Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"

doi: 10.3791/56264 Published: December 6, 2017

Summary

ينبغي أن تكون أساليب لإنشاء مكتبات واسعة النطاق جرنة بسيطة وتتسم بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة. يصف لنا وضع بروتوكول لإنتاج مكتبات جرنة استناداً إلى الهضم الأنزيمي للهدف الحمض النووي. هذا الأسلوب، يعرض كورالينا (جرنة شامل مكتبة الجيل من خلال نشاط نوكلاس الخاضعة للرقابة) كبديل لتوليف اليغنوكليوتيد مخصصة مكلفة.

Abstract

شعبية للنظام كريسبر/Cas9 للجينوم والهندسة ابيجينومي ينبع من بساطته والقدرة على التكيف. ويستهدف المستجيب (نوكلاس Cas9 أو بروتين انصهار dCas9 نوكلاس-الميت) إلى موقع معين في الجينوم الجيش النيبالي الملكي صغيرة اصطناعية المعروفة بدليل الحمض النووي الريبي، أو جرنة. طبيعة النظام كريسبر ثنائي يمكن استخدامه في فرز النهج منذ بلازميد مكتبات الأشرطة التعبير التي تحتوي على الآلاف من جرناس الفردية يمكن استخدامها لاستجواب العديد من المواقع المختلفة في تجربة واحدة.

وحتى الآن، تم إنشاؤها تسلسل جرنة لتشييد المكتبات حصرا تقريبا بتوليف اليغنوكليوتيد، مما يحد من تعقيد يمكن تحقيقها من تسلسل في المكتبة وهي باهظة التكلفة نسبيا. هنا، البروتوكول مفصلاً كورالينا (جرنة شامل مكتبة الجيل من خلال نشاط نوكلاس الخاضعة للرقابة)، بسيطة وطريقة فعالة من حيث التكلفة لتوليد المكتبات جرنة معقدة للغاية تستند الهضم الأنزيمي لإدخال الحمض النووي، وهو وصف. حيث يمكن إنشاء مكتبات كورالينا من أي مصدر للحمض النووي، الكثير من الخيارات للتخصيص موجودة، تمكين مجموعة كبيرة ومتنوعة من الشاشات المستندة إلى كريسبر.

Introduction

بسبب تكييف النظام كريسبر/Cas9 البكتيرية كأداة استهداف جزيئي أحدث ثورة في البيولوجيا الجزيئية. ابدأ من قبل أنها لم تكن سهلة جداً للتلاعب الكروماتين في مواقع محددة بالجينوم. تشمل التطبيقات الشائعة كريسبر طفرات الجينات المستهدفة1، هندسة الجينوم2، ابيجينومي تحرير3والتنشيط النسخي والجينات إسكات4. إحدى مزايا خاصة للنظام كريسبر أن تطبيقاتها لا تقتصر على مواقع مرشحة مدروسة، مكتبات جرنة تشكل أقل من الشاشات منحازة. هذه تسهيل اكتشاف المكاني الوظيفية في الجينوم دون أي علم مسبق بالتجريبية. بيد حاليا معظمها يستند إلى بناء مكتبة جرنا توليف اليغو-النوكليوتيدات، وهناك خيارات محدودة لشراء مكتبات جرنا ليست للإنسان أو فتح مناطق المنشأ أو الهدف الماوس خارج قراءة الإطارات. وهكذا، على الرغم من أن شاشات كريسبر وبالفعل، أثبتت بشكل لا يصدق قوية5،6،،من78، كامل إمكاناتها لم لم تستغل.

مؤخرا وضعت للتغلب على الحد من جرنة الكلاسيكي توليد أساليب استراتيجيتين. على حد سواء تعتمد على الهضم الأنزيمي الخاضعة للرقابة للحمض النووي الهدف بدلاً من الاعتماد على توليف اليغنوكليوتيد مخصصة. بينما توظف كورالينا9 نوكلاس ميكروكوككال، الأسلوب البديل الوحيد المتاح حاليا، الأكل كريسبر10، يجعل استخدام إنزيمات التقييد (Hpaالثاني، سكرفالأول و منتدى بواو الآسيويالأول و مدامأنا). الأهم من ذلك، يمكن تطبيق التقنيات على حد سواء لأي إدخال الحمض النووي، والذي يخدم كمصدر لتسلسل بروتوسباسير جرنة. بينما تستخدم طريقة الأكل كريسبر استراتيجية لإنقاص عدد جرناس المستنسخة التي تستهدف مواقع لا يتبعها بام S.pyogenes المطلوبة (الدافع المتاخمة بروتوسباسير)، فإنه ينشئ سوى جزء صغير من جميع جرناس الفنية الممكنة منطقة بعينها. من ناحية أخرى، كورالينا، قادرة على توليد جميع جرناس المحتملة لتسلسل المصدر، ولكن يشمل أيضا نسبة أعلى من أدلة غير وظيفية. جرنا مكتبة جيل من خلال نشاط نوكلياسي التي تسيطر عليها تمكن من مكتبات جرنا شاملة لأي الأنواع، الإنتاج أي نظام Cas9-البروتين-أو المستجيب بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، كورالينا قابلة للتخصيص، والتكيف مع خيارات الإدخال وناقلات المناسبة تحديد مكتبة نوع وحجم ومحتوى. هنا، يرد بروتوكول تفصيلية التي يمكن استخدامها لتوليد مكتبات شاملة جرنة من مصادر متنوعة من الحمض النووي (الشكل 1)، بما في ذلك الصبغيات الاصطناعية البكتيرية (BACs) أو المجينية الحمض الخلوي الصبغي9. استخلصت النتائج التمثيلية المصاحبة لهذا البروتوكول بتطبيق البروتوكول كورالينا إلى BAC الحمض النووي.

Protocol

1-هضم الحمض النووي مع نوكلاس ميكروكوككال

  1. أداء فعل الأمثل لكل دفعة جديدة من الإنزيم نوكلاس ميكروكوككال (منسى).
    ملاحظة: ينبغي اختبار عدد وحدات منسى المستخدمة (باستخدام إضعاف مسلسل، الشكل 2 أ). عادة، 5-10 "ش منسى" هضم 1 ميكروغرام لتنقية الجينوم أو BAC الحمض النووي وصولاً إلى مجموعة من 5-100 شركة بريتيش بتروليوم مع الشروط المبينة أدناه.
  2. كل رد فعل، إعداد 1 ميليلتر من 10 × العازلة منسى، 1 x ألبومين المصل البقري (BSA)، 1 ميكروغرام من الهدف الحمض النووي، 1 ميليلتر من منسى (وحدات 0.1-50) في حجم رد فعل 10 ميليلتر.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. فورا إلغاء تنشيط الإنزيم بإضافة 1 ميليلتر من 500 ملم جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic (اجتا).

