Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische Hamsters door Pronuclear injectie van het Complex van de CRISPR/Cas9

Published: January 9, 2018 doi: 10.3791/56263
* These authors contributed equally

Summary

Pronuclear (PN) injectie van de geclusterde interspaced regelmatig korte palindromische herhaalt (CRISPR) en CRISPR-geassocieerde proteïne-9 nuclease (CRISPR/Cas9)-systeem is een zeer efficiënte methode voor de productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische hamsters. Hierin beschrijven we het gedetailleerde PN injectie protocol voor de productie van gene knockout hamsters met het systeem CRISPR/Cas9.

Abstract

De pronuclear (PN) injectietechniek werd opgericht in muizen te introduceren van buitenlandse genetische materiaal in de pronuclei van één-cel fase embryo's. Het geïntroduceerde genetisch materiaal kan integreren in het embryonaal genoom en genereren van transgene dieren met buitenlandse genetische informatie na overdracht van de geïnjecteerde embryo's ter bevordering van de moeders. Na het succes in muizen, PN injectie met succes is toegepast in vele andere diersoorten. Onlangs, PN injectie heeft met succes gewerkt om reagentia bij het wijzigen van gen activiteiten, zoals het systeem van de CRISPR/Cas9, boerderij diersoorten te bereiken site-specific genetische modificaties in verschillende laboratorium. Naast het beheersen van de speciale set van microinjection vaardigheden voor de productie van genetisch gemodificeerde dieren door PN injectie, moeten onderzoekers begrijpen de Fysiologie van de voortplanting en het gedrag van de doelsoort, omdat elke soort uniek presenteert uitdagingen. Bijvoorbeeld, gouden Syrische hamster embryo's hebben unieke behandeling eisen in vitro zodat PN injectie technieken niet mogelijk in deze soort tot recente doorbraken van onze fractie waren. Met onze soorten gemodificeerde PN injectie protocol, is het gelukt in het produceren van verschillende gene knock-out, (KO) en knockin (KI) hamsters, die met succes zijn gebruikt om ziekten van de mens van het model. Hier beschrijven we de PN injectie procedure voor het uitbrengen van de CRISPR/Cas9-complex aan de zygoten van de hamster, het embryo behandeling voorwaarden, embryo transfer procedures en veeteelt nodig voor de productie van genetisch gemodificeerde hamsters.

Introduction

De gouden goudhamster (Mesocricetus auratus) is één van de meest gebruikte knaagdieren voor biomedisch onderzoek. Volgens het Amerikaanse ministerie van landbouw, werden ongeveer 100.000 hamsters gebruikt in de Verenigde Staten in 2015, 13% van totale laboratorium dierlijke gebruik onder de soorten die vallen door de Animal Welfare Act (http://www.aphis.usda.gov; toegankelijk 10 maart, 2017).

De hamster biedt diverse voordelen ten opzichte van andere knaagdieren in de studie van een aantal ziekten bij de mens. Bijvoorbeeld, de alvleesklier ductaal adenocarcinomas histopathologisch onderzoek van N-nitrosobis(2-oxopropyl) amine (BOP) geïnduceerde in hamster is vergelijkbaar met menselijke alvleesklier tumoren, terwijl BOP behandeling voornamelijk induceert tumoren van de schildklier bij ratten en longen en lever tumoren in muizen1. Omdat hamsters het slechts kleine knaagdier gevonden zijn ter ondersteuning van de replicatie van adenovirussen, zijn ze ook het model van de keuze voor het testen van adenovirus gebaseerde oncolytische vectoren en anti-adenovirus drugs2,3,4. Een ander voorbeeld waarin de hamster-model een voordeel ten opzichte van muizen en ratten biedt is in de studie van hyperlipidemie. Mens en hamsters vertonen grote overeenkomsten in lipide stofwisselingsroutes en beide soorten dragen het gen cholesteryl ester transfer proteïne (CETP), die een centrale rol in lipide stofwisseling speelt, terwijl CETP is afwezig in muizen en ratten5codering. Daarnaast ontwikkelen hamsters hemorragische ziekte meer representatief zijn voor de menselijke manifestatie na blootstelling aan Ebola virus6. Hamsters zijn ook de modellen van keuze voor de studie van atherosclerose7, mondelinge carcinomen8en inflammatoire myopathieën9. Onlangs, ook is gebleken dat de hamsters zeer gevoelig voor infectie met een macrovirus Andes zijn en hantavirus syndroom-achtige longziekte ontwikkelen, die het alleen knaagdieren model van Andes virus infectie10.

Om aan te pakken onvervulde behoefte aan nieuwe genetische dierlijke modellen om te bestuderen van de menselijke ziekten waar geen betrouwbare kleine knaagdieren model beschikbaar is, wij onlangs geslaagd bij de toepassing van de CRISPR/Cas9-systeem op de hamster en hebben verscheidene lijnen van genetisch gemanipuleerde hamsters11. Hamster zygoten zijn zeer gevoelig voor milieu milieus, zodanig dat de PN injectie protocollen ontwikkeld in andere soorten ongeschikt zijn. Daarom ontwikkelden we een PN injectie protocol voor de hamster dat geschikt is voor de speciale vereisten voor het afhandelen van de hamster embryo's in vitro. Hier beschrijven we de gedetailleerde PN injectie procedure met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem en de bijbehorende stappen, van de voorbereiding van enkele gids RNA (sgRNA) voor de overdracht van de geïnjecteerde embryo's in ontvangende vrouwtjes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De in dit protocol beschreven procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Utah State University (IACUC protocol: 2484). Hamsters gebruikt in dit protocol zijn volwassen (6-10 weken oud) LVG stam gouden Syrische hamsters. Alle hamsters zijn ondergebracht in het vivarium bij het Bioinnovation center, Utah State University. Kamertemperatuur is ingesteld bij 23 ° C, luchtvochtigheid is ingesteld op 40-50% en lichte cyclus ligt 14L: 10 d (licht: donker). Indien mogelijk, moeten embryo manipulatie en surugical procedures worden uitgevoerd met steriele technieken.

1. sgRNA en Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) voorbereiding

  1. Synthetiseren sgRNAs na de in vitro transcriptie procedures die worden beschreven in de handleiding van synthese kit (materialen tabel, Supplement 1).
  2. Te monteren ribonucleoproteins, Meng 2 µg Cas9 met 1 microgram van sgRNA en Incubeer de mix bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten. Zorg voor PN injectie, een werkende oplossing op de concentratie van 100 ng/µL Cas9 en 50 ng/µL sgRNA met 10 mM TE buffer (RNase gratis, Materialen tabel).

2. vasectomie voorbereiding

Opmerking: Vasectomie wordt uitgevoerd op mannelijke hamsters op 6-8 weken oud. De operatie zou worden uitgevoerd 10-14 dagen vóór de eerste paring. Steriliteit wordt bevestigd door mislukte zwangerschappen van paring met vruchtbare vrouwtjes. Vasectomized mannen kunnen normaal gesproken worden gebruikt voor een jaar voordat ze minder seksueel actief worden.

  1. Anesthetize mannen door intraperitoneaal (i.p.) injectie van ketamine/xylazine met een dosis van 40 mg/kg (ketamine) en 10 mg/kg (xylazine). Bevestig verdoving door gebrek aan een pedaal reflex (Teen snuifje).
  2. Leg de ingetogen hamster in dorsale lighouding op een droge tissue papier. Spoel de buik met drie ronden van antiseptische behandelingen door afwisselend chirurgische scrub oplossingen tussen 70% alcohol en Povidon-jodium.
  3. Maak een verticale insnijding met chirurgische schaar vanaf 1,5 cm cranial aan de voorhuid zich uitstrekt van 1 cm aan elke kant van mid lijn (Figuur 1a). Incise van de huid, subcutaan weefsel en linea alba voor toegang tot de peritoneale ruimte (Figuur 1b).
  4. Zachte druk uitoefenen op de caudal aspect van het scrotum te dwingen de testes en vetweefsel uit. Pak de zaadleiders zachtjes met een tang en zorgvuldig het bloedvat van de vas te scheiden met een tweede set van verlostang (Figuur 1 c).
  5. Houd de zaadleiders met pincet te vormen van een lus. Verwarm het uiteinde van een andere verlostang in vlam totdat het is rood, en gebruik vervolgens het verwijderen van de lus van de zaadleiders. Invoegen van vetweefsel en teelballen terug naar de buik. Verwijder de zaadleiders aan de tegengestelde kant met dezelfde procedures.
  6. Sutuur (geologie) de spiermassa eerst door de huid wordt gevolgd. Plaats het dier op een warme pad in een kooi voor 30 min tot het dier zich herstelt. Observeer het dier totdat het normale activiteit hervat.

3. donor/ontvanger Hamster voorbereiding schema

  1. Monitor en record Oestrische cycli.
    Opmerking: Vrouwelijke hamsters hebben een stabiele 4-daags oestrische cyclus die onmiddellijk na de bevalling wordt bijgehouden. Vrouwtjes op de eerste dag van Oestrische kunnen worden geïdentificeerd door het ondoorzichtige, gelige en plakkerig vaginale afscheiding (Figuur 2a). Vrouwtjes op dag 4 van Oestrische kunnen worden geïdentificeerd door het transparant, kleverig slijm (Figuur 2b).
  2. Voor superovulatie van donor hamster, superovulate de geslachtsrijpe vrouwtjes (> 6 weken) op de eerste dag van de oestrische cyclus door IP-injectie van zwangere merrie serum gonadotrofinen (PMSG; opgeloste in PBS als 50 IU/mL) (tabel 1) tussen 9 - 12u.
    Opmerking: PMSG is voor inducerende superovulatie maar niet voor oestrische cyclus synchronisatie.
  3. 80 - 84 uur na de injectie van PMSG (dag 4, 6-8 PM), plaats de vrouwtjes in kooien met mannetjes voor een paring. Zoals hamster verparingen niet leiden copulatie tot pluggen, zorgen voor succesvolle verparingen door de verparingen kijken.
  4. Voorbereiden pseudopregnant vrouwtjes door de paring geslachtsrijpe vrouwtjes op dag 4 van Oestrische met vasectomized mannetjes. Het tijdschema voor de voorbereiding van donor en ontvanger vrouwtjes staan in tabel 2.
    Opmerking: True zwangere vrouwtjes kunnen ook worden gebruikt als geadresseerden, dat wil zeggen, vrouwen met een jas-kleur te onderscheiden van de gouden kleur gematteerd met dezelfde kleur vruchtbare mannetjes. Pups, embryotransfer afgeleid kunnen worden geïdentificeerd op basis van de kleuren van de vacht. Een potentiële voordeel bij het gebruik van echte zwangere vrouwtjes is dat endogeen geproduceerde embryo's zou zorgen voor succesvolle zwangerschappen en PN geïnjecteerd embryo's helpen aan het implantaat; een mogelijk nadeel bij het gebruik van echte zwangere vrouwtjes als ontvangers is dat PN geïnjecteerd embryo's moeten concurreren met endogeen embryo's voor inplanting geproduceerde.

4. de zygote isolatie

  1. Bereiden kweekmedium (HECM-9; recept is beschreven in Supplement 2), zoals eerder is beschreven in McKiernan en Bavister12.
  2. Een dag voorafgaand aan PN injectie, bereiden zygote behandeling gerechten (25 µL/drop) en een PN injectie neerzetten (100 µL) in het deksel van de schotel van een 35 mm met HECM-9. Dan dekken de middellange druppels met minerale olie. Evenwicht medium in een incubator's nachts onder de volgende voorwaarden: 37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 en 100% luchtvochtigheid.
  3. Op de dag gepland voor PN injectie, embryo Afboekingsmethode gerechten (1 schotel/donor hamster) met HECM-9 bereiden en bewaren van alle gerechten in de incubator tot gebruik.
  4. Euthanaseren superovulated hamsters met CO2.
  5. Oviduct isolatie
    1. Plaats een euthanized vrouwelijke hamster in dorsale lighouding op een chirurgische draperen of papieren zakdoekje en voorbereiden van de buik met een spray van 70% ethanol.
    2. Stevig huid en buikspier laag houden op de middellijn en maak een incisie. Incise van het buikvlies blootstellen van de buikorganen.
    3. Een van de baarmoeder horens vatten met een fijne pincet en intrekken van het weefsel van de buik. De baarmoeder te scheiden van het mesometrium en vet weefsel. Maken een cut tussen het oviduct en eierstok en een tweede snede grenzend aan de kruising van de oviduct en baarmoeder (een klein deel van de baarmoeder). Plaats de twee oviducts in dezelfde flush schotel.
  6. Leegmaken en verzamelen zygoten
    1. Onder de Microscoop dissectie, begrijpen van de kant van de baarmoeder hoorn met een #5 Dumont pincet en invoegen van een zelfgemaakte naald (Figuur 3) in het lumen van het oviduct vanaf het infundibular einde en het oviduct met 300-400 µL van HECM-9 medium flush.
    2. Verzamelen van de zygoten onmiddellijk en was ze tweemaal met HECM-9 medium in de behandeling schotel. In dit stadium van ontwikkeling, moet alle van de zygoten worden denuded uit cumulus cellen.
    3. Plaats de zygoten in een incubator (37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 en 100% vochtigheid) onmiddellijk na het verzamelen om te minimaliseren van de blootstelling aan licht.

5. PN injectie

  1. Ontdooi de Cas9/sgRNA-RNP op ijs en handhaven van het complex op het ijs tijdens het hele proces van PN injectie.
  2. Laden van de naalden van de injectie met Cas9/sgRNA RNP oplossing onmiddellijk vóór de injectie-experimenten. Plaats van het achterste uiteinde van de injectie naalden in de buis met de Cas9/sgRNA RNP-oplossing en laat de oplossing van de Cas9/sgRNA RNP te vullen de naald door capillaire werking.
  3. Bereiden de injectie schotel en naalden. Vul de houder pipet met minerale olie voor binnen ~ 3 mm van de bocht van de naald van de houder. Schakel de houder in de microinjector met het topje van de naald horizontaal ten opzichte van de onderkant van de schotel en vul het puntje van de naald met medium door afzuigen. Stel de injectie naald onder een hoek van 10-15° tegengesteld aan de houder.
  4. PN injectie
    1. Een zygote identificeren en een fijne afzuigen met de naald van de houder. In het ideale geval zijn de mannelijke en vrouwelijke pronuclei binnen de dezelfde brandpuntbereik en uitgelijnde evenwijdig aan de houder.
    2. Doordringen de zona en mannelijke pronuclei (3 oclock ' toestand) met de naald van de injectie.
    3. De injectie naald snel te trekken zodra de pronucleus zwelt om te voorkomen dat de kern vast te houden aan de naald en om te voorkomen beschadiging van de pronucleus.

6. zygoten overbrengen naar Pseudopregnant Hamsters

  1. Anesthetize een pseudopregnant hamster (de zelfde manier zoals beschreven in de sectie vasectomie hierboven) en leg het op een chirurgische draperen of droge tissue papier in ventrale ligcomfort.
  2. Oog smeermiddelen toepassen door de ogen van het dier te voorkomen oog droogheid en betrekking hebben op het hoofd met een doek of papier te beschermen de ogen tegen licht. Het laterale aspect van het lichaam voor te bereiden door het scheren een over 4 x 4 cm huidgebied aan elke zijden van het lichaam, gevolgd door 3 keer van Povidon-jodium scrubs en 3 keer 70% ethanol struikvegetaties toe te passen. Maken een verticale incisie van 2 cm 2 cm caudal de laatste rib (zoals weergegeven in de figuren 4a, 4b) aan iedere kant van de achterkant van het dier.
  3. Pak het vet pad met een tang en trek voorzichtig totdat de oviduct en baarmoeder zichtbaar zijn. Klem het vet pad met een hemostats en het vet pad dorsally weerspiegelen over de wervelkolom (Figuur 4 c). Plaats het voortplantingskanaal zodanig dat de baarmoeder buis kan worden gepenetreerd met een naald 30 meter voor de embryotransfer (Figuur 4 d).
  4. Wassen van de geïnjecteerde zygoten met HECM-9 in een nieuwe schotel. Gebruik een nieuwe glazen pipet (diameter: ~ 150-200 µm) 10-15 zygoten laden. Schik de zygoten als een ketting van parels gevolgd door enkele luchtbellen. Plaats de pipet in de open gepenetreerd buis uit stap 6.3 en zachtjes blazen in de Pipet de zygoten overbrengen naar het oviduct. Blijven blazen tot de eerste luchtbel wordt vrijgegeven in het darmstelsel oviduct (figuur 4e).
  5. Laat het vet pad en het weefsel terug te keren naar de buik. Overbrengen (10-15) ongeveer evenveel van ingespoten embryo's een andere oviduct darmkanaal door dezelfde processen.
  6. Suture de spieren en de huid in 2 lagen. Buprenorfine-HCL (0,5 mg/kg) subcutaan beheren als postoperatieve analgesie. De hamster terugkomen in een kooi en plaats van de kooi op een warme pad voor herstel. Terug de kooi naar de dierlijke kamer wanneer het dier is volledig hersteld van de verdoving. Postoperatieve pijnstillers krijgen weer zes uur later.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De efficiëntie van het beschreven protocol in de productie van genetisch gemodificeerde hamsters hangt af van de uitkomsten van de volgende twee belangrijke stappen: het geboortecijfer van live voor geadresseerden vrouwtjes en het aantal levende pups met de beoogde genetische modificaties. Het geboortecijfer van live is een directe resultaten van de kwaliteit van de embryo's en de vaardigheid van het uitvoeren van de PN injectie en embryo transfer procedures individu. Om ervoor te zorgen dat het ontwikkelings potentieel van gemanipuleerde embryo's niet in gevaar komt, is grote zorgvuldigheid nodig tijdens de behandeling in vitro van de hamster embryo's. We bereiken regelmatig een live geboortecijfer van 60-80% met pseudopregnant ontvanger vrouwtjes. Tabel 3 toont live geboortecijfers uit het experiment van de knock-out RAG1 (pseudopregnant vrouwtjes werden gebruikt) en het experiment van de knock-out STAT2 (ware zwanger zwarte vrouwen werden gebruikt; live geboortecijfer was in dit geval berekend als de percentage van nesten geproduceerd golden pups).

Het percentage genetisch gemodificeerde pups geproduceerd uit PN geïnjecteerd embryo's, is afhankelijk van zowel de efficiëntie van sgRNA bij de invoering van microdeleties en de succesvolle injectie van de Cas9/sgRNA-ribonucleoproteins in de pronuclei. We vonden dat sgRNA efficiëntie van gene doelen (niet-gepubliceerde opmerkingen varieert). Zoals blijkt uit tabel 3, resulteerde de sgRNA ontworpen voor STAT2 in een gen gericht op efficiëntie van 88,9%, terwijl de sgRNA voor RAG1 alleen 28,6% efficiënt was. Figuur 5 biedt een voorbeeld van de genotypering resultaten van een PCR beperking fragment length polymorphism (PCR-RFLP) kwantitatieve analyse van pups uit RAG1 gentargeting. Het is belangrijk op te merken dat sommige microdeleties buiten de restrictie-enzym erkenning volgorde optreden kan, zodanig dat PCR-RFLP kan het onderschatten van het gen gericht op efficiëntie. Subcloning PCR producten in vectoren klonen TA gevolgd door Sanger sequencing van het PCR inserts zijn noodzakelijk nauwkeurig maatregel gene gericht op efficiëntie en de aard van microdeleties onthullen.

Figure 1
Figuur 1: Mannelijke Hamster vasectomie.
a) en b) maken van een verticale incisie van 2 cm vanaf 1,5 cm cranial aan de voorhuid uitbreiding van cranially; c) de vas eerbied scheiden van de bijbehorende testiculaire ader en slagader met twee paren van verlostang; d) de zaadleider vatten met een pincet te vormen een lus 1 cm. Verwarm een tweede reeks van verlostang en accijnzen van de lus terwijl gelijktijdig cauterizing van de uiteinden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: oestrische cyclus.
a) de vaginale lossing waargenomen op dag 1 is ondoorzichtig, gelige en kleverige b) de vaginale lossing waarneembare op dag 4 is duidelijk en plakkerig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Voorbereiding van de naald voor Embryo isolatie.
een) breuk van een naald 30 meter langs de rode lijn en de tip Pools totdat het is vlak en glad. b) maken een hoek van 30-40 ° op ~ 3 mm van het uiteinde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: De overdracht van de Zygote.
a) en b) maken een lange verticale incisie van 2 cm vanaf 2 cm caudal aan de laatste rib (rode lijn); c) klem van het vet pad met een Hemostats en weerspiegelen het weefsel dorsally; d) pas de positie van oviduct tractus en doordringen in een open met een 30 meter naald; e) regelen de zygoten als een ketting van parels binnen het embryo transfer glas Pipetteer en ze vervolgens overbrengen naar de oviduct uit de gepenetreerd open. Bar = 1, 000 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. PCR-RFLP Assay voor een één nest van oprichter dieren met RAG1 microdeleties. M: 1 Kb Plus ladder. WT: wild type. ID 1, 3 en 7 Toon Onbesneden band conform RAG1 microdeleties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Lichaamsgewicht (g) PMSG (IE) PMSG (ul)
< 110 10 200
110-135 15 300
135-160 20 400
160-185 25 500
> 185 30 600
PMSG, zwangere merrie serum gonadatropin

Tabel 1. PMSG doet overeenkomt met lichaam gewichten

Hamster Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag 5
Donor PMSG (9 - 12u) Paring (6-8 pm) Zygote isolatie (12-1 pm)
PN injectie (1-3 pm)
Ontvanger Paring (6-8 pm) Embryotransfer (3-5 pm)

Tabel 2. Tijdschema voor de voorbereiding van Donor/ontvanger

Genen Nr. Embryo's (Pups) Nr. Nesten (ontvangers) Nr. Positieve pups (%)
STAT2 229 (54) 14 (19) * 48 (88,9)
RAG1 77 (21) 3 (3) 6 (28,6)
* gematteerd met vruchtbare mannetjes vrouwtjes werden gebruikt; het aantal nesten aangegeven is alleen die geproduceerde golden pups.

Tabel 3. Efficiëntie van Gene Targeting in Golden Syrische Hamster door het systeem van Cas9/sgRNA

Aandoening/behandeling Vereisten Opmerkingen
Omgevingslicht Alle omgevingslicht uitschakelen Hamster embryo's zijn gevoelig voor licht, met name om te koelen licht
Licht tijdens de behandeling van de in vitro Minder dan 20 min. voor PN injectie Manipuleren van 15 embryo's per ronde lichte blootstelling te verminderen
Temperatuur Omgevingstemperatuur: 28±0.5 oC Hamster embryo's zijn gevoelig voor temperatuurschommelingen
Behandeling van temperatuur: 37.5 oC
Medium HECM-9 Sla niet meer dan 3 dagen
Cultuur voorwaarde 37,5 oC 10% CO2, 5% O2 en 100% vochtigheid Evenwichtige overnachting in incubator
Veehouderij na de embryotransfer Kooi niet wijzigen binnen 5 dagen vóór/na datum Ontvanger zal kannibaliseren pups als verstoord; bieden genoeg Voer/water

Tabel 4. Unieke vereisten op Hamster Embryo Handling en veehouderij

Supplement 1: sgRNA door GeneArt Precision synthese Kit synthetiseren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplement 2: Hamster Embryo kweekmedium-9 (HECM-9) recept. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om beter de mogelijkheden van gouden Syrische hamsters als modellen van ziekten bij de mens, ontwikkelden we een PN injectie protocol voor het leveren van een CRISPR/Cas9 complex te richten op het genoom van de hamster. Het protocol van de injectie PN optimaliseert verschillende belangrijke variabelen met inbegrip van het embryo kweekmedium, temperatuur en golflengten van licht13. Er zijn ook verschillende hamster-specifieke dierlijke omgang die volgen moeten voor het succesvol uitvoeren van gentargeting in de hamster. Bijvoorbeeld, hebben seksueel gerijpte vrouwelijke hamsters stabiele 4-daagse Oestrische cycli die niet kunnen worden gesynchroniseerd met exogene hormonen (bijvoorbeeld PMSG). Dus nauwkeurig bijhouden van de oestrische cycli van elke vrouw is belangrijk voor zowel de superovulatie en de voorbereiding van de pseudopregnancy. 30 - 60 zygoten kunnen worden geproduceerd uit een vrouw, als ze met succes superovulated. Om te bereiken superovulatie succesvol, is het noodzakelijk te overwegen van soortspecifieke afzetting van vet. Vrouwelijke hamsters, vooral die ouder zijn dan 12 weken leeftijd, de neiging om overmatig buikvet zodanig dat de naald van de spuit zodanig worden geplaatst dat correct ten volle doordringen van het vet pad bij het uitvoeren van hormoon injecties. We hebben gevonden dat penetratie halverwege in de peritoneale holte de juiste afstand voor hormoon levering bereikt. We samengevat de unieke vereisten voor PN injectie, hamster hanteren en veehouderij in tabel 4.

Voor PN injectie, moet het aantal embryo's overgebracht naar de injectie schotel voor elke ronde van de injectie experimenteel worden bepaald om te voorkomen dat uitgebreide injectie tijd. Hoe langer de tijd de embryo's blijven in de schaal, des te groter de kans dat zij overmatige blootstelling ervaren aan licht. Het is raadzaam om ongeveer 15 embryo's overbrengen naar de injectie schotel voor elke ronde van injecties. Dit nummer zorgt voor een goed evenwicht tussen het aantal rondes van injecties en de maximaal toelaatbare blootstelling van de embryo's aan het licht. Zoals de cytoplasmatische en pronuclear membranen van hamster embryo's allebei heel flexibel, moet aanzienlijke kracht worden toegepast op de naald van de injectie te doordringen van het membraan van de pronucleus. Gedurende deze tijd, moeten de pronuclei blijven binnen het brandpuntbereik.

Onderzoekers moeten overwegen de volgende chirurgische problemen bij het uitvoeren van overplanting. Ten eerste is het belangrijk dat de insnijdingen door de muur van het lichaam komen met de lichaamsgrootte van het dier overeen. Als de snede te klein is, kan dit resulteren in de extrusie van de zygoten van oviduct wanneer het voortplantingskanaal terug te keren naar de buik. Naast de grootte van de incisie, kan het potentieel voor extrusie van zygoten uit het oviduct geminimaliseerd worden door de behandeling van de bijbehorende vet pad in plaats van de juiste reproductieve weefsel. Met betrekking tot de grootte van de incisie is het ook belangrijk om te overwegen dat grotere insnijdingen kunnen leiden meer stress op het dier tot en een hogere kans op complicaties (bijvoorbeeld infectie dehiscentie vertonen). Ten tweede, u wilt minimaliseren bloeden, onderzoekers moeten zorgen om te voorkomen dat grote bloedvaten gebeuren bij het benaderen van de buik omdat teveel bloedverlies kan chirurgie stress verhogen te verminderen van het succes van de embryotransfer, en uit te breiden van de hersteltijd

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ZW heeft financiële belangen in Auratus Bio, LLC., een biotechnologiebedrijf gespecialiseerd in het maken van genetisch gemanipuleerde dieren voor biomedisch onderzoek en agrarische toepassingen.

Acknowledgments

Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de nationale instituten van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) van de National Institutes of Health onder het nummer 1R41OD021979 award (tot ZW) en door een onderzoek subsidie van de Next-Generation BioGreen 21 Programma, Republiek Korea, verlenen neen. PJ01107704 (tot ZW) en verlenen geen. PJ01107703 (naar IK). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health of BioGreen 21. Wij danken Dr Nikolas Robl voor het bewerken van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cas9 Invitrogen B25640 1 μg/μL (~6.1 μM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit Invitrogen A29377 For sgRNA synthesis
Albumin from human serum Sigma A1653 For cultivation medium
Illuminator Nikon NI-150 For embryo transfer
Incubator New Brunswick Galaxy 14S For embryo cultivation
Microforge Narishige PB-7 For making injection needles
Microscope Nikon ECLIPSE Ti-S For microinjection
Microscope invitrogen SMZ745T For embryo transfer
Mineral oil Sigma M1840 Keep in dark
PMSG Sigma G4877-2000IU For superovulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
  2. Wold, W. S., Toth, K. Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
  3. Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
  4. Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
  5. Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
  6. Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
  7. Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
  8. Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
  9. Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
  10. Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
  11. Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
  12. McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
  13. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).

Tags

Bioengineering kwestie 131 Pronuclear elektronische injectie CRISPR/Cas9 gene editing knockout zygote embryotransfer diermodel gouden Syrische hamster
Productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische Hamsters door Pronuclear injectie van het Complex van de CRISPR/Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, R., Miao, J., Fan, Z., Song, S., More

Li, R., Miao, J., Fan, Z., Song, S., Kong, I. k., Wang, Y., Wang, Z. Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex. J. Vis. Exp. (131), e56263, doi:10.3791/56263 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter