Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Производство генетически Золотой сирийских хомяков Pronuclear инъекции комплекса ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Published: January 9, 2018 doi: 10.3791/56263
* These authors contributed equally

Summary

Pronuclear (PN) инъекции кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) и ТРИФОСФАТЫ связанные белком-9 нуклеиназы (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) системы является весьма эффективным методом для производства генетически Золотой сирийских хомяков. Здесь мы описываем подробный протокол PN инъекции для производства хомяков Нокаут гена с системой ТРИФОСФАТЫ/Cas9.

Abstract

Pronuclear Техника инъекции (PN) был впервые создан в мышей внести иностранные генетических материалов в pronuclei один клеточной стадии эмбриона. Введено генетический материал может интегрироваться в геноме эмбриональных и создания трансгенных животных с иностранными генетической информации, после передачи вводят эмбрионов для содействия матерям. После успеха в мышей PN инъекции успешно применяется в многих других видов животных. Недавно, PN инъекции успешно проработал представить реагентов с ген изменение видов деятельности, например ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы, для достижения конкретных генетических модификаций в нескольких лабораторных и сельскохозяйственных животных. Наряду с овладением Специальный набор навыков микроинъекции производить генетически модифицированных животных путем инъекций PN, исследователи должны понимать воспроизводства физиологии и поведения целевых видов, потому что каждый вид представляет уникальный проблемы. Например, Золотой сирийского хомяка эмбрионы имеют уникальный обработки требований в пробирке , таким образом, что до последних открытий нашей группой PN инъекций методы были невозможны в этот вид. С нашей видов модифицированные PN инъекции протоколом нам удалось в производстве несколько Нокаут гена (KO) и knockin хомяков (KI), которые успешно используются для модели заболеваний человека. Здесь мы описываем процедуры инъекции PN для доставки комплекс Cas9 ТРИФОСФАТЫ зигот хомяка, эмбриона обработки условий, процедур передачи эмбриона, и животноводства, необходимых для производства генетически изменены хомяков.

Introduction

Золотой сирийского хомяка (Mesocricetus auratus) является одним из наиболее широко используемых грызунов для биомедицинских исследований. По данным Департамента сельского хозяйства США около 100,000 хомяков были использованы в Соединенных Штатах в 2015 году, составляет 13% всего лабораторных животных использования среди видов, охватываемых Закон о благосостоянии животных (http://www.aphis.usda.gov; доступ 10 марта 2017).

Хомяк предлагает несколько преимуществ по сравнению с другими грызунами в изучении ряда заболеваний человека. К примеру гистопатология N-nitrosobis(2-oxopropyl) Амин (ПБ) индуцированной поджелудочной железы протоковой аденокарциномы в хомяка похож на человека опухоли поджелудочной железы, в то время как лечение ПБ главным образом вызывает опухоли щитовидной железы у крыс и легких и печени в 1мышей. Потому что хомяков только небольшой грызун, найденных для поддержки репликации аденовирусы, они также являются модель выбора для тестирования на основе аденовирусной онколитического векторов и аденовирус анти наркотики2,3,4. Другой пример, где хомяк модель предлагает преимущество над мышей и крыс находится в исследовании гиперлипидемии. Люди и хомяков выставки большое сходство в липидной метаболических и обоих видов нести ген кодирования передачи белка (ПООППО), Эстер cholesteryl, который играет центральную роль в липидной метаболизмом, а ПООППО отсутствует у мышей и крыс5. Кроме того хомяков развивать геморрагическая болезнь более представительным человеческого проявления после контакта с вирусом Эбола6. Хомяков также являются модели выбора для изучения атеросклероза7, устные карциномы8и9воспалительных миопатий. Недавно также было продемонстрировано что хомяков очень восприимчивы к инфекции вируса Анд и хантавирусный легочный синдром как заболевание, предоставляя только грызунов модель Анд вирусной инфекции10.

Для решения неудовлетворенная потребность Роман генетических животных моделей для изучения заболеваний человека, где нет надежной малых грызунов модель доступна, мы недавно добились успеха в применении системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 хомяк и дали несколько линий генетически инженерии хомяков11. Хомяк зигот очень чувствительны к экологических средах, что протоколы инъекции PN, разработанных в других видов являются неподходящими. Таким образом мы разработали протокол PN инъекции для хомяка, который учитывает особые требования к обработке хомяка эмбрионов в пробирке. Здесь мы описываем подробные процедуры инъекции PN, с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы и сопутствующие шаги, от подготовки единого руководства РНК (sgRNA) для переноса эмбрионы вводят в получателей женщины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры, описанные в настоящем протоколе были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) государственного университета штата Юта (протокол IACUC: 2484). Хомяков, используемые в настоящем Протоколе взрослых (6-10 недель возраста) LVG штамма Золотой сирийских хомяков. Все хомяки размещены в виварий на биоинновация центр, Университет штата Юта. Комнатной температуре устанавливается при 23 ° C и влажности установлен на уровне 40-50% света цикл 14L: 10D (свет: темный). Всякий раз, когда это возможно, эмбриона манипуляции и surugical процедуры должны быть выполнены с стерильной технологии.

1. sgRNA и Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) подготовка

  1. Синтезировать sgRNAs после в vitro транскрипция процедуры, описанные в руководстве синтеза комплект (таблица материалов, дополнение 1).
  2. Чтобы собрать ribonucleoproteins, смешать 2 мкг Cas9 с 1 мкг sgRNA и инкубировать смеси при комнатной температуре за 10-15 мин. Для PN инъекций сделайте рабочего раствора в концентрации 100 нг/мкл Cas9 и 50 нг/мкл sgRNA с буфером TE 10 мм (РНКазы бесплатно, Таблица материалов).

2. вазэктомии подготовка

Примечание: Вазэктомия выполняется на мужской хомяков в возрасте 6-8 недель. Операции должны быть выполнены 10-14 дней до первого спаривания. Стерильность подтверждается неудачных беременностей от скрещивания с плодородной самок. Вазэктомии мужчины обычно может использоваться для год, прежде чем они становятся менее сексуально активными.

  1. Анестезировать мужчины впрыской внутрибрюшинного (и.п.) кетамина/Ксилазина доза-40 мг/кг (кетамин) и 10 мг/кг (Ксилазина). Подтвердите анестезии, отсутствие педали рефлекс (мыс сжатие).
  2. Положите седативных хомяка в спинной recumbency на сухую салфетку. Промыть живота с трех раундов антисептические лечения путем чередования хирургические скраб решений между 70% спирта и повидон йода.
  3. Сделайте вертикальный разрез с Ножницы хирургические, начиная с 1,5 см краниально к крайней плоти, расширяя 1 см с каждой стороны от середины линии (рис. 1a). Надрезать кожи, подкожной клетчатки и linea alba для доступа к перитонеального пространства (рис. 1b).
  4. Приложите нежное давление на хвостовой аспект мошонки может заставить яичек и жировой ткани из. Возьмите семявыносящих аккуратно пинцетом и тщательно отдельный сосуд от СОСТС с второй набор щипцов (рис. 1 c).
  5. Держите семявыносящих с щипцами в форме петли. Нагрейте кончик другой щипцами в пламени до тех пор, пока он горит красным, а затем использовать его для удаления цикла семявыносящих. Вставьте жировой ткани и яичках обратно в живот. Удаление семявыносящих на противоположной стороне с теми же процедурами.
  6. Шовные мускулатура, впервые после ушивания кожи. Поместите животное на теплые площадку в клетке за 30 мин до тех пор, пока животное восстанавливает. Наблюдать за животное, до тех пор, пока он возобновляет нормальную деятельность.