2-فصل الحمض النووي وشظايا استخدام التفريد جل Polyacrylamide (صفحة)

  1. إضافة نموذج المخزن المؤقت/هلام تحميل صبغ لعينات من الحمض النووي وتحميل على 20 ٪ هلام الصفحة. تحميل سلم الحمض النووي مناسب للتحجيم (5 bp سلم الحمض النووي). لا الزائد الهلام (1 ميكروغرام من الحمض النووي كل بئر).
  2. تشغيل المواد الهلامية في x 1 مناسبة تريس-بورات-يدتا (TBE) تشغيل المخزن المؤقت في 150 الخامس (ثابت) لحوالي 1.5 h أو حتى الجبهة صبغ السفلي (بروموفينول داكن، أزرق اللون الأزرق) الذي يسافر في حوالي 15 شركة بريتيش بتروليوم، تصل إلى نهاية أقل من الجل.
  3. وصمة عار جل استخدام وصمة عار الأحماض النووية حساسة جداً وتصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  4. من الصورة، وجل تحديد تركيز منسى الأمثل لهضم الحمض النووي وصولاً إلى 20-30 بي بي في الحجم.
  5. استخدام تركيز منسى الأمثل لهضم الحمض النووي المستهدف بتكرار الخطوات 1، 2-2، 2. إعداد 10-12 سوف تسفر عن ردود الفعل (أي 10-12 ميكروغرام من إجمالي ابتداء من المواد) يكفي يهضم عادة، الحمض النووي بعد استخراج هلام الصفحة الانتقال إلى الخطوات اللاحقة.
  6. استخدام مشرط معقم، قطع الهلام بجوار حارة ماركر ووصمة عار فقط الجزء من الجل يحتوي على السلم مع الطازجة 1 x TBE تشغيل مخزن يحتوي على 1 X من وصمة الأحماض النووية الحساسة جداً. تصور سلم الحمض النووي والمكوس شظايا من الحمض النووي يهضم منسى في نطاق الحجم بين حوالي 18-30 بي بي باستخدام شفرة حلاقة.
    ملاحظة: تجنب تعريض أجزاء منسى هضمها للأشعة فوق البنفسجية. من الممكن استخدام مصدر ضوء أزرق (بدلاً من الأشعة فوق البنفسجية) أو التقاط صورة للسلم تحت الأشعة فوق البنفسجية، وطباعته لتوسيع نطاق واستخدام هذا لتوجيه ختان شظايا من الحمض النووي يهضم منسى). هذه الخطوة تجنب تلطيخ والتعرض لشظايا من الحمض النووي للأشعة فوق البنفسجية. دائماً استخدام المبضع المتاح غير المستخدمة، والعقيمة أو شفرة حلاقة لهذه الخطوة لتفادي التلوث.
  7. نقل الشريحة جل لأنبوب ميكروسينتريفوجي.
  8. وصمة عار ما تبقى الجل مع الحمض النووي وصمة عار أعلاه، تعرض للأشعة فوق البنفسجية وتسجيل صورة الاحتفاظ بسجل لهذه الخطوة الختان جل.

3-عزل شظايا من الحمض النووي من صفحة-المواد الهلامية استخدام سحق والأسلوب نقع

ملاحظة: قد اعتمد هذه الخطوة من سامبروك et al. 11

  1. إعداد صفحة المخزن المؤقت solubilization هلام (1.88 مل خلات الأمونيوم م 4، 150 ميليلتر من خلات المغنيسيوم م 1، 30 ميليلتر من 0.5 م الإيثيلين حمض (يدتا) (pH 8) في عالي النقاوة ح2س إلى إجمالي حجم 15 مل).
  2. سحق شريحة جل قصت ضد الجدار من الأنبوب الصغير-الطرد المركزي باستخدام تلميح ماصة معقمة.
  3. إضافة 2 جل أحجام الصفحة solubilization المخزن المؤقت واحتضان في 37 درجة مئوية ح 16 على منصة الدورية.
  4. الطرد المركزي العينات لمدة 1 دقيقة بأقصى سرعة في ميكروسينتريفوجي. نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة، مع الحرص على عدم نقل أي قطع جل سحقت.
  5. إضافة 0.5 أحجام الصفحة solubilization المخزن المؤقت إلى الهلام بيليه، الدوامة، وكرر الطرد المركزي (الخطوة 3، 4). ضم في سوبيرناتانتس.
  6. استخراج الشظايا من الحمض النووي استخدام استخراج كلوروفورم الفينول القياسية.
    تنبيه: الفينول سامة إذا أنه يأتي في اتصال مع الجلد أو إذا ابتلع. احتياطات السلامة مثل القفازات والنظارات الواقية ومعطف مختبر، والعامل في غطاء دخان الحاسمة. التخلص من جميع النفايات التي تحتوي على الفينول ووفقا للنظام الأساسي للمعهد.
    1. إضافة وحدة تخزين واحدة من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل (25:24:1) للعينة ودوامه تماما.
    2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة ممكنة (16,000 س ز) في أجهزة الطرد مركزي منضدية في درجة حرارة الغرفة. نقل المرحلة المائية العليا بعناية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة. الحرص على عدم تحمل أكثر من أي الفينول أثناء بيبيتينج.
    3. كرر الخطوتين 3.6.1 و 3.6.2 مرة واحدة.
    4. إضافة كمية صغيرة (0.2 ميليلتر) من الجليكوجين، وحدات تخزين 0.1 من خلات الصوديوم 3 م (pH 5.2) ووحدات التخزين 2 100 ٪ الإيثانول (EtOH).
    5. دوامة واحتضان في-20 درجة مئوية لعدة ساعات أو طوال الليل.
    6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة عند 4 درجة مئوية باستخدام أجهزة الطرد مركزي منضدية.
    7. بعناية إزالة المادة طافية وتغسل بيليه الحمض النووي مع 70% EtOH.
    8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة عند 4 درجة مئوية باستخدام أجهزة الطرد مركزي منضدية.
    9. إزالة المادة طافية وأيردري بيليه الحمض النووي. تأكد من جميع EtOH يتبخر ولكن يجب الحرص على عدم الإفراط الجاف بيليه.
    10. حل بيليه الحمض النووي في 12 ميليلتر من H2o.
      ملاحظة: استخراج جل صفحة غير فعالة جداً. لكل 10 ميكروغرام ليبدأ الحمض النووي يهضم مع منسى، نتوقع أن استرداد 1-20 نانوغرام من شظايا المنقي بعد استخراج هلام. التحكم في مقدار وسلامتها من الشظايا بتحميل 1/6th (2 ميليلتر) في صفحة هلام (الشكل 2).

