Summary
Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.
Abstract
Nos últimos anos, o embrião de zebrafish tem emergido como um modelo popular para estudar a biologia do desenvolvimento, devido a características como ex utero desenvolvimento do embrião e transparência óptica. Em particular, o embrião de zebrafish tornou-se um organismo importante estudar organogênese de vertebrados nos rins, bem como desenvolvimento de célula multiciliated (MCC). Para visualizar as MCCs no rim embrionário zebrafish, temos desenvolvido um protocolo combinado de hibridação toda montagem fluorescente em situ (FISH) e montar toda a imunofluorescência (IF) que permite a geração de imagens de alta resolução. Este manuscrito descreve nossa técnica para localização de transcritos de RNA e proteína co como uma ferramenta para entender melhor o Regulamento dos programas de desenvolvimento através da expressão de vários fatores de linhagem.
Introduction
Ao longo das últimas décadas, o peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um organismo modelo principal para estudar a biologia do desenvolvimento. Os embriões desenvolvem-se fora da mãe e são opticamente transparentes. Além disso, ocorre a formação de órgãos vitais como o olho, rim e cérebro anterior rapidamente, com estruturas formadas por apenas 24h pós fertilização (hpf). Importante, o genoma de zebrafish é altamente conservado com mamíferos1,2,3. Além disso, o zebrafish e órgãos de mamíferos têm anatomia e fisiologia similares. O zebrafish rim embrionário, ou pronephros, demonstra o valor do sistema modelo para examinar a função dos genes durante a nephrogenesis precoce e determinação do destino das populações de células epiteliais conservada do néfron vertebrados4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. da mesma forma, o embrião de zebrafish tornou-se cada vez mais importante ao analisar a ontogenia dos MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Como seu nome sugere, MCCs são células epiteliais, caracterizadas por um conjunto de cílios motile localizado sobre a superfície apical17. No zebrafish, MCCs funcionam no fluxo de fluido em são dispersos em um "sal e pimenta" como a moda em todo o meio de cada néfron do pronephros por 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. embora eles só foram anotados em um punhado de rim humano doença casos,18,19,20,21, MCCs são predominantes em outros tecidos de mamíferos como o cérebro e traqueia22,23,24, que apresenta uma série de desafios para o projeto experimental. Estudos elegantes em vários modelos de vertebrados, incluindo o zebrafish demonstraram uma via conservada do destino do MCC, com o entalhe de sinalização via como inibidor da MCC desenvolvimento12,17,25 ,26,,27. Portanto, o zebrafish pronephros fornece um modelo facilmente acessível para estudar os mecanismos genéticos de MCC desenvolvimento na vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparência e fácil manipulação genética de embriões de zebrafish provaram para ser inestimáveis traços ao estudar as vias genéticas e moleculares que regulam o destino da célula, crescimento do tecido e o desenvolvimento do início embrião1,2 ,3. Como tais, as técnicas tradicionais Visualizar transcrições da proteína e do gene, tais como a hibridação in situ e toda montagem se, tem sido aplicado a e otimizado para o zebrafish16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Combinando protocolos populares para peixe e se, é possível rotular e analisar MCCs na vivo16,28,37,38.
Protocol
O seguinte protocolo usa adultos zebrafish mantido e cuidadas pelo centro para a pesquisa de Zebrafish na Universidade de Notre Dame. Todos os métodos para trabalhar com embriões e zebrafish adultos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal.
1. o embrião fixação
- Colete embriões zebrafish usando métodos anteriormente descritos39,40. Em 24 hpf, adicionar 500 µ l de solução de mistura de protease específico (50 mg/mL) para a E3 em um embrião prato incubar à temperatura ambiente (RT).
- Uma vez que os embriões começam a fugir do cório, remova todo o líquido do prato embrião.
- Lave os embriões 2 - 3 vezes com E3 fresco adicionando cerca de 20 mL de E3, agitando suavemente o E3 no prato, e então, decantando o líquido para um recipiente de resíduos líquido.
- Para abater os embriões antes de corrigir, adicione 2 mL de metanosulfonato de 0,2% para o E3.
- Transferi os embriões em um frasco de vidro de 5 mL usando uma pipeta Pasteur de plástico. Remova a maioria da solução tricaina/E3 usando a pipeta, depois que os embriões se instalaram no fundo do frasco.
- Correção 24 embriões hpf com 5 mL de paraformaldeído 4% (PFA) para 2-4 h em RT, sem agitação.
Cuidado: PFA é tóxico e soluções PFA devem ser tratadas sob uma capa de química enquanto o pesquisador está vestindo um jaleco, luvas e óculos de proteção. Preparação do fixador PFA do pó granulado de PFA deve ser executada com cuidados excepcionais, como o PFA granulado tende a se dispersar através de carga estática.
Nota: Os embriões podem corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C. Preparar 4% PFA por aquecimento de 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) para ferver, agitando continuamente a solução para dissolver completamente o PFA granulado. Uma vez que a solução tenha arrefecido até RT, os 4% PFA é filtro esterilizado por passagem através de um sistema descartável de 0,45 µm para filtragem do vácuo, então e aliquotadas em porções de 15 mL ou 50 mL de armazenamento-20 ° c. - Remova os 4% PFA e embriões de lavar duas vezes com 1 tamponada de fosfato X salina com 0.1% Tween-20 (PBST) no RT. lavar os embriões uma vez com 5 mL de 100% de metanol (MeOH) no RT. adicionar 5 mL de fresco 100% MeOH para os embriões e incubar a-20 º C pelo menos 20 min.
Nota: Os embriões podem ser armazenados em 100% MeOH a-20 ° C até que esteja pronto para a preparação do embrião.
2. hibridação e preparação do embrião
- Hidratar os embriões por lavar uma vez em 5 mL de 50% MeOH em 1 x PBST durante 5 min à reidratação RT. Continue lavando os embriões em 5 mL de 30% MeOH em 1 x PBST por 5 min em RT. lavar os embriões em 5 mL de 1 x PBST duas vezes por 5 min à RT.
- Permeabilize os embriões incubando-os em 5 mL de uma solução de 1:1,000 de proteinase K (pK) (10 mg/mL) em 1 x PBST por 2 min em RT
Nota: Os embriões mais velhos podem ser incubados mais do que 2 min na concentração pK acima referida, no entanto, uma concentração de 5 mg/mL e incubação tempo menos de 2 min é sugerido para embriões mais jovens do que 24 hpf. - Remover pK solução e lave imediatamente em 5 mL de 1x PBST duas vezes em RT. fixar os embriões em 5 mL de 4% PFA em RT pelo menos 20 min.
Nota: Os embriões podem corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C. - Remover o PFA e lavar duas vezes em 5 mL de 1 x PBST em RT
- Transferência de embriões em 5 mL de 1 x PBST para tubos de fundo plano microcentrifuga colocados em pé em um rack de microcentrifuga em RT para facilitar interações entre cada embrião e a solução de hibridação subsequentes.
- Lave os embriões duas vezes em 1,5 mL de solução de hibridação (Hyb +) em RT. adicionar 1,5 mL de fresco Hyb + e incubar embriões a 70 ° C em um forno de hibridização para 4-6 h.
- Substituir a 1,5 mL de Hyb + com um volume de solução de sonda (10 µ l do RNA sonda/500 µ l Hyb +) suficiente para cobrir completamente os embriões.
Nota: Sintetiza antisentido sonda RNA usando anteriormente descritos métodos39. - Cruzar a sonda durante a noite em estufa a 70 ° C hibridação com a verticalidade de tubos individuais posicionados no rack microcentrifuga, sem tremer.
3. hot lavagens e bloqueio
Nota: Lava quente é executadas, colocando a solução adequada sobre os embriões e então incubar em estufa a 70 ° C. hibridação Para manter as soluções de lavagem a 70 ° C, coloque os tubos de 50 mL de cada solução no forno hibridação quando a sonda / Hyb + mistura é adicionada.
- Retire a sonda. Lave os embriões duas vezes a 70 ° C, em 1,5 mL de 50% formamida/2x buffer de solução salina-citrato de sódio (SSC) para 20-30 min cada.
Nota: A sonda pode ser armazenada Hyb + a-20 ° C e re-utilizada em uma data posterior. - Lave os embriões, uma vez, a 70 ° C em 1,5 mL de 2 x SSC de 15 min. Lave os embriões duas vezes a 70 ° C, em 1,5 mL de 0,2 X SSC para 20-30 min cada. Substitua 0.2 x SSC com 1,5 mL de reagente de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C.
Nota: É possível incubar bloqueio reagente em RT para 4 h em vez de durante a noite.
4. anticorpo incubação e lavagens tampão de ácido maleico
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
- Substituir o reagente de bloqueio com 0,2 mL de anti-DIG-POD em bloqueio reagente na proporção de 1:1,000 e incubar durante 3 h sob a folha ou outra cobertura de bloqueio de luz no RT
Nota: Como alternativa, o anticorpo pode incubar durante a noite a 4 ° C. - Após 3h, lave os embriões em 1,5 mL de tampão de ácido maleico, 2 - 4 vezes por 10-15 min cada em RT. Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C em 1,5 mL de tampão de fresco ácido maleico.
Nota: Não é necessário incubar durante uma noite em tampão de ácido maleico, mas fazendo assim diminui a sonda fundo.
5. sonda deteção e remoção de Peroxidase
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
- Retire o tampão de ácido maleico e substitua com 1,5 mL de 1X PBS. Lave os embriões duas vezes em 1,5 mL de 1X PBS durante 5 min cada à RT. Incubar embriões em 0,2 mL de Cy3 fluorescente coloração solução por 60 min em RT
Nota: O tempo de incubação pode variar para diferentes sondas. - Lave os embriões uma vez com 1,5 mL da seguinte porcentagem MeOH em 1X PBS durante 10 minutos a RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH e 100% MeOH.
- Incubar os embriões com 1,5 mL de 1% H2O2 em MeOH por 30 min em RT. Wash os embriões uma vez com 1,5 mL das seguintes soluções MeOH em 1X PBS durante 10 minutos a RT: 75% MeOH, 50% MeOH e 30% MeOH. Lave os embriões duas vezes por 5 min cada a RT em 1,5 mL de 1X PBS.
Nota: Os embriões podem ser armazenados em PBS durante a noite a 4° C.
6. imunofluorescência
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
- Lave os embriões em 1,5 mL de DDQ2O por 5 min em RT. Wash os embriões em 1,5 mL de acetona pre-refrigerada (mantida a-20 ° C) para 7 min em RT. lavar os embriões, uma vez em 1,5 mL de DDQ2O por 5 min em RT. Wash os embriões, uma vez em 1.5 mL de 1 x PBST com 1% DMSO (PBDT) durante 5 min à RT
- Incube os embriões em 1,5 mL de PBDT + 10% de soro fetal bovino (FBS) sobre um roqueiro em RT para 2h.
- Remover PBDT + FBS e substituir com 1,5 mL de anticorpos primários, antiacetilado tubulina (produzido a partir do mouse) e anti-γ-tubulina (produzido a partir de coelho), diluída-se juntos em 1: 400 em PBDT + 1% FBS. Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C.
Nota: Tempos de incubação podem variar dependendo do anticorpo primário. Teste de intervalos de tempo diferentes pode ser necessário para otimizar a rotulagem.
7. secundário anticorpo
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
- Para remover o excesso anticorpo desacoplado de embriões, lavar em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl por 1 min em RT sobre um roqueiro.
- Lave os embriões 5 vezes em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl por 30 min em uma cadeira de balanço em RT. lava os embriões em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS por 30 min em RT sobre um roqueiro.
- Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C, em 200 µ l dos anticorpos secundários, Alexa 488 cabra anti-rato IgG e Alexa 647 cabra anti-IgG de coelho, diluída juntos em PBDT no 1: 500.
8. DAPI coloração
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
- Lave os embriões rapidamente a RT em 1,5 mL de PBDT duas vezes. Substituir PBDT com 1,5 mL de DAPI, dilui-se 1:15000 em 1 X de PBST e incubar 15 min em RT sobre um roqueiro.
- Lave os embriões em 1,5 mL de PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl três vezes em RT para 15-20 min cada. Armazenar os embriões em 1,5 mL de PBDT a 4 ° C até que esteja pronto para montagem e imagem.
9. montagem e imagens para Pronephros de Zebrafish
- Lateral do embrião leigos na lâmina de vidro em um pequeno volume, cerca de 10 µ l, de PBDT.
- Esprema o embrião atrás dos olhos com um par de pinças bem para remover a cabeça e alguns da esfera de gema.
- Use a pinça fina para raspar suavemente a bola gema restante do corpo do embrião. Retire a gema dissociada e líquido extra do slide com um tecido fino.
- Adicionar uma gota de mídia para a restante de cauda do embrião de montagem e posicione de modo que a cauda é colocada lateralmente. Coloque uma lamela em cima da cauda para achatar a amostra e, em seguida, coloque em uma caixa de slides coberto.
- Cílios de rim na ampliação de X 60 em um microscópio confocal, usando os seguintes canais de imagem: DAPI em azul (conjunto no 408.0 a laser nm), FITC em verde (conjunto no 488.0 a laser nm), Cy3 tingir-etiquetados em vermelho (laser conjunto no 561.0 nm) e Alexa 680 em branco (conjunto no 637.0 a laser nm).
Representative Results
Zebrafish do selvagem-tipo embriões foram fixados em 24 hpf e imediatamente preparado como descrito acima. Figura 1 mostra um fluxo de trabalho experimental juntamente com fases ilustrados selecionados. O fluxo de trabalho descrito nas etapas 1-8 engloba os processos de aquisição de amostra, fixação e manipulação do tecido fixo para rotular transcrições endógenas com antisentido riboprobes seguido por imunofluorescência para rótulo somáticas de interesse. Etapa 9 do fluxo de trabalho refere-se a montagem imagem e técnicas desenvolvidas especificamente para otimizar a visualização do tronco embrionárias zebrafish. Nos desenhos que acompanham a etapa 9, ilustraremos o método de manipulação para posicionamento do tecido em uma lâmina de vidro. Nesta etapa, a bola de cabeça e gema de embrião são removidos, deixando a cauda deve ser posicionado lateralmente entre uma lâmina de vidro e lamela. Remoção de gema bola de cabeça é sugerida para a melhor imagem da população residente de MCC no pronephros, como a bola de gema autofluorescente e obstruir o processo de montagem.
Obtidos usando um microscópio confocal de imagens representativas são fornecidas na Figura 2, que mostra o mesmo embrião do selvagem-tipo ampliação de 60 X e um zoom digital com a mesma ampliação. Os painéis superiores fornecem imagens de cada canal individual, enquanto os parte inferior dois painéis são a composto sobreposição destes dados de imagem. Caixa branca (na imagem da coluna da esquerda) descreve a área que é o foco do zoom digital (a imagem da coluna da direita). Destaque no painel final do zoom digital, núcleos foram rotulados em DAPI e MCCs foram detectados com base em um riboprobe antisentido projetado para reconhecer odf3b, onde os anticorpos de γ-tubulina denotam os corpos basais e α-tubulina denota os cílios. O zoom digital da sobreposição composto, o círculo amarelo tracejado indica o perímetro de uma MCC, que foi identificada devido a posse de transcrições de odf3b , vários corpos basais e cílios. Célula adjacente mono-ciliadas, marcada com um círculo pontilhado amarelo, foi identificada baseia o fenótipo de possuir um único corpo basal e um único cílio.
Figura 1: esquemático do fluxograma experimental. Este fluxograma mostra um fluxo de trabalho experimental, acompanhados de ilustrações de estágios críticos em que o floco de neve indica incubação fria, as três linhas curvas representam o calor e o relógio representa tempos de incubação longa. O fluxo de trabalho pode ser executado em um mínimo de 6 dias (número de dias no canto superior direito de cada fase do processo), embora algumas etapas podem ser executadas durante períodos de tempo mais longos, como observado no protocolo. Uma descrição detalhada do processo de montagem é retirada, demonstrando a cauda do embrião montado final entre a lâmina de vidro e lamela. Uma preta caixa tracejada descreve a área que é fotografada na ampliação de X 60. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representante resultados para poder visualizar MCCs de pronephros o zebrafish. Projeções de imagem máxima de um embrião de zebrafish do selvagem-tipo 24 hpf em 60 X de ampliação, bem como sobre a ampliação de 60 X do embrião mesmo confocal, um zoom digital. As caixas brancas indicam a área voltada para o zoom. Manchas individuais de DAPI (núcleos), odf3b (MCC), γ-tubulina (corpos basais) e α-tubulina (cílios) são etiquetadas e então fundiram-se os painéis de fundo dois. O zoom digital, nós fornecemos aproximações dos locais de célula como segue: um MCC é descrito pelo tracejado círculo amarelo, e o círculo pontilhado amarelo descreve uma célula mono-ciliadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo detalhado acima é otimizado para a rotulagem MCCs na pronephros com transcrições de odf3b e α-tubulina em 24 embriões de zebrafish hpf. Para os melhores resultados, é recomendável usar embriões recém fixos e preparados. Os embriões que foram fixados e armazenados em MeOH ou Hyb + a-20 ° C por mais de uma semana podem ser usados, mas a probabilidade de fundo indesejado coloração aumenta com o tempo que os embriões são mantidos no armazenamento.
Modificações e solução de problemas desta técnica são necessários para adaptar esse método para outros conjuntos de marcadores particulares, por exemplo, outros riboprobes antisentido e outros anticorpos. Muitos métodos para ajustar os parâmetros das etapas no processo de hibridação de toda montagem in situ têm sido documentadas anteriormente pelo nosso grupo e outros31,34,36,38, 39. Da mesma forma, cada anticorpo da proteína vai exigir um pouco de solução de problemas em termos de coloração vezes e intervalos aproximados de diluições e tempos de incubação para cada anticorpo primário são melhor estimados pela avaliação de resultados documentados28, 35. para embriões mais jovens do que 24 hpf, tratamento de pK deve ser inferior a 2 min, onde mais de 24 embriões hpf deve ser tratados com pK por mais de 2 min. Além disso, os embriões mais velhos do que 24 hpf deve ser branqueada de pigmento antes do tratamento de pK.
Após a coloração com a solução de coloração fluorescente, é fundamental para remover qualquer mancha remanescente, anticorpo e peroxidases, realizando a série de lavagens de metanol e água oxigenada. As lavagens de PBS imediatamente a seguir são vitais para remover o metanol em excesso de embriões. Importante, antes de prosseguir com os anticorpos se, encontramos que a acetona e água desionizada lavagens fazem os menos propensos a aderir a um outro e/ou os tubos de centrífuga de embriões. Em nossa experiência, anticorpos para fatores de transcrição específicos e outros genes, embora eles podem trabalhar eficientemente borrões ocidentais, não funcionam bem pelo IF o zebrafish. No entanto, proteínas altamente conservadas e abundantes, como α-tubulina e β-catenina, funcionam bem no zebrafish para se16,37.
Com peixes, é possível visualizar os transcritos de RNA de genes que ainda não tem anticorpos específicos no zebrafish. Combinando peixes com se, como demonstrado pelo presente protocolo, localização co de transcritos de RNA e proteína pode ser visto na vivo (Figura 2). A natureza flexível do protocolo permite a rápida resolução de problemas para a visualização de diversas transcrições de RNA e proteínas em diversos tecidos e pontos de tempo. Quando combinado com os traços já respeitados de embriões de peixe-zebra, este protocolo de peixe + se oferece outra ferramenta para explorar a expressão dos genes e proteínas importantes para o Regulamento do caminho do desenvolvimento.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pela subvenção R01DK100237 para RAW e o não nacional ciência Fundação pós-graduação Research Fellowship. DGE-1313583 para A.N.M. Agradecemos também a faculdade de ciência graduação pesquisa Fellowship programa de verão para suporte para Magal Gostaríamos de agradecer o centro Zebrafish pesquisa na Universidade de Notre Dame para seus cuidados dedicado de nosso zebrafish. Também gostaríamos de agradecer o departamento de ciências biológicas, bem como os membros do nosso laboratório para todos de apoio e informações valiosas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
| E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
| embryo dishes | VWR | 351029 | |
| 5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
| disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
| 10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
| 1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
| methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
| flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
| hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
| hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
| 20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
| blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
| maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
| anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
| Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
| molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
| acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
| monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
| anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
| odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
| NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
| Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
| confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
| rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
- Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
- Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18 (2007).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
- Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
- Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
- Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
- Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
- Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
- Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
- Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
- Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
- Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
- Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
- Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
- Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
- Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
- Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
- Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
- Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
- Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060 (2013).
- Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
- Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604 (2014).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063 (2014).