3. доноров/получателей помощи Hamster подготовке расписание

  1. Мониторинг и запись эстрального цикла.
    Примечание: Женский хомяков имеют стабильные 4-дневный эстральный цикл, который поддерживается сразу после родов. Самки в первый день эстрального может быть идентифицирован непрозрачный, желтоватые и липкие влагалища (рис. 2a). Самки на 4 день эстрального может быть идентифицирован прозрачный, липкой слизью (рис. 2b).
  2. Для суперовуляции доноров хомяка, superovulate половозрелых самок (> 6 недель) в первый день эстрального цикла IP инъекции гонадотропина сыворотки беременных Маре (ГСЖК; растворяют в PBS как 50 МЕ/мл) (Таблица 1) между 9-12 утра.
    Примечание: ГСЖК предназначен для стимулирования суперовуляции, но не для эстральный цикл синхронизации.
  3. 80 - 84 ч после инъекции ГСЖК (день 4, 6-8 вечера), место женщины в клетках с самцами для спаривания. Хомяк, который вязки не приводят к случке вилки, обеспечить успешные вязки, наблюдая вязки.
  4. Подготовьте pseudopregnant самок, спаривания половозрелых самок на 4 день эстрального с вазэктомии мужчины. График подготовки женщины доноров и получателей приведены в таблице 2.
    Примечание: Правда беременных также может использоваться как получателей, то есть, самки с пальто цвета отличимые от Золотой цвет матовый с же цвет плодородные мужчин. Щенков, производные от эмбриона могут быть определены на основании пальто цвета. Потенциальное преимущество в использовании верно беременных самок, что эндогенно производимых эмбрионов обеспечит успешные беременности и помочь эмбрионы вводят PN имплантировать; потенциальным недостатком в использовании верно беременных женщин как получателей является, что эмбрионы вводят PN необходимость конкурировать с эндогенно производимых эмбрионов для имплантации.

4. зигота изоляции

  1. Подготовка питательной среды (HECM-9; рецепт описан в дополнение 2), как описано ранее в Маккирнан и Bavister12.
  2. Один день до PN инъекции, подготовьте зиготы, обработка блюда (25 мкл/падение) и PN инъекции падение (100 мкл) в крышке 35 мм блюдо с HECM-9. Затем накройте среднего капель с минеральным маслом. Средний баланс в инкубаторе на ночь при следующих условиях: 37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 и влажности 100%.
  3. В день, запланированных для PN инъекций подготовить эмбриона промывки блюда (1 блюдо/доноров хомячок) с HECM-9 и хранить все блюда в инкубаторе до использования.
  4. Усыпить суперовулированных хомяков с CO2.
  5. Маточных труб изоляция
    1. Усыпленных женский хомяк в спинной recumbency на хирургические драпировка или папиросной бумаги и подготовить живота с спрей, этанол 70%.
    2. Твердо проводить кожи и мышц живота слоя на срединной и надрезают. Надрезать брюшины подвергать органов брюшной полости.
    3. Возьмите один из маточные рожки с тонкой щипцами и отозвать ткани от живота. Отдельно от mesometrium и жировой ткани матки. Сделайте разрез между маточных труб и яичников и второй сократить рядом с перекрестка маточных труб и матки (включают в себя небольшую часть матки). Место два яйцеводов в том же флеш блюдо.
  6. Потолочные и собирать зигот
    1. Под микроскопом рассечение понять стороне рога матки с щипцами Дюмон #5 и вставьте просвета маточных труб от конца вороноковидными домашнее иглы (рис. 3) и промойте маточных труб с 300-400 мкл HECM-9 средних.
    2. Собирать зигот немедленно и мыть их дважды с HECM-9 средних в обработке блюдо. На этой стадии развития все зигот следует зачищенное от кучевые клеток.
    3. Место зигот в инкубатор (37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 и 100% влажность) сразу же после сбора для сведения к минимуму воздействия на свет.

5. PN инъекций

  1. Оттепель RNP Cas9/sgRNA на льду и поддерживать комплекс на льду во время всего процесса впрыска PN.
  2. Загрузите инъекций иглами с Cas9/sgRNA RNP раствора непосредственно перед инъекции экспериментов. Место задней части инъекций иглами в пробирку, содержащую решение RNP Cas9/sgRNA и позволяют RNP Cas9/sgRNA решение для заполнения иглы капиллярных действий.
  3. Подготовьте инъекции блюдо и иглы. Заполните держатель пипетку с минеральным маслом для в течение ~ 3 мм загиба держателя иглы. Установите держатель в microinjector с кончика иглы горизонтальной нижней части блюдо и заполнить кончик иглы с среднего методом всасывания. Установите иглу на 10-15° угол противоположной держателя.
  4. PN-инъекций
    1. Идентифицировать зиготы и применить штраф всасывания с держателя иглы. В идеале мужские и женские pronuclei находятся в пределах же диапазон фокусных расстояний и соответствие параллельно держатель.
    2. Проникать zona и мужской pronuclei (позиции 3 часа) с инъекционной иглы.
    3. Быстро снять иглу после пронуклеусами набухает для предотвращения ядро от присоединения к иглы и избежать повреждения пронуклеусами.

6. зигот передачи Pseudopregnant хомяков

  1. Анестезировать pseudopregnant Хомяк (так же, как описано в разделе вазэктомии выше) и уложить его на хирургические драпировка или сухой оберточной бумаги в брюшную recumbency.
  2. Применение смазки глаз глаза животного, чтобы предотвратить сухость глаз и головы с помощью ткани или бумаги, чтобы защитить глаза от света. Подготовьте боковой аспект тела, для бритья около 4 x 4 см участок кожи по бокам тела следуют применения 3 раза повидон йод скрабы и 3 раза 70% этанол скрабы. Сделать 2 см вертикальный разрез 2 см хвостового последнего ребра (как показано в цифры 4a, 4b) на каждой стороне задней части животного.
  3. Возьмите жировой ткани с щипцами и осторожно потяните видны маточных труб и матки. Зажим жировой ткани с hemostats и отражают жировой ткани дорзально над позвоночника (рис. 4 c). Расположите репродуктивного тракта, таким образом, что маточные трубы могут быть проникли с 30 иглы для переноса эмбрионов (рис. 4 d).
  4. Вымойте вводят зигот с HECM-9 в новое блюдо. Использование новой стеклянной пипетки (диаметр: ~ 150-200 мкм) для загрузки зигот 10-15. Организовать зигот как цепь жемчуг, последовали несколько пузырьков воздуха. Вставьте трубки на открытых вторглись шага 6.3 пипетки и осторожно дуть в пипетку для передачи зигот маточных труб. По-прежнему дует до тех пор, пока первый воздушный пузырь освобождается в урочище маточных труб (фигуры 4e).
  5. Освободить жировой ткани и вернуть ткани в области живота. Передавать примерно такое же количество (10-15) вводят эмбрионов другой тракта маточных труб, те же процессы.
  6. Шовные мускулатуры и кожи в 2 слоя. Администрировать подкожно бупренорфин-HCL (0,5 мг/кг) как послеоперационное обезболивание. Вернуться к клетке хомяка и поместить клетку на теплые площадку для восстановления. Возвращение клетки животных комнате, когда животное полностью оправился от анестезии. Послеоперационное анальгетиков даны снова в шесть часов спустя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты следующих двух критических этапов зависит эффективность описанных протокола в производстве генетически модифицированных хомяков: коэффициент рождаемости получателей самок и количество живых детенышей с предполагаемых генетических модификаций. Коэффициент рождаемости является прямым результаты качества эмбрионов и мастерство PN инъекций и процедуры передачи эмбриона человека. Чтобы гарантировать, что потенциал развития манипулировать эмбрионов не скомпрометирован, большую осторожность необходима во время обработки в пробирке эмбрионы хомяка. Мы регулярно достигнуть коэффициент рождаемости составляет 60-80% с pseudopregnant получателей самок. Таблица 3 иллюстрирует live рождаемости от RAG1 нокаут эксперимент (pseudopregnant самок были использованы) и STAT2 нокаут эксперимент (истинный черный беременных были использованы; коэффициент рождаемости в этом случае была рассчитана как процент помета производится Золотой щенков).

Процент генетически модифицированных щенков, производится из эмбрионы вводят PN зависит эффективность внедрения indels и успешного введения Cas9/sgRNA ribonucleoproteins в pronuclei sgRNA. Мы обнаружили, что sgRNA эффективность варьируется среди целевых генов (неопубликованные наблюдения). Как показано в таблице 3, sgRNA, предназначенные для STAT2 привели к ген ориентации эффективность 88,9%, в то время как sgRNA для RAG1 был только 28,6% эффективной. Рисунок 5 предоставляет пример генотипирования результатов от PCR ограничения фрагмент длина полиморфизма (ПЦР-ПДРФ) assay щенков от RAG1 гена ориентации. Важно отметить, что некоторые indels могут возникать за пределами последовательности признание энзима ограничения, таким образом, что ПЦР-ПДРФ могут недооценивать гена, эффективность таргетинга. Subcloning продукты PCR в TA клонирования векторов следуют Сэнгер последовательности ПЦР вставок необходимо точно мера гена ориентации эффективность и выявить характер indels.