4-نهاية إصلاح الأجزاء يهضم منسى، وتنقية هلام

  1. قم بإعداد رد فعل التالي باستخدام الحمض النووي أحبطت عدة: 10 ميليلتر لتنقية الحمض النووي من الخطوة 3.6.10، 1.5 ميليلتر من 10 × أحبطت المخزن المؤقت، 1.5 ميليلتر من مزيج دنتب 1 مم، ميليلتر 0.6 إنزيم المعقولة، ميليلتر 1.4 H2o.
  2. احتضان عند 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ومن ثم الحرارة--إلغاء تنشيط الإنزيم بالحضانة على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. إضافة ميليلتر 85 من ح2س والقيام رد فعل تنظيف باستخدام معيار الفينول/كلوروفورم-استخراج وهطول الأمطار EtOH (كما هو موضح في المقطع 3.6). الشروع فورا في عملية ربط رابط.

5-رابط الجيل

ملاحظة: Linkers تحتاج إلى تفصيل بالتوازي مع الفرع 3 لتكون قادرة على الشروع فورا في عملية ربط رابط. تسلسلات التمهيدي المستخدمة أدناه يجب أن تكون مناسبة لمكافحة ناقلات التعبير جرنا المختار. تم تصميم تلك المعروضة هنا لناقل بجرنا-pLKO.1. 9 لتضخيم رابط 5 'من بجرنا-pLKO.1، استخدم التمهيدي تسلسل 5'-رابط-F (تجاتكاكاكجاككتجا) و 5 '-رابط-R (كجتجتتكجتككتتككاك)، العائد أمبليكون bp 689. لتضخيم رابط 3 'من بجرنا-pLKO.1، استخدام كبسولة تفجير 3'-رابط-واو: (جتتتاجاجكتاجااتاجكاجتاااتا) و 3 '-رابط-r: (أكتكجتكاتجتاجكتكك)، التي تؤدي أمبليكون bp 848.

  1. [بكر] تضخيم المحول تسلسل من ناقلات التعبير جرنة (باستخدام الكواشف اختيار وتسلسل التمهيدي مخصص، إذا لزم الأمر). لإعداد رد فعل PCR 50 ميليلتر التالية بجرنا-pLKO.1: 25 ميليلتر من مزيج سيد بكر، 2.5 ميليلتر من التمهيدي و (10 ميكرومتر)، 2.5 ميليلتر من التمهيدي R (10 ميكرومتر)، 0.1 نانوغرام ناقلات التعبير جرنة (بجرنا-pLKO.1) في ح2o.
  2. احتضان ردود الفعل على ثيرموسيكلير استخدام الشروط التالية: 1 دورة 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، دورات 32 98 درجة مئوية لمدة 10 s, 59 درجة مئوية لمدة 10 s، 72 درجة مئوية لمدة 30 ق، دورة 1 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. تنقية PCR ردود فعل استخدام الخرز التثبيت عكسها المرحلة الصلبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. الوت في 30 ميليلتر من H2o.
  4. لفرض ربط اتجاهي لرابط إلى الشظايا من الحمض النووي نهاية إصلاحه، ويهضم منسى، linkers دايجست بالمناسبة إنزيمات التقييد (هنا هندالثالث و الكيسالثاني). قم بإعداد ردود الأفعال التالية:
    1. الهضم من 5 'رابط مع هندثالثا، استخدام 30 ميليلتر من رابط amplicon المنقي 5' من الخطوة 5.3., 5 ميليلتر المخزن المؤقت و 3 ميليلتر من هندالثالث (20U/ميليلتر) ميليلتر 12 ح2o.
    2. الهضم من 3 'رابط مع الكيسالثاني، استخدم 30 ميليلتر من رابط amplicon المنقي 3' من الخطوة 5.3., 5 ميليلتر من المخزن المؤقت، 3 ميليلتر من الكيسالثاني (يو 20/ميليلتر)، و 12 ميليلتر من H2o.
  5. احتضان النبذ في 37 درجة مئوية ح 3.
  6. إضافة جل الحمض النووي تحميل صبغ وتشغيل النبذ إنزيم التقييد على 1% [اغروس] هلام. الرسوم للعصابات في 637 bp (رابط خلاصة 5 ') و 295 bp (رابط خلاصة 3').
  7. تنقية الحمض النووي من جل قصت القطع باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام.

6-رابط ربط والتضخيم من إدراج

  1. قم بإعداد رد فعل ربط ميليلتر 14 استخدام المبالغ اكويمولار شظايا يهضم منسى، وأصلحت نهاية وتسلسل رابط.
    ملاحظة: قد يكون الأمثل رابط إلى نسب يفتت. من المستحسن أن تدرج رد فعل لا، يفتت تحكم (NFC).
    1. استخدام 5 نانوغرام يهضم منسى الشظايا (نهاية إصلاحه وتنقيته)، 120 نانوغرام من 5 'رابط (هندالثالث الخلاصة، تنقية)، 55 نانوغرام 3' رابط (الكيسالثاني خلاصة تنقية)، 1.4 ميليلتر من T4 ليجاسى المخزن المؤقت وميليلتر 1.4 من ليجاسى T4 الحمض النووي تتركز في ح2o.
  2. احتضان ردود فعل عملية ربط في 16 درجة مئوية ح 16. هل عدم الحرارة--إلغاء تنشيط الإنزيم. الشروع فورا في نك في الترجمة.
    ملاحظة: الأجزاء يهضم منسى إصلاحه نهاية تقديم 5 ' الفوسفات اللازمة لربط linkers، كالرابط هم أنفسهم فوسفوريلاتيد الأمم المتحدة.
  3. لربط رد فعل (ورد فعل نفك) يضاف ما يلي: 25 ميليلتر من تق 2 X ميكس الرئيسي (قادرة على ترجمة نك)، 2.5 ميليلتر من التمهيدي رابط-Minus450-F (10 ميكرومتر، ججكاجتتجتجاتج)، ميليلتر 2.5 من التمهيدي رابط-Plus275-R (10 ميكرومتر، آجتجاتكتكتجكتجتككك) وميليلتر 6 من H2o.
  4. إدراج عنصر تحكم لا-قالب (المجلس الوطني الانتقالي). احتضان ردود الفعل على ثيرموسيكلير استخدام الشروط التالية: 1 دورة (نك الترجمة): 72 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، دورة 1: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 3-4 دورات: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 15 s، 72 درجة مئوية لمدة 30 s، دورة 1: 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. القيام رد فعل تنظيف باستخدام الخرز التثبيت عكسها المرحلة الصلبة بعينه بنسبة 1:1 حبة. الوت في ميليلتر 40 ح2o.
  6. كذلك تضخيم الجزء المطلوب (5 'رابط + منسى تفتيت + 3' رابط) استخدام المناسبة PCR الكواشف والإشعال التالية:
    1. استخدام ميليلتر 12.5 من مزيج سيد بكر، 1.25 ميليلتر من التمهيدي رابط-Minus450-F (10 ميكرومتر، ججكاجتتجتجاتج)، ميليلتر 1.25 من التمهيدي رابط-Plus275-R (10 ميكرومتر، آجتجاتكتكتجكتجتككك)، ميليلتر 2.5 من نك المنقي الترجمة الناتج من الخطوة 6، 4. واستخدام ميليلتر 7.5 من ح2سين الشروط التالية: دورة 1: 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، 10-16 دورات: 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 63 درجة مئوية لمدة 10 s، 72 درجة مئوية لمدة 15 s، دورة 1: 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، ردود فعل عدة يمكن تعيين جنبا إلى جنب لضمان وجود ما يكفي منتج PCR للخطوات اللاحقة. تصور كميات صغيرة من المنتج [بكر] على [اغروس] هلام، قم بإعداد ردود إضافية كما هو الحال في الخطوة 6، 5 وزيادة عدد دورة من 15 إلى 32. يمكن استخدام هذا الرد كمراقبة الجودة، وإذا لم تظهر أمبليكونس بعد دورات 15. وتشمل أيضا لا قالب تحكم (المجلس الوطني الانتقالي).

7-حجم التحديد

ملاحظة: هذه الخطوة تفصل الشظايا منسى مع رابط 5 'و 3' المرفقة بشكل صحيح من شظايا مع اثنين 5 'أو اثنين 3' linkers استناداً إلى حجم.

  1. الجمع بين كل دورة 15 PCR ردود فعل الخطوة 6.5. وإضافة الحمض النووي تحميل صبغ وتشغيلها على 0.8% [اغروس] هلام. المكوس الفرقة البارزين في 869 bp وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام.
  2. تحديد مقدار الحمض النووي (مثلاً باستخدام جهاز المطياف الضوئي).

8-استنساخ تضخيم PCR الشظايا في جرنة "ناقلات التعبير" الجمعية جيبسون

  1. تعد الجمعية سيد ميكس كما يلي:
    ملاحظة: الخطوات التالية مقتبسة من جيبسون et al. 12.
    1. إنشاء 6 مل متحاور رد فعل المخزن المؤقت عن طريق الجمع بين 3 مل من م 1 تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني (تريس)-HCl درجة الحموضة 7.5، 300 ميليلتر مجكل م 1، 60 ميليلتر من 100 مم ديوكسيجوانوسيني ثلاثي الفوسفات (دجتب)، 60 ميليلتر من 100 مم ديوكسيادينوسيني ثلاثي الفوسفات (داتب)، 60 ميليلتر من ديوكسيثيميديني 100 مم ثلاثي (دتتب)، 60 ميليلتر من 100 مم ديوكسيسيتيديني ثلاثي الفوسفات (دكتب)، 300 ميليلتر من 1 م ديثيوثريتول (DTT)، 1.5 غرام من البولي إيثيلين غليكول (شماعة)-8000، 300 ميليلتر من 100 مم نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD) في عالي النقاوة H2o.
      ملاحظة: يمكن هذا المخزن المؤقت الكوتيد والمخزنة في-20 درجة مئوية.
    2. إنشاء الجمعية 1.2 مل مزيج الرئيسي عن طريق الجمع بين ميليلتر 320 5 × متحاور رد فعل المخزن المؤقت، 3 ميليلتر من T5 يو/ميليلتر 10 [ااكسونوكلس]، 20 ميليلتر من 2 يو/ميليلتر دنا بوليميريز، 160 ميليلتر من 40 ليجاسى الحمض النووي يو/ميليلتر في عالي النقاوة ح2O. استخدام 15 ميليلتر من الجمعية الرئيسية ميكس مع 5 ميليلتر من إدراج.
      ملاحظة: مزيج الرئيسي الجمعية يمكن الكوتيد والمخزنة في-20 درجة مئوية، حيث أنها مستقرة لأكثر من سنة ويمكن أن يتسامح مع دورات تجميد أذاب متعددة. المبلغ الذي تم اختياره من T5 [ااكسونوكلس] مثالية للاستخدام مع يتدلى طويلاً.
  2. ناقلات العمود الفقري الهضم
    ملاحظة: تأكد من هضم كمية كافية من ناقلات الأمراض كمدخل للعدد المطلوب من ردود فعل الجمعية في خطوة 8.3.
    1. كل رد فعل، يضاف ما يلي: 1.5 ميكروغرام ناقلات التعبير "جرنة" (بجرنا-pLKO.1)، 5 ميليلتر من المخزن المؤقت، 1.5 ميليلتر من العمرالأول (5 وحدات/ميليلتر)، و 38.5 ميليلتر من ح2إينكوباتي سين هضم في 37 درجة مئوية ح 2.
  3. ديفوسفوريليشن ناقل خطية.
    ملاحظة: هذه الخطوة تقديم المشورة، ولكن لم يكن ضروريا. [ااكسونوكلس] T5 في مزيج الرئيسي سوف إزالة معظمها العمرأنا يتدلى قبل ليجاسى "بوليميراز الدنا" قد أتيحت فرصة للعمل. ولذلك، لا يتوقع ربط إعادة المفرط في الموجه.
    1. إضافة 2.5 ميليلتر من الجمبري إنزيم الفوسفاتيز القلوية (رساب، 1 يو/ميليلتر).
    2. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ومن ثم إلغاء تنشيط الإنزيم التي تفرخ في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. إجراء تنقية الحمض النووي
    ملاحظة: من المستحسن القيام بخطوة استخراج [اغروس] هلام. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام تنقية العمود-أو حبة. من المهم أن تحقق من هضم المتجهات كاملة، مثلاً عن طريق [اغروس] هلام التفريد. للمقارنة، يجب تشغيل ناقلات عسر الهضم بالتوازي.
  5. تحديد مقدار متجه هضمها المنقاة في العينة.
  6. أنشأت الجمعية مع إضعاف الفائض المولى من إدراج لناقلات. كل 20 ميليلتر رد فعل استخدام 100 نانوغرام لمكافحة ناقلات (العمرأنا هضم من الخطوة 8.5)، 12.2 نانوغرام من إدراج (من الخطوة 7.1.)، 15 ميليلتر من مزيج الجمعية الرئيسية من الخطوة 8.1.2. في H2o.
  7. احتضان عند 50 درجة مئوية ح 1.
  8. تنقية ردود فعل استخدام تنقية العمود. ريسوسبيند الحمض النووي في 75 ميليلتر من ح2س (أو ملائمة حجم اعتماداً على حجم انهانسر).
    ملاحظة: كفاءة التحويل يعتمد إلى حد كبير على نقاء الحمض النووي. خطوات تنقية إضافية (مثل استخراج الفينول/كلوروفورم) يمكن تحسين الكفاءة.

9-إعداد الخلايا الكهربائية المختصة TG1 كولاي

  1. التأكد من أن جميع الطرد المركزي زجاجات وقوارير تكون خالية من المنظفات الشطف وملء اللاحقة مع الماء المقطر قبل التعقيم.
    ملاحظة: هذه الخطوة تساعد على إزالة أية شوائب قد تؤثر في كفاءة التحويل. يجب أن يتم تجاهل المياه فورا قبل الاستخدام. وبدلاً من ذلك، قد يكون من المستصوب استخدام الزجاجات الطرد المركزي المتاح.
  2. ضمان أن الزجاجات أجهزة الطرد المركزي، وأنابيب والحلول المستخدمة لإعداد الخلايا اليكتروكومبيتينت هي مبردة على الثلج قبل الاستخدام. فمن الأفضل القيام بالخطوات التالية في غرفة باردة للتقليل من تقلبات درجة الحرارة التي يمكن أن تؤثر على كفاءة التحويل.
  3. إعداد 2TY المتوسطة. إلى 16 غرام تريبتوني بكتو، إضافة 10 جرام من خميرة مقتطف، و 5 غ من كلوريد الصوديوم، الماء المقطر إلى 1 لتر ومزيج اﻷوتوكﻻف. مخزن المتوسطة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد أطباق الحشري 2TY-أجار المغلفة وأطباق بيتري 10 سم تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: اختيار المضادات الحيوية يعتمد على طبيعة ناقلات التعبير جرنة، استخدام 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين بجرنا-pLKO.1.
  5. تتخلص من مخزون والغليسيرول الخلايا TG1 تطعيم 10 مل متوسطة 2TY (بدون المضادات الحيوية).
  6. احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ح ~ 16) مع الهز 225 لفة في الدقيقة.
  7. تطعيم 1 لتر من 2TY المتوسطة (بدون المضادات الحيوية) مع 10 مل الثقافة بين عشية وضحاها (تمييع 1/100) وتقسم على قدم المساواة بين اثنين قوارير ل 2 (التي تتضمن يحير).
  8. احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية، 225 دورة في الدقيقة حتى يتم التوصل إلى OD600 شمال البحر الأبيض المتوسط من 0.55 (تقريبا بعد ح 1.5--2). استخدام جهاز المطياف الضوئي لفحص OD600 شمال البحر الأبيض المتوسط بصورة منتظمة.
  9. البرد والثقافات على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  10. تقسيم ثقافة التساوي بين أربع زجاجات الطرد المركزي 500 مل (مبردة مسبقاً على الجليد).
  11. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 4,000 س ز في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد مركزي مبردة مسبقاً.
  12. صب سوبيرناتانتس وإضافة المجلد 1 (أي 250 مل) ليبرد قبل المثلج العقيمة المقطر ح2س إلى كل من الزجاجات أجهزة الطرد المركزي. ريسوسبيند بيليه البكتيرية بدوامات أو عكس الزجاجة (أو بواسطة بيبيتينج لطيف، إذا لزم الأمر).
    ملاحظة: من الأسهل ريسوسبيند بيليه بأول إضافة كمية صغيرة من المياه. ضمان بيليه هو حراكه تماما في نهاية المطاف.
  13. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 4,000 س ز في 4 درجات مئوية.
  14. تكرار الغسيل مرتين (خطوات 9.12. و 9.13). إزالة المادة طافية. كن حذراً عند الصب بيليه البكتيرية تصبح فضفاضة على نحو متزايد بعد الغسيل.
  15. ريسوسبيند بيليه في 50 مل من عقيمة، والمثلج والغليسيرول 10% وتحويلها إلى أنبوب الطرد مركزي قبل مثلجة 50 مل.
  16. خلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في ~ 4,000 س ز في 4 درجات مئوية. بعناية إزالة المادة طافية.
  17. ريسوسبيند برفق هذه البكتيريا في 2 مل من المثلج والغليسيرول 10% العقيمة.
  18. الحفاظ على الجليد إذا كانت الخلايا لاستخدامها فورا انهانسر.
    ملاحظة: الخلايا يمكن المجمدة في مختبرين من 50 ميليلتر في أنابيب 0.5 مل في حمام الثلج الجاف إيثانول وتخزينها في-80 درجة مئوية، ولكن هذا غير مستحسن.

10-انهانسر TG1 اليكتروكومبيتينت كولاي الخلايا

ملاحظة: انهانسر واحد من الاختناقات في إنشاء مكتبة شاملة. للحفاظ على تمثيل المكتبة، من المستحسن إجراء العديد من ردود الفعل الفردية انهانسر كاللازمة/عمليا، والقيام بمراقبة نوعية الخطوات الموضحة أدناه (10.6. و 10.8.).

  1. أنابيب ردود المنقي (من الخطوة 8، 8) إلى بكر العقيمة وبرود قبل الكوة وإبقائهم على الجليد (1 ميليلتر في الأنبوب). البرد 1 مم الفجوة انهانسر الترعة على الجليد.
  2. إضافة 25 ميليلتر طازجة TG1 الخلايا مباشرة إلى قاسمة واحدة من الحمض النووي ونقل الخليط فورا إلى ومبومو انهانسر. فليك أو اضغط ومبومو لضمان توزيع مزيج الخلايا/الحمض النووي على طول الدائرة ومبومو (دون أي الهواء المحبوس أو فقاعات).
  3. مكان في ومبومو في قاعة الشريحة وبدء برنامج انهانسر المناسبة (مثل 1 نبض 1.8 كيلو فولت (EC1)).
    ملاحظة: ينبغي أن تكمن وقت ثابت بين السيدة 5.7 و 6.0 في حالة أقواس اليكتروبوراتور، نفض الغبار ومبومو، وضمان وجود لا فقاعات الهواء في الدائرة وحاول مرة أخرى.
  4. فورا إضافة ميليلتر 975 من درجة حرارة الغرفة 2TY المتوسطة إلى ومبومو.
  5. استخدام ماصة نقل، نقل البكتيريا اليكتروبوراتيد إلى أنبوب 50 مل. كرر الخطوة 10، 2. وجمع كافة الخلايا تتحول مع مكتبة واحدة في أنبوب 50 مل واحد.
  6. الوثيقة الحجم الإجمالي.
  7. الخطوة مراقبة الجودة
    1. لقياس كفاءة الخلايا الكهربائية المختصة التي تم إنشاؤها حديثا، أداء فعل انهانسر منفصلة باستخدام كمية محددة من تقطيعه بلازميد الحمض النووي (مثلاً 10 بيكوغرام pUC19 التحكم بلازميد). نقل هذا إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب.
      ملاحظة: ينبغي أن تكون الكفاءة على الأقل 1010 مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) كل ميكروغرام الحمض النووي. الخلايا المحضرة عادة أداء أفضل من هذا.
  8. احتضان البكتيريا المحولة في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة تهز 225 لفة في الدقيقة.
  9. الخطوة مراقبة الجودة:
    1. لوحة محددة بكمية صغيرة من البكتيريا التي تحول مع المكتبة (مثلاً 10 ميليلتر من إضعاف إضعاف 10-100) على طبق أجار 10 سم مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة.
      ملاحظة: مع العلم أن حجم مجموع الثقافة (من الخطوة 10.6.)، يمكن استخدام عدد المستعمرة التي تم الحصول عليها لتقدير العدد الإجمالي للمستعمرات لمكتبة بأكملها. ينبغي من الناحية المثالية الإبقاء على 20-30 إضعاف التمثيل للمكتبة.
  10. تفريق ما تبقى البكتيريا إلى 2TY أجار المغلفة الحشري الأطباق التي تحتوي على اختيار المضادات الحيوية المناسبة.
    ملاحظة: يمكن تخفيض حجم الثقافة بالطرد المركزي في ز x ~ 4,000 لمدة 10 دقائق (أو حتى بيليه مرئية شكلت والمادة طافية تظهر واضحة). وهذا يقلل من الوقت لوحات بحاجة لتجف بعد نشر الثقافة. استخدام لوحات بدلاً من ثقافة السائل يقلل النمو غير المتناسب من مستعمرات فردية. 13
  11. وانتشرت وحدة تخزين مناسبة من رد فعل انهانسر التحكم pUC19 على طبق أجار إضافية 10 سم مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة.
  12. احتضان أجار لوحات بين عشية وضحاها (ح 16) عند 37 درجة مئوية.
  13. عد المستعمرات التي تم الحصول عليها على لوحات التحكم (لوحة مكتبة pUC19 والتحكم) لتقدير زيمبابوي/ميكروغرام الحمض النووي للبكتيريا فضلا عن تعقد مكتبة.

11-استخراج بلازميد الحمض النووي

  1. إضافة 10 مل الإعلام 2-تاي إلى لوحات بين عشية وضحاها، وكشط الطبقة البكتيرية قبالة لوحة استخدام الناشرة المتاح وأنه جمع في أنبوب 50 مل. كرر عدة مرات حتى يظهر كل من اللوحة نظيفة.
  2. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة "ماكسي بلازميد" (2-3 أعمدة بحاجة كل المقايسة البيولوجية لوحة).

Representative Results

استخدام البروتوكول في متناول اليد، تم إنشاؤها كورالينا جرنة المكتبات من الإنسان والفأر المجينية الحمض الخلوي الصبغي9 و "باك الحمض النووي" (الشكل 1). لإنتاج أجزاء من الحمض النووي الإدخال المناسبة للاستنساخ في ناقلات التعبير جرنة، يجب أن تحدد الظروف المثلى الهضم نوكلاس الخاضعة للرقابة. نتيجة نموذجية للاستفادة المثلى الهضم نوكلياسي ميكروكوككال هو مبين في الشكل 2 ألف. كمية غير كافية من نوكلياسي (0، 1، 2، 3، 4، 4.5 أو 5 وحدات) تنتج 5.5-7.5 وحدات ولا منتجات ملحوظ في نطاق الحجم المطلوب (10-100 شركة بريتيش بتروليوم) لا تزال تنتج الشظايا التي في المتوسط طويل جداً. كميات أكبر من إنزيم (50 وحدة) يؤدي إلى تدهور المفرط لإدخال الحمض النووي بعد 10 دقائق. ونتيجة لذلك، تم اختيار مبلغ متوسطة (10 وحدات). وكان تصعيد الخلاصة لإنتاج ما يكفي يهضم الشظايا لتنقية اللاحقة والاستنساخ (الشكل 2). في حين يفضل أعمى حدد شظايا من الحمض النووي حسب الحجم وتعتمد فقط على سلم الحمض النووي للتوجه للحد من التعرض لشظايا من الحمض النووي للأشعة فوق البنفسجية، يمكن الملون الجل بعد ذلك لمراقبة جودة الهضم وقطع. يظهر الشكل 2B مثال ممثل من جل صفحة من الحمض النووي الذي يكون قد اقتطعت شظايا بين 20 و 30 شركة بريتيش بتروليوم. هلام تنقية منسى الشظايا التي تم تحميلها على 20 ٪ هلام الصفحة للتحقق من تحديد حجم النجاح وتنقية من شظايا يهضم منسى (الشكل 2). البروتوكول في متناول اليد متوافق مع استخدام تسلسلات رابط مخصص، السماح لاستنساخ الأجزاء يهضم منسى في ناقلات التعبير جرنة الاختيار. هنا، جرنة-بلكو9 كالعمود الفقري. Linkers تتضخم من ناقلات التعبير جرنا باستخدام PCR القياسية. ويصور الشكل 2D مثال ممثل لتسلسل رابط تضخيم خالية إضافية، غير صحيحة أو لا قالب أمبليكونس. وبعد ذلك، يتم هضمها أمبليكونس رابط مع إنزيمات التقييد لضمان linkers هي متصلة على شظايا يهضم منسى في الاتجاه الصحيح. الشكل 2D يظهر الجل [اغروس] من linkers 5 'و 3' قبل وبعد الهضم مع هندالثالث و الكيسالثاني على التوالي، مما يشير إلى الهضم الكامل ل linkers إلى 637 المتوقعة و 295 bp. الجزء الأيسر من الصورة جل الوثائق ختان البنات أجزاء رابط هضمها. يلي جل استخراج linkers هضمها، تتمثل الخطوة التالية في البروتوكول الربط linkers إلى شظايا يهضم منسى إصلاحه نهاية. لأنه يتم إنشاء رابط تسلسل من [بكر] كبسولة تفجير أونفوسفوريلاتيد باستخدام، يجب أن لا تحدث عملية ربط الذاتي من linkers. إلا إصلاح نهاية يهضم منسى الشظايا من الحمض النووي توفر مجموعات الفوسفات اللازمة لربط. عقب الترجمة نك، يتم تضخيمه ربط المنتج ببكر. من أجل تجنب التحيز التضخيم PCR المفرطة التي يمكن أن تحرف تمثيل تسلسل جرنة في المكتبة، والتضخيم يقتصر على دورات أقل من 20 في المجموع. عقب بكر، يصعب تصور في الهلام [اغروس] منتجات التضخيم. ولذلك تتم للكشف عن المنتجات تقارير إتمام المشروعات تحكم منفصلة مع دورات 32 (ولكن لا يتم استخدامها لإعداد مكتبة). وتظهر نتائج من عنصر التحكم هذا بكر في الشكل 2E. وهذا ما يسمح لتحسين ردود الفعل ربط ولضمان ردود الفعل تخلو PCR المصنوعات اليدوية، والتي تحدث أحياناً في "عناصر تحكم لا شظايا" (NFC). يظهر الشكل 2E amplicon المطلوب (بلغة الحمض النووي + 5 'رابط + 3' رابط، الطول: 869 bp) بعد التضخيم من ردود الفعل ربط باستخدام اكويمولار (1:1) النسب بين الأجزاء وتسلسل رابط.

Figure 1
الشكل 1 : اقتراح جدول زمني لإعداد مكتبة جرنة- ويقدم كورالينا استراتيجية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد مكتبات شاملة جرنة من مجموعة كبيرة مصادر مختلفة من الحمض النووي من أي كائن حي. يمكن أن تتحقق في البروتوكول في متناول اليد للإنجاز خلال أسبوع عمل واحد. يمكن أن يؤديها توليد رابط بالتوازي مع نهاية-إصلاح الحمض النووي. إعداد البكتيريا اليكتروكومبيتينت يستغرق يومين وتتضمن خطوة نمو بين عشية وضحاها ولذلك ينبغي أن تبدأ قبل الجمعية يتم إعداد ردود الفعل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : خطوات حاسمة خلال البروتوكول. تمكن الهضم الخاضعة للرقابة (A) من "الحمض النووي باك" جيل شظايا من أحجام مختلفة. يظهر هنا هو الأمثل الهضم منسى. وعولج المنقي BAC الحمض النووي مع كميات مختلفة من منسى لتوليد 10 دقيقة 10 يو من منسى شظايا من الحمض النووي للطول المطلوب (20-30 بي بي). (ب) حجم التحديد الأجزاء بين 20 و 30 شركة بريتيش بتروليوم استخدام الختان من الجل بولياكريلاميدي. تنقية الحمض النووي BAC عومل مع 10 يو من منسى لمدة 10 دقائق. وقد سجلت الصورة بعد الختان. (ج) مراقبة جودة أجزاء تنقية هلام. بعد تنقية هلام، 1/6 من مناسى المنقي كان حملت الشظايا على 20 ٪ هلام الصفحة للتحقق من تحديد حجم النجاح وتنقية. (د) التضخيم من تسلسلات رابط للجمعية وتقييد إنزيم هضم linkers لكفالة استنساخ اتجاهي. تم تضخيم linkers 5 'و 3' وقطع مع هنديي و ساسي، على التوالي. قالب لا يتحكم (المجلس الوطني الانتقالي) أدرجت لعنصر التحكم للمصنوعات اليدوية بكر وتلويث الحمض النووي. اليسار: تطبيق نموذج تحليلي؛ الصحيح: تطبيق نموذج محضرة. وسجلت الصورة بعد الختان هلام. () ربط ناجحة من linkers إلى شظايا من الحمض النووي يمكن تحليلها باستخدام PCR مع زيادة عدد دورات بكر (32)، ويسيطر عليها أداء لا عناصر القالب مع ح2س (المجلس الوطني الانتقالي) أو استخدام المجلس الوطني الانتقالي من الخطوة السابقة الترجمة نك كإدخال (المجلس الوطني الانتقالي NT)). من المهم أن تشمل لا جزء (NFC)، وهو تحكم تضخيم من ربط ورد فعل الترجمة نك من التي تم حذف أجزاء مناسى. فقط إنتاج عينات في مناسى التي جمعت شظايا مع رابط الحمض النووي amplicon المتوقعة (869 bp). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

يمكن استخدام كورالينا إنشاء مكتبات جرنة واسعة النطاق بالهضم نوكلاس الخاضعة للهدف الحمض النووي والاستنساخ الناتجة عن الشظايا الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة بالجملة. الاستدلال الإحصائي يشير إلى أن العديد من أكثر من 107 جرنة الفردية تسلسل قد سبق تم بنجاح استنساخ استخدام البروتوكول في اليد9. يمكن تخصيص كورالينا بطرق متعددة. اختيار قالب الحمض النووي يحدد المنطقة المستهدفة وتعقيد القصوى من المكتبة التي تم إنشاؤها. باستخدام هذا البروتوكول، مكتبات كورالينا تم إنشاؤها مسبقاً من الإنسان والفأر الحمض النووي9. تصور الممثلة النتائج المعروضة هنا توليد مكتبة كورالينا من الحمض النووي BAC المنقي. يمكن إجراء مزيد من التخصيص باختيار تسلسل المتجهات ورابط التعبير جرنة. اختبرناها سابقا ثلاثة أزواج مختلفة الأطوال رابط للجمعية جيبسون مع اختلافات قليلة في كفاءة9.

بسبب أصلهم من جل هضم الحمض النووي، بروتوسباسير جرناس كورالينا لا تكون عادة بالضبط 20 شركة بريتيش بتروليوم في الطول، ولكن تبين توزيع طول بمتوسط يعتمد كلاهما على معلمات هضم منسى بالإضافة إلى حجم الختان مصنوعة من جل صفحة س. المثال الممثل هو مبين في الشكل 2 ج، يصور الشظايا بطول متوسط بين bp 19 و 27. في تجربتنا، طول الأجزاء يتم الاحتفاظ بإخلاص بروتوسباسير جرنة الذي تم إنشاؤه9. بينما الشظايا أقصر من 20 bp ينبغي تجنبها بسبب ارتفاع معدل خارج الهدف من جرناس الناتجة، وشظايا أطول على الأرجح أقل بكثير من مشكلة بالنسبة للتطبيقات المصب، حيث أنه كان أظهر أن جرناس مع بروتوسباسيرس ما دامت 45 بي بي لا تزال 9من الوظيفية.

الخطوات الأكثر أهمية اثنين في البروتوكول كورالينا هي اختيار حجم الشظايا يهضم منسى وخطوات الاستنساخ. جيل شظايا التي قصيرة جداً (مثلاً في المتوسط دون سن 18 عاماً bp) أو إدراج عدد كبير من ناقلات التعبير جرنة فارغة سوف تجعل المكتبة غير مجدية. وبالتالي، من المهم تحسين الخطوة الهضم مناسى (الشكل 2A)، لرصد الختان (الشكل 2، ج)، التحقق من الهضم الكامل للعمود الفقري ناقلات جرنا بما في ذلك أية عناصر تحكم جزء في جميع أنحاء البروتوكول. وقد الرعاية الخاصة أيضا التي يجب اتخاذها للمحافظة على تمثيل المكتبة جرنا. بشكل عام هو عنق الزجاجة مشتركة واحدة من مكتبة الجيل كفاءة نقل البلازميدات إلى البكتيريا للتضخيم. وهكذا، أن كميات كبيرة من البكتيريا مع الكفاءات الممتازة وعدد كبير من الأحداث انهانسر الفردية ضرورية لتحقيق عدد كبير من الحيوانات المستنسخة جرنة.

استراتيجيات جديدة لإنتاج مكتبة جرنة سيكون ضروريا لحصاد الإمكانات الكاملة للنهج المستندة إلى كريسبر الفرز العقود القادمة. وهناك طلب كبير على طرق فعالة من حيث التكلفة وبسيطة وقابلة للتخصيص لإنشاء مكتبات واسعة النطاق، شرطا مسبقاً لإجراء الفحص قابلة لعدد أكبر من نظم نموذجية والنهج الهندسية المختلفة على أساس كريسبر. يتم توفير كورالينا خطوة أولى نحو هذا. وتتعدد الاستخدامات المحتملة، لا سيما لإنتاج مكتبات شاملة للجينوم، وكدنا المستمدة مكتبات نظم نموذجية أقل شيوعاً والمكتبات شديدة التركيز والهياكل التجريبية التي البروتينات كريسبر مختلفة (مع اختلاف بام وتستخدم في الجمع بين متطلبات).

وخلافا لأساليب أخرى، يولد كورالينا جرناس ممكن جميع من مدخلات الحمض النووي. ومع ذلك، هو عيب واحد من الأسلوب أن جرناس تفتقر إلى التسلسل بام المطلوبة مدرجة أيضا في المكتبة، وهي ميزة أنها تشترك مع طريقة الانزيمية ثانية لجرنا مكتبة الجيل، أكل كريسبر (الجدول 1). اختيار الأسلوب المثالي جرنة مكتبة الجيل تعتمد على مواصفات فحص المخطط التجربة، لا سيما الطبيعة (الجينية، التنظيمية، إينتيرجينيك) وحجم المنطقة المستهدفة (محور واحد، ومناطق متعددة، على نطاق الجينوم). أننا نرى رأسا على عقب خاصة في استخدام كورالينا عند عدد كبير من غير الترميز أو المناطق التنظيمية ليتم تحليلها، إذا كانت هناك معلومات ناقصة أو غير موثوق بها تسلسل (نظم نموذجية الغريبة، وخليط من الأنواع (مثل ميكروبيوميس) أو حصل تجريبيا الإدخال)، إذا كان يتم الجمع بين مختلف كريسبر اندونوكليسيس أو إذا تشبع تحليل يقوم على محور قصيرة ومحددة (مثل يمثلها BACs).

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب تود أن أشكر الأستاذ الدكتور ستيفان بيك والأستاذ الدكتور ماغدالينا غوتز مدخلاتها، والمساعدة والدعم في تطوير أسلوب كورالينا، ويسبيك ماكسيميليان وباومان فالنتين التعليقات المفيدة. العمل الذي أيده DFG (STR 1385/1-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mM EGTA Sigma Aldrich 03777-10G 1.4., Inactivation of Mnase
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer Thermo Fisher Scientific LC6678 2.1.
Novex® TBE Gels, 20%, 10 well Thermo Fisher Scientific EC6315BOX 2.1., pre-made 20 % PAGE gel
O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific SM1303 2.1.
Novex® TBE Running Buffer Thermo Fisher Scientific LC6675 2.1., PAGE gel running buffer
Disposable scalpel, sterile VWR  233-5363  2.3., other equivalent reagents may be used
SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO) Sigma Aldrich
S9430
2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) Thermo Fisher Scientific 15593-031 3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used
Glycogen Sigma 10901393001 3.6.4., other equivalent reagents may be used
3M Sodium acetate , pH5.2 Thermo Fisher Scientific   R1181 3.6.4., other equivalent reagents may be used
Ethanol  3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade
Quick blunting kit  New England Biolabs E1201 4.1.
ammomium acetate Sigma
A1542
3.1., other equivalent reagents may be used
magnesium acetate Sigma
M5661
3.1., other equivalent reagents may be used
0.5 M EDTA (pH 8.0) VWR   MOLEM37465520 (or Promega V4231) 2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used
Agencourt AMPure XP beads Beckman coulter A63881 5.3. + 6.5.
Gel extraction kit QIAGEN 28704 5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used
concentrated T4 DNA ligase New England Biolabs  M0202T 6.1.+ 8.1.2.
Long Amp Taq 2X Master Mix  New England Biolabs M0287S 6.3.
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S 5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used
HindIII New England Biolabs R0104S 5.4.1. 
SacII New England Biolabs R0157S 5.4.2.
AgeI New England Biolabs R0552S 8.2.1.
Tris base Sigma 93362 8.1.1.
2M MgCl Sigma 93362 8.1.1.
dGTP,dATP, dCTP, dTTP New England Biolabs N0446S 8.1.1.
DTT Sigam
DTT-RO
8.1.1.
PEG-8000  Sigma
P5413
8.1.1.
NAD Sigma
N6522
8.1.1.
T5 exonuclease New England Biolabs M0363S 8.1.2.
Phusion DNA polymerase  New England Biolabs M0530S 8.1.2.
Taq DNA ligase New England Biolabs M0208L 8.1.2.
rSAP New England Biolabs M0371S 8.3.1.
TG1 competent cells Lucigen 60502-1 9.1.
1mm gap electroporation cuvettes  VWR 732-2267  10.2.
Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm) Fisher Scientific DIS-988-010M  9.4.
NaCl Sigma S7653  9.3.
Bacto-tryptone BD 211705 9.3.
Yeast extract BD 212750 9.3.
Agar Sigma
A1296
9.4.
Glycerol Sigma
G5516
9.17.
MNAse New England Biolabs M0247S 1.1.
Nanodrop Thermo Fisher Scientific ND-2000 throughout
Micropulser Biorad 165-2100 10.2.
Electroporation cuvettes Biorad 732-2267  10.2.
250 ml centrifuge tubes Corning 430776 9.1-9.9.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, (10), 957-963 (2013).
  2. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  3. Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. From profiles to function in epigenomics. Nat Rev Genet. 18, (1), 51-66 (2017).
  4. Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (1), 5-15 (2016).
  5. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, (6166), 84-87 (2014).
  6. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343, (6166), 80-84 (2014).
  7. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat Biotechnol. 32, (3), 267-273 (2014).
  8. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163, (6), 1515-1526 (2015).
  9. Koferle, A., et al. CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening. BMC Genomics. 17, (1), 917-940 (2016).
  10. Lane, A. B., et al. Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening. Dev Cell. 34, (3), 373-378 (2015).
  11. Sambrook, J., Russell, D. W. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. CSH Protoc. (1), (2006).
  12. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  13. Elsaesser, R., Paysan, J. Liquid gel amplification of complex plasmid libraries. Biotechniques. 37, (2), 200-202 (2004).
بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Köferle, A., Stricker, S. H. A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source. J. Vis. Exp. (130), e56264, doi:10.3791/56264 (2017).More

Köferle, A., Stricker, S. H. A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source. J. Vis. Exp. (130), e56264, doi:10.3791/56264 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter