 했다. 복합 오버레이의 디지털 줌에서 노란색 점선된 원 odf3b 성적표, 여러 기초, 몸과 속눈썹의 소유로 인해 확인 된 MCC의 경계를 나타냅니다. 노란 점선 동그라미 표시 된 인접 한 모노 ciliated 셀 단일 기초 신체 및 단일 cilium의 표현 형에 따라 확인 되었다.
그림 1: 실험 순서도의 도식. 이 중요 한 단계는 눈송이 차가운 외피를 나타냅니다의 삽화 동반 순서도 실험적인 워크플로 보여줍니다, 3 개의 곡선된 라인 열, 나타내고 시계 긴 부 화 시간을 나타냅니다. 프로토콜에서 설명한 것 처럼 오랜 시간 동안 어떤 단계를 수행할 수 있습니다 있지만 최소 6 일 (과정에서 각 단계의 숫자 오른쪽 상단 모서리에 참조)에 워크플로 수행할 수 있습니다. 설치 과정의 상세한 묘사, 유리 슬라이드와 coverslip 최종 탑재 된 배아 꼬리를 보여주는 그려집니다. 검은 점선된 박스 60 X 배율에서 이미지 영역을 설명 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 zebrafish pronephros MCCs를 시각화에 대 한 결과. 최대 이미지 확대 뿐만 아니라 같은 태아의 60 배 확대에 confocal에 디지털 줌 X 60 24 hpf 야생-타입 zebrafish 태아의 예측. 흰색 상자 확대/축소에 대 한 초점 영역을 나타냅니다. DAPI (핵), odf3b (MCCs), γ-tubulin (기초 기관), 및 α-tubulin (속눈썹)의 개별 얼룩 표시 되며 하단 2 패널에 함께 병합 다음. 디지털 줌에서 우리 같이 셀 위치의 근사를 제공: MCC 점선 노란색 원으로 개설 하 고 점선된 노란색 원 설명 모노 ciliated 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
위의 상세한 프로토콜 pronephros odf3b 성적표와 α-tubulin 24 hpf zebrafish 태아에 있는 MCCs를 라벨에 대 한 최적화 됩니다. 최상의 결과 얻으려면 갓 고정 하 고 준비 된 배아를 사용 하는 것이 좋습니다. 고정 되어 MeOH 또는 Hyb + 1 주 이상-20 ° C에서 저장 된 배아 배아 저장소에 유지 됩니다 시간 증가 얼룩 원치 않는 배경의 확률만 사용할 수 있습니다.
수정 및이 기술의 문제 해결 특정 마커, 예를 들어 다른 센스 riboprobes 및 다른 항 체의 다른 제품군에 대 한이 메서드를 조정할 필요가 있습니다. 전체 산 현장에서 교 잡 과정 단계 매개 변수를 조정 하기 위한 많은 방법이 있다 이전 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해31,,3436,38, 문서화 39. 마찬가지로, 각 단백질 항 체 얼룩이 번, 측면에서 몇 가지 문제 해결 필요 합니다 하 고 희석 및 보육 시간 각 1 차 항 체에 대 한 대략적인 범위는 최고의 문서화 된 결과28, 의 평가 의해 추정 35. 24 미만 태아에 대 한 hpf, pK 치료 2 분 보다 짧은 있어야 어디 24 보다 오래 된 배아 hpf pK 2 분 이상 대우 되어야 한다. 또한, 24 보다 더 오래 된 배아 hpf pK 치료 하기 전에 안료의 표백 한다.
형광 성 얼룩 솔루션 얼룩 후 메탄올과 과산화 수소 세척의 시리즈를 수행 하 여 모든 나머지 얼룩, 항 체, 및 peroxidases를 제거 하는 중요 한 이다. 바로 다음 PBS 세척은 배아에서 초과 메탄올을 제거 하는 중요 한. 만약 항 체를 계속 하기 전에 중요 한 것은, 우리는 그 아세톤 및 이온된 수 세척 배아 서로 또는 원심 분리기 튜브 준수 하 게 발견 했다. 우리의 경험, 특정 전사 인자와 다른 유전자에 대 한 항 체에 그들은에서 효율적으로 일할 수 있습니다 비록 서양 지우고에서 zebrafish에 경우에 잘 작동 하지 않습니다. 그러나, 매우 보존 하 고 풍부한 단백질, tubulin α 및 β-catenin 같은 경우16,37제 브라에서 잘 작동지 않습니다.
물고기, 그것 되지 않은 아직 특정 항 체는 제 브라에서 유전자의 RNA 사본을 시각화 가능 하다. 경우 물고기를 결합해 서,이 프로토콜에 의해 증명으로 볼 vivo에서 (그림 2) RNA 사본 및 단백질의 공동 지역화 될 수 있습니다. 프로토콜의 유연한 특성 다양 한 RNA 사본 및 수많은 조직 및 시간 포인트에서 단백질의 시각화에 대 한 빠른 문제 해결 수 있습니다. Zebrafish 태아의 이미 존경 받는 특성 결합, 생선 + IF이이 프로토콜 유전자와 단백질 중요 한의 식을 발달 통로 규제를 탐험 다른 도구를 제공 합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 원시와 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 제를 부여 R01DK100237에 의해 부분적으로 지원 A.N.M. DGE-1313583 우리는 또한 대학의 과학 여름 학부 연구 친교 프로그램 M.U. 지원 위한 감사 합니다. 우리는 Zebrafish의 Notre Dame 대학 우리의 zebrafish의 전용된 그들의 관리에 대 한 연구는 센터를 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 생물 학적 과학의 부서 뿐만 아니라 그들의 지원 및 중요 한 통찰력의 모든 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
| E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
| embryo dishes | VWR | 351029 | |
| 5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
| disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
| 10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
| 1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
| methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
| flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
| hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
| hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
| 20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
| blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
| maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
| anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
| Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
| molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
| acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
| monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
| anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
| odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
| NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
| Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
| confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
| rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |
References
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- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
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