Figure 1
Рисунок 1: Мужской хомяка вазэктомии.
) и b) сделать вертикальный разрез 2 см, начиная с 1,5 см краниально к крайней плоти, расширяя краниально; c) отдельных СОСТС почтение от связанного яичка Вены и артерии с двумя парами щипцами; d) понять семявыносящих пинцетом образовать петлю 1 см. Нагрейте второй набор щипцов и акцизных цикла при прижигание концы одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: эстральный цикл.
) влагалища, наблюдается на 1 день непрозрачной, желтоватые и липкий b) влагалищные выделения наблюдаемых на 4 день ясно и липкое. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Подготовка игла для изоляции эмбриона.
) перелом 30 иглы вдоль красной линии и польские кончик, до тех пор, пока он плоский и гладкий. b) сделать угол 30-40 ° ~ 3 мм от кончика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Передача зиготы.
) и b) сделать длинный вертикальный разрез 2 см, начиная 2 см каудально до последнего ребра (красная линия); c) зажим жировой ткани с Hemostats и отражать ткани дорзально; d) отрегулировать положение тракта маточных труб и проникают открытой с 30 иглы; e) организовать зигот как цепь жемчуг стекла передачи эмбриона Пипетка и передачи их в маточных труб от вторглись открытым. Бар = 1, 000 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. ПЦР ПДРФ Assay одного помета животных основатель с RAG1 Indels. M: 1 КБ плюс лестница. WT: дикого типа. ID 1, 3 и 7 шоу режиссерский группа соответствует RAG1 indels. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Вес (г) ГСЖК (IU) ГСЖК (ul)
< 110 10 200
110-135 15 300
135-160 20 400
160-185 25 500
> 185 30 600
ГСЖК, gonadatropin сыворотка беременной кобылы

Таблица 1. ГСЖК делает соответствующие веса

Хомяк 1 день День 2 День 3 День 4 День 5
Доноры ГСЖК (9-12 утра) Спаривания (6-8 pm) Зигота изоляции (12-1 ПМ)
PN-инъекции (1-3 вечера)
Получатель Спаривания (6-8 pm) Перенос эмбрионов (3-5 вечера)

Таблица 2. График подготовки доноров/получателей помощи

Гены LOL Эмбрионов (Pups) LOL Пометы (получателей) LOL Позитивные щенков (%)
STAT2 229 (54) 14 (19) * 48 (88.9)
RAG1 77 (21) 3 (3) 6 (28,6)
* женщины, матовый с плодородные мужчин были использованы; количество пометов указано это только те произведенные Золотой щенков.

Таблица 3. Эффективность генов пристреливать в Золотой сирийского хомяка в системе Cas9/sgRNA

Состояние/обработка Требования к Комментарии
Рассеянный свет Выключить все рассеянный свет Хомяк эмбрионов чувствительны к свету, особенно для охлаждения свет
Свет во время обработки в пробирке Менее чем за 20 мин для инъекций PN Манипулировать 15 эмбрионов за раунд для уменьшения освещенности
Температура Температура окружающей среды: 28±0.5 oC Хомяк эмбрионов чувствительны к колебаниям температуры
Температура обработки: 37,5 oC
Средний HECM-9 Не храните больше чем 3 дня
Состояния культуры 37,5 oC, 10% CO2, 5% O2 и влажность 100% Сбалансированный на ночь в инкубаторе
Животноводства после переноса эмбрионов Не меняйте клетке в течение 5 дней до и после надлежащего Дата Получатель будет разделать детенышей если нарушается; обеспечить достаточное количество корма и воды

Таблица 4. Уникальные требования на Хомяк эмбриона обработки и животноводства

Дополнение 1: синтезировать sgRNA с GeneArt точностью синтеза Kit. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнение 2: хомяк эмбриона рецепт питательной среды-9 (HECM-9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Чтобы лучше использовать потенциал Золотой сирийских хомячков как модели болезней человека, мы разработали PN инъекции протокол для доставки ТРИФОСФАТЫ/Cas9 комплекс для хомячка генома. Протокол инъекции PN оптимизирует несколько ключевых переменных, включая эмбриона питательной среды, температура и длин волн света13. Есть также несколько хомяка животных обработки процедур, которые необходимо следовать для успешного проведения ген ориентации в хомяка. К примеру сексуально зрелой женщины хомяков имеют стабильные 4-дневный эстральный циклов, которые не могут быть синхронизированы с экзогенных гормонов (например ГСЖК). Таким образом точно отслеживания эстрального цикла Каждая самка имеет важное значение для суперовуляции и pseudopregnancy подготовки. 30 - 60 зигот могут быть изготовлены с женщиной, если она успешно суперовулированных. Для достижения успешного суперовуляции, необходимо рассмотреть конкретные виды отложение жира. Женщины хомяков, особенно те, которые более 12 недель возраста, имеют тенденцию к чрезмерной брюшной жир таким образом, чтобы игла шприца должен быть размещен правильно полностью проникать жировой ткани при выполнении инъекций гормона. Мы обнаружили, что проникновение на полпути в брюшной полости достигает соответствующее расстояние для доставки гормон. Мы кратко уникальные требования к PN инъекции, хомяк обработки и животноводства в таблице 4.

Для PN инъекций количество эмбрионов, переданы инъекции блюдо для каждого раунда инъекции должна определяться экспериментально избежать время расширенной впрыска. Чем дольше время эмбрионы остаются в блюдо, тем больше вероятность того, что они испытывают чрезмерное света. Мы рекомендуем, передачи примерно 15 эмбрионов для инъекций блюдо для каждого раунда инъекции. Это число достигает хороший баланс между количество раундов инъекции и допустимого воздействия эмбрионов света. Поскольку оба цитоплазматический и pronuclear оболочек хомяка эмбрионов достаточно гибкие, значительные силы должны применяться к иглу проникнуть мембраны пронуклеусами. В это время pronuclei должен оставаться в пределах диапазон фокусных расстояний.

Исследователи должны рассмотреть следующие вопросы хирургической, при выполнении переводы эмбриона. Во-первых важно, что надрезы через стенку тела соответствует размеру тела животного. Если разрез слишком мала, это может привести к экструзии зигот от маточных труб при возвращении репродуктивного тракта в брюшную полость. Помимо размера разрез потенциал для экструзии зигот из маточных труб можно минимизировать путем обработки связанного жировой ткани, вместо того, чтобы репродуктивных тканей надлежащего. Отношении размер разреза важно также учитывать, что больших разрезов может вызвать больше стресс для животного и демонстрируют более высокую вероятность осложнений (например , инфекции дегисценция). Во-вторых чтобы свести к минимуму кровотечения, исследователи должны позаботиться чтобы избежать нанесение крупных кровеносных сосудов, при доступе к живота, потому что потеря избыток крови может увеличить хирургии стресс для уменьшения успех передачи эмбриона и продлить время восстановления

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ZW имеет финансовые интересы в Auratus био, LLC., биотехнологическая компания специализируется на создание генетически модифицированных животных для биомедицинских исследований и сельскохозяйственной техники.

Acknowledgments

Исследования в этой публикации было поддержано национальных институтов аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) национальных институтов здоровья под награду номер 1R41OD021979 (для ZW) и исследовательский грант от 21 BioGreen следующего поколения Программа, Республика Корея, Грант нет. PJ01107704 (для ZW) и предоставить нет. PJ01107703 (до IK). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья или BioGreen 21. Мы благодарим д-р Николас Robl для редактирования рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cas9 Invitrogen B25640 1 μg/μL (~6.1 μM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit Invitrogen A29377 For sgRNA synthesis
Albumin from human serum Sigma A1653 For cultivation medium
Illuminator Nikon NI-150 For embryo transfer
Incubator New Brunswick Galaxy 14S For embryo cultivation
Microforge Narishige PB-7 For making injection needles
Microscope Nikon ECLIPSE Ti-S For microinjection
Microscope invitrogen SMZ745T For embryo transfer
Mineral oil Sigma M1840 Keep in dark
PMSG Sigma G4877-2000IU For superovulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
  2. Wold, W. S., Toth, K. Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
  3. Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
  4. Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
  5. Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
  6. Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
  7. Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
  8. Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
  9. Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
  10. Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
  11. Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
  12. McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
  13. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).

Tags

Биоинженерия выпуск 131 Pronuclear инъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Джин редактирования нокаут зигота эмбрионов животных моделей Золотой сирийского хомяка
Производство генетически Золотой сирийских хомяков Pronuclear инъекции комплекса ТРИФОСФАТЫ/Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, R., Miao, J., Fan, Z., Song, S., More

Li, R., Miao, J., Fan, Z., Song, S., Kong, I. k., Wang, Y., Wang, Z. Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex. J. Vis. Exp. (131), e56263, doi:10.3791/56263 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter