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Cancer Research

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Published: September 5, 2017 doi: 10.3791/56265
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Oncologic Sciences, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

Summary

DNA 損傷を誘発するおよび選択したサブ核領域の DNA 修理蛋白質の応答を監視するための共焦点レーザー蛍光顕微鏡とレーザ マイクロ照射提供ツールです。この手法は、損傷検知、信号、および募集の知識大幅進んだ。この原稿は、単一および二重鎖切断修復を検討するこれらのテクノロジを示します。

Abstract

非常に調整された DNA 修復経路が存在する検出、消費税し損傷を受けた DNA 塩基の置換および DNA 鎖切断の修復を調整します。分子生物学の技術は、構造、機能、および修復タンパク質の動態を明らかにした、間まだ修理は核内の調整方法を理解する必要があります。レーザー マイクロ DNA 損傷を誘発して、修復タンパク質の募集を監視のための強力なツールを提供しています。レーザー マイクロ照射による DNA 損傷の誘発できる波長の範囲で発生して、ユーザーは確実に一本鎖切断、基本病変と用量の範囲で二重鎖切断を誘導できます。シングルの 2 つの一般的な共焦点レーザー波長は、355 による二重鎖切断修復を調べるためのマイクロ レーザーの使用ここでは、nm、405 nm。レーザー マイクロ照射データ集録および解析をユーザーが再現性をもって実行できるように、特定の損傷の混合物を誘導するため応用レーザー照射量のさらに、適切な特性が記述されています。

Introduction

蛍光顕微鏡は、細胞アーキテクチャを視覚化、タンパク質の局在を調べるし、タンパク質間、タンパク質-DNA 間相互作用をモニターする技術として浮上しています。蛍光顕微鏡を使用してグローバル DNA 損傷物質、紫外線 (UV) などのアプリケーションの後の DNA 損傷応答機構を研究する電離放射線、化学酸化、アルキル化剤や化学療法を提供して新しい洞察開始、伝達と DNA の募集 DNA 損傷1,2のサイトにタンパク質を修復します。ただし、これらのグローバルおよび非同期イベントの損傷を制限するが場合募集注文、協会または解離反応速度論に関する詳細情報とキー DNA 修理蛋白質間の関係が求められています。幸いなことに、レーザ走査型共焦点顕微鏡の進歩によって、損傷を誘発するレーザー波長と過去の 25 年にわたって蛍光タンパク質の改善のより広範な可用性の提供している強化されたツールと研究者を知ることDNA の修復、ターゲット DNA 損傷誘発。

細胞と細胞の機能を研究するためにレーザー マイクロビームを用いた細胞照射は細胞と放射線生物学3の老舗ツールです。この手法の DNA 修復の研究への応用現れたクレーマーと同僚を使用非常に焦点を当てて UV (257 nm) 0.5 μ m のチャイニーズハム スター卵巣 (CHO) のスポットで DNA 損傷を誘導するレーザー マイクロビーム システム4を細胞し、の誘導を設立このシステム5DNA photolesions。その特殊な設定と生成できないのため限られていたシステムを損傷時の採用 UV マイクロビーム方法上の重要な改善を提供しながら、二重鎖切断 (Dsb)6です。様々 な UV-B (290-320 nm) と UV の後の調査-グループの数によって (320-400 nm) 波長 UV 光、酸化基本病変を明らかにした単鎖切断 (SSBs) と Dsb はレーザーの波長に依存して誘導することが、電源には、4、7,8,9,10 (文献3) が適用されます。さらに、これらの UV-B と UV-A 波長ソラレン、ブロモデオキシウリジン (BrdU) ヘキスト染料などのエージェントを感作性との組み合わせも発見された波長、パワー、および露出の期間に依存して DNA 損傷を誘導するために必要な力が誘発するダメージはしばしばこれらエージェント11,12,の13,14,15存在下で引き下げ。これらのメソッドの普及のために対処するまだ技術的なハードルがあったがこれらの進歩, マイクロ照射の利用の拡大。

クレーマーと同僚大幅正確に中心にセルの高いローカライズされた領域に重要な有害なエネルギーを適用する UV マイクロビームによるマイクロ照射のフィールドを高度な。共焦点顕微鏡とレーザ レーザーマイクロダイ セクション システムが高度な鋭く焦点を合わせた光だったより広くアクセスできる;しかし、紫外線源をスコープに結合と彼らはまだによる色収差を扱うほとんどのユーザー3,6,16に重要な課題を提示しました。UV UV 染料増加光学フォーカシング可能、1990 年代を通じて人気キャプチャ紫外励起蛍光16より広く利用可能になった、レーザースキャニングの改善はユーザーを提供して高度を作成する機能に集中セル6,17内励起スポット。しかし、それまでなかった 2000 年代初頭高強度レーザーでしっかりと集束ビームのこの組み合わせの真の影響が感じられた、多数のレポートはデモに増感剤と DNA 鎖切断を誘導することが現れたとき、A-紫外線範囲6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24、 25,26, 488 nm27のようなもはや目に見える波長で、でも。これらの進歩は、多くの商用システムでマイクロ照射技術のより広まった採用を許可します。これらの開発と並行して、2 光子技術も登場した DNA の損傷の正確な誘導を許可これらの進歩はここでは説明しません、これら方法論9,28,29,30を議論するレビュー記事の数があります。

共焦点顕微鏡高集束の紫外光や蛍光タンパク質が DNA 修復タンパク質の実時間追跡を許可に広まった可用性を提供することができる現在のアクセシビリティを指定してマイクロ照射技術に進化しています。DNA 損傷応答と修復経路を検査するための強力なツールです。ただし、ユーザーは、DNA 損傷の生成、レーザー波長とサブ核の領域に適用される力に大きく依存であることを認識する必要があります。UV-C の使用 (〜 260 nm) 波長直接 DNA 励起と UV 光7,8誘導高い選択性を許可します。UV-B と UV-A 波長 DNA 損傷 (基本病変、SSBs、Dsb) の混合物を作り出す、応用力や細胞の背景に依存活用7。内因性光増感剤と標的細胞の抗酸化レベルは、これらの波長によって生成される DNA 損傷の混合物に影響を与えます。また、外因性光増感剤 (BrdU 等) の使用は、DNA 損傷の誘発のために必要なエネルギーの低下で助けるかもしれない。しかし、これらのエージェントは、自分で DNA 損傷を引き起こすことができる、使用ユーザーが考慮する必要があります望ましくない効果が生じるので細胞周期とクロマチン構造を変更可能性があります。したがって、DNA 損傷応答と修復を検討するマイクロ照射を使用する前に、興味、使用可能な波長および作成された DNA 損傷の混合物の DNA 修復経路を慎重に検討が必要です。

2 つの一般的に使用される波長は、355 でレーザー マイクロを実行するここでは、nm、405 nm、これらの波長との修復を調べることで持っているこれらの損傷の混合物の影響によって生じる DNA 損傷の混合物を示すための増感剤なしSSBs と Dsb。 ユーザーはこれらの波長が単一種の鎖または基本病変を作成しないでください注意してくださいする必要があります。DNA 修復経路を区別するためにユーザーする必要があります慎重に核の特定の領域の応用力の制御、複数のストランド ブレーク マーカーや DNA 病変抗体を用いた誘導損傷を特徴付けます。正しく適用し、特徴、マイクロ レーザー ユーザーがいくつかの特異性と、偏向や SSBs 基本病変の修復を評価できるように、DNA の損傷のいくつかの種を豊かにできます。したがって、できるように再現性をもって実行マイクロ レーザー応用レーザー線量による DNA 損傷の混合物を特徴付ける、データ分析を実行する方法を提供しております。

Protocol

1。 細胞培養と安定した細胞の生成

  1. 10% 牛胎児血清を添加した最小必須培地で成長 CHO ‐ K1 細胞。37 で 5% CO 2 と加湿のインキュベーターで細胞を維持 ° C
  2. C 末端の人間、XRCC1 を含んでいるプラスミッド DNA の 1 μ g に transfect CHO ‐ K1 細胞緑次のメーカー商業トランスフェクション試薬を用いた蛍光蛋白質 (GFP) タグ ' の指示
    3. 。
  3. 選択 CHO ‐ K1 800 μ g/mL ジェネティシンを使用して人間の XRCC1 GFP 融合を安定に発現する細胞し、蛍光セル (FACS) を並べ替えを使用して、XRCC1 GFP 表現する人口を豊かします
    4. 。
  4. プレート細胞 coverglass 底を有する培養容器でマイクロ照射になり彼ら到達約 75% またはより大きい密度の次の日にします。いくつかの空白セルの間が望ましい、特に場合は、登録を使用して同じイメージ フィールド (セクション 3.2) に戻ります
    5. 。

2。顕微鏡のセットアップ

  1. 選択レーザー走査共焦点顕微鏡マイクロ照射/光の適切なレーザー、光学、および制御ソフトウェアを装備。走査型レーザー共焦点顕微鏡検流計 photoactivation miniscanner ファイバー結合 355 nm レーザーを含むように変更されている実験使用を提示し、メーカーを使用して制御 ' s 制御・解析ソフト。このシステムはマイクロ-照射利益 (率 ROI) のユーザーが指定した地域の photoactivation miniscanner (355 nm レーザー) または標準の共焦点ガルバノ メーター (405 nm レーザー) を使用して実行できます
    2. 。
  2. マイクロ照射、マイクロ照射光のすべての光学コンポーネントが選択した波長に適していることを確認に使用する波長を選択します
    。 メモ: 355 nm マイクロ照射用の UV フィルター キューブとともに 40 × C アポクロマート (開口数 (NA) 1.2) 油浸対物レンズと標準的な共焦点光パスを用いた 20 × C アポクロマート (NA 0.75) 乾燥目的提示システムを使用してください。405 nm マイクロ-照射。セットアップで使用される 20 × 目的は 355 nm 波長のと互換性がありません。したがって我々 用 40 × 355 nm のみ。蛍光プロトコル イマージョン オイルをオフに洗浄せず下流に適用することができます損傷の乾燥系対物レンズを使用して、利用可能な場合この目的理由です
    3. 。
  3. は、マイクロ照射実験のため顕微鏡を構成します。実験の間の一貫性を維持するためにマイクロ照射の種類ごとに使用する顕微鏡コンポーネントの標準化された構成を指定します。顕微鏡内のプリセットとして設定を保存 ' オペレーティング ・ ソフトウェアで可能であれば s.
    注: 提示システムにおけるセル、マイクロ照射、一方向のスキャン、スキャン解像度は、1024 x 1024 ピクセル x スキャン ズーム 1 を使ってイメージ化 8 フレーム/秒 (fps) やピンホールのフレーム レートで 4 に設定約風通しの良い単位 (AU) として488 nm レーザー (69 μ m) に決定。この開いたピンホール設定は低いレーザー力を画像と退色を減らすことの使用を許可する各イメージにキャプチャされた光の量を最大化するために選ばれた
    4. 。

3。レーザー マイクロ照射

  1. 場所準備培養皿、顕微鏡ステージと所定の位置にしっかりとロックに興味のセルが含まれています。
    1. 場合は、ステージ上のインキュベーターで腔症スライドを配置、損傷誘導中に 5% CO 2 と 37 ° C で維持します。この手順は、生細胞タイムラプス イメージングまたは長いセッションをイメージングの最も重要です。それ以外の場合、顕微鏡の場所細胞ステージし、室温で照射を行う (〜 25 ° C)、5% CO 2 と 37 ° C で培養する細胞をすばやく戻る
      2. 。
  2. 固定、染色、または他のプロシージャを実行した後、同じ場所に戻ります研究をできるようにイメージ フィールドを登録します。セルの XY 位置のエッチングまたはラベルの付いたグリッドを有する培養 coverglass 容器またはエンコードされた、自動ステージを使用して破損しているフィールドの登録を実行します。
    1. ソフトウェア イメージの登録を使用して培養器 (すなわち、coverglass または井戸間の障壁のコーナー) の認識機能を選択、画像を収集、XY 位置を記録します。これにより、配置およびサンプル準備、次の選択したフィールドの XY 位置の登録
      2. 。
    2. 場合は手動登録を使用して、グリッドまたは各フィールドのエッチングの場所を手動で記録、ステージ上方向および皿の配置を記録するように注意しながら.
    3. 細胞培養容器の識別機能がない場合は、細胞の形態や密度の目視による破損しているフィールドを識別します。後、イメージング中に認識する十分に明確な機能を持つフィールドを選択する注意してください
      。 注: これは方向および培養器の地域は厳しく制限されていない限り、実行に時間がかかるできます
      4. 。
  3. マイクロ照射用のフィールドを選択し、サンプルに焦点を当てます。蛍光に分類された蛋白質を発現する細胞では、関心の蛍光チャネルで最大の核の断面を持つフォーカル プレーンを選択します。細胞のタンパク質をラベルを表現していないまたは明確な核局在化せず、位相コントラストまたは差動干渉の対照 (DIC) の画像を正しい焦点面を検索する使用できます
    。 ​ 注: 位相差顕微鏡および DIC イメージングの有用な特徴であると、焦点面は、サンプルを移動、同じ機能することができます表示されます光や暗い、相対的な焦点面によって。
    1. は、内核、核小体など明確な機能を選択し、外観の変化を観察しながら、焦点面を上下に移動します。真の焦点面は、光から暗いへの移行であるでしょう。サンプルを対象にするため選択したフィーチャーが鮮明なコントラストと、焦点の平面を選択します
      2. 。
  4. 興味の分野の位置を登録します。顕微鏡のソフトウェア内の 3 × 3 ピクセルの正方形の投資収益率を作成、この投資収益率を破損している細胞の核に置きます、この投資収益率 ROI の損害を設定します
    5. 。
  5. は、ROI の損傷の位置など事前の被害画像を収集します。
    1. 蛍光タンパク質を使わない実験を取得位相差、微分干渉対照 (DIC) 明視野画像を確認して被害の核を記録するためです
      2. 。
    2. 生細胞を蛍光タンパクを用いた実験のため明視野と蛍光チャネル (すなわち、レーザー ライン 488 nm の GFP、RFP の励起用レーザー線 561 nm の励起) 興味の蛋白質を含んでいるイメージを取得します。CHO ‐ K1 XRCC1 GFP を用いた実験、488 nm レーザー線励起蛍光同時に送信された DIC 明視野チャネルで収集されたします
      3. 。
  6. 開始レーザー損傷。
    1. 提示システムにおける制御時間の合計によってレーザー照射量過ごした損傷 ROI をスキャンします。355 nm レーザーの検流計は、固定のスキャン レートで動作するレーザー照射量によって選択された損傷の投資収益率を繰り返しスキャン時間: データ記載されてここでは、355 でマイクロ照射 nm が 2 と 10 秒間実行されます
      2. 。
    2. は対照的に、スキャン レートを調節することによって 405 nm レーザー照射量を制御し、選択した破損の投資収益率の 1 つのスキャンを実行します。データ p の405 マイクロ照射 8 と 0.5 fps を使用ここで憤慨、nm。レーザー スキャン中に各ピクセルのより少ない時間を費やしているので、8 fps のスキャン レートは 0.5 fps よりも低いレーザー照射量を提供します。両方のレーザは、100% の力で運営されています。レーザー力の直接測定の手順については、セクション 3.7 を参照してください
      。 注: 個々 の顕微鏡システムごと指定された投資収益率、方法に類似した 355 にレーザー出力を配信する方法で異なる場合があります nm、405 nm 異なる提示システム。ユーザーが彼らの顕微鏡システムのこの手順を決定し、レポートの方法セクション内でこれらのパラメーターする必要があります
      3. 。
    3. 生きているセルイメージ投射のため明視野と蛍光チャンネル タイムラプス画像集録を実行します。理想的な実験の時間にわたって被害投資収益率で蛍光タンパク質と解離度の蓄積をキャプチャ データ コレクションを最適化するタイムラプスの期間と頻度を調整します。XRCC1 GFP を用いた実験は、20 分間 30 秒ごと画像を収集します
      。 ​ 注: タイムラプス イメージングの周波数は蓄積・解離の分析を複雑な蛍光の退色によって制限されることができます。退色は、タイムラプス中無傷の細胞を観察し、無傷細胞内蛍光信号の損失を最小限に抑えるための買収条件を調整することによって評価できます。ユーザー タイムラプスの各フレームで破損していない細胞に損傷した細胞の蛍光強度を正規化することで信号の損失を補うことがありますので、いくつかの退色は避け、あります。
      1. 時間コースを完了すると、細胞の損傷のための新しいフィールドを選択またはセクション 4 で説明されているように、さらに分析、損傷した細胞を修正します
        2. 。
      2. 続行マイクロ照射とタイムラプス イメージング損傷した細胞の必要な数に達するまでします
        。 ​ 注: 誘導損傷に応答細胞間の不均一性を評価するために選択した条件ごとの 10-25 セルの合計の損傷をお勧めします。これ紹介、セルの数が多い上ピーク募集時の解析が複雑に千鳥被害開始の時間または解離時間ほとんど共焦点システムは、各マイクロ照射中 1 つ以上のセルの損傷にユーザーをできますが、高速のイベント。一部のシステムで Roi を同時損傷誘導はそれぞれ独立した ROI によって受け取られたレーザーの服用量を減らすことができます。したがって、これらのタイミング/電源の問題は、ユーザーが直接アドレス指定されて、しない限り、それは推奨細胞が個別に破損している
        3. 。
    4. 蛍光抗体法 (IF) によるダメージを実行しで説明するよう、どちらかはすぐにセルを修正セクション 4、または時間 (すなわち、1、5、10 または 20 分) の選択したインクリメントを修復する細胞を許可します。希望の時間が経過すると、修正し、セクション 4 に示すとおり、細胞を染色します。
        分析全体的な細胞数を増加、損傷後損傷応答の複数フィールドの時間コースを生成する培養器内にある追加のフィールドを
      1. 。各フィールドをし、損傷が発生した時間の XY 位置を記録します。期待どおりの合計後は、修復時間が経過を修正し、以下のとおり細胞を染色します
        2. 。
  7. 選択した用量で蛋白質の募集を観察し、正確に特徴付けると、報告後の目的とレポート レーザー電源レベル後繊維測定レーザー用量。私たち使用コンパクト デジタル パワー メーターと 2 つの異なるダイオード センサー ヘッド;後ファイバー出力を計測するレーザー光ファイバーに直接結合 1 つと他は post-objective の出力を測定する顕微鏡ステージ上に配置します。
      レーザー パワーを測定し (後の繊維または post-objective)、目的の構成でセンサーを配置、電源メーターによる測定を記録しながら、上記のようにマイクロ照射を実行
    1. 。電源メーターのサンプリング レートは、電源メーターが適用用量を正確に検出することを確認するための実験の複数のイテレーションを実行する必要がありますので、非常に急速なマイクロ照射イベントをキャプチャするのに十分な高速にできない場合がありますに注意してください
      。 注: 355 nm レーザーの約 5 mW の後繊維と約 19 μ 後目的の平均ピーク電力を測定しました。電源メーターの 0.01 秒の最大サンプリング レートと 1.5 の平均ピーク力を克服するために 30 の繰り返しのループに 405 nm レーザーのマイクロ照射を行った mW と 2.4 mW 8 と 0.5 フレーム/秒のスキャン速度を測定しました。、それぞれ。すべての電源メーターが違います。ユーザーが操作の波長と彼らの個々 のパワー メーターのサンプリング レートを決定する必要があります
      2. 。

4。蛍光抗体染色法

  1. 場合染色による分析鎖休憩誘導。
    1. 3.7% と修正細胞ホルムアルデヒド (注意) リン酸バッファー 10 分吸引ホルムアルデヒド溶液、PBS で 3 回洗浄用生理食塩水 (PBS)。プロトコルは PBS セルの背面に配置することによってここで停止することができ、セルを 1 週間の 4 ° C で保存できます
      。 注意: ホルムアルデヒドは有毒で発がん性です。摩耗適切な個人用保護具と制度の環境健康と安全の手順で指示として有害物質の dispose
      2. 。
    2. 0.25% を使用してセルを permeabilize PBS で 3 回常温 (RT)、洗い 10 分 PBS でトリトン X-100
      3. 。
    3. 室温 1% ウシ血清アルブミン (BSA) を含む PBS で 30 分間インキュベートし非特異抗体の結合をブロック
    4. ΓH2AX に対してプライマリ monoclonal antibody と 53BP 1 の両方は常温では、1 時間 1 %bsa を含む PBS で 1:750 を希釈し、PBS で 3 回を洗浄に対する主なポリクローナル抗体加温します
      5. 。
    5. アレクサ 488 ヤギ抗マウスと Alexa 546 ヤギ抗うさぎ加温セル両方 RT で 1 時間 1 %bsa を含む PBS で配分を希釈し、PBS で 3 回を洗浄します
      6. 。
    6. 染色 DAPI の 10 mg/mL の溶液と核 DNA (4 '、6-Diamidino-2-Phenylindole、注意) 5 分または使用と同等の原子力染料の PBS で 1: 5000 に希釈と、PBS で 3 回洗って
      。 注意: DAPI は毒性および変異原性です。適切な個人用保護具を着用し、制度環境健康と安全の手順の指示に従って、有害物質を処分します
      7. 。
    7. 場所 PBS または PBS + 0.1% アジ化ナトリウム (注意) は染色の細胞に戻る。プロトコルはここで停止することができます、セル数日間 4 ° C で保存またはセクション 5 で画像取り込みに進みます
      。 ​ 注意: アジ化ナトリウムは毒性が強い。適切な個人用保護具を着用し、制度環境健康と安全の手順の指示に従って、有害物質を処分します
      8. 。
  2. 基本病変または DNA の分析誘導場合染色による付加します。
    1. 修正-20 で 20 分間氷冷メタノール (注意) でセルを permeabilize と ° C
      注意: メタノールは有毒、可燃性です。適切な個人用保護具を着用し、制度環境健康と安全の手順の指示に従って、有害物質を処分します
      2. 。
    2. は、私を吸引します。thanol 15 分プロトコルに完全に乾燥するサンプルはここで停止することができ、-20 ° C で保存されているセルを 3 日間乾燥を許可するとします
      3. 。
    3. 15 分のための PBS のセルを水分補給
    4. Denature RT と PBS で 3 回洗浄の 45 分の 2 N HCl (注意) を用いた DNA
      。 注意: 塩酸は腐食性です。適切な個人用保護具を着用し、制度環境健康と安全の手順の指示に従って、腐食性物質を処分します
      5. 。
    5. PBS の 3 洗浄が続く 5 分 50 mM トリス塩酸 ph 8.8 Neutralize
      6. 。
    6. 室温 1 時間 PBS のトリトン X-100 5% ヤギ血清と 0.1% で作られた加温ブロック バッファー内セル
    7. PBS で 3 回 8-オキソ-2´-デオキシグアノシン (8 切断・酸化損傷、1: 400) またはシクロブタン ピリミジン二量体 (CPD、1:1, 000) RT で洗い 1 時間ヤギ血清ブロック バッファー内の一次抗体を加温します
      8. 。
    8. RT で 1 h 用ヤギ血清のブロック バッファーの配分比率でアレクサ 488 ヤギ抗マウスでセルをインキュベートし、PBS 洗浄 3 回
      9. 。
    9. PBS で 1: 5000 DAPI (10 mg/mL) を使用して、5 分間核 DNA を染色し、PBS 洗浄 3 回
      10. 。
    10. 使用して場合カバーグラスチェンバー、配置 PBS または PBS + 0.1% アジ化ナトリウム染色の細胞に戻る。プロトコルはここで停止することができます、セル数日間 4 ° C で保存またはセクション 5 で画像取り込みに進みます
      11. 。
    11. はまた、追加 coverglass は培養器の上に配置できる場合最寄りの実装中に細胞をマウントします。硬化後長期間で、4 ° C でのマウントされた細胞を保存ことができます
      12. 。

5。画像蛍光実験のため取得

  1. エタノール文化容器の coverglass の底をきれいにし、共焦点顕微鏡ステージの背面に配置。ステージ上の容器の位置や方向の向きに対応位置記録損傷が誘導されたことを確認します。最適な登録および画像処理を確保するための培養器をセキュリティで保護します
    2. 。 登録法を用いた
  2. 以前をイメージ検索フィールドは、(に記載されている 3.2) を選択しました。
    1. の手動登録、coverglass を用いたエッチング グリッド フォーカスと識別マークを見つけるにグリッドをもたらします。使用し、損傷した細胞の XY 座標を記録した
      2. 。
    2. イメージ ベースの自動登録、ステップ、3.2.1 の参照として使用される構造機能を見つけて、可能な限り記録された画像と密接に現在のライブ顕微鏡ビューを配置します。かつて整列、現在 XY 顕微鏡ステージ位置を測定し、参照画像の XY 位置にそれを比較します。2 つの場所間の直線距離は、X および Y のオフセットを定義します。照射セルを含むイメージ フィールドを識別するために各記録された XY 位置にこのオフセットを適用されます。このオフセット機能を顕微鏡制御ソフトウエアで自動または手動で実行可能性があります
      3. 。
    3. 適切な登録ポイントが識別されなかった場合は手動でスライドをスキャンし、以前に識別されたセル機能の検索によってセルを検索します
      4. 。
  3. (セクション 2.3 で設定とセクション 3.3 に焦点を当てて) 明視野画像を含め、すべてステンド グラスの対象を収集する適切な顕微鏡の設定を使用して画像を取得します。提示実験マルチ チャンネル画像は次の励起レーザー ラインとの同時を使用して収集された: 405 nm (DAPI) 488 nm (アレクサ 488 や透過 DIC 明視野)、561 nm (Alexa 546)。すべてのレーザーはレーザー波長と消費電力の両方の伝送を制御する単一の音響光学可変フィルターを通過します
    4. 。

6。ライブ サイトのマイクロ照射する蛍光タンパク質の募集の細胞イメージ解析

  1. オープン (NIS 要素や ImageJ) 画像解析アプリケーションで画像を取得します。必要に応じて、予備照射の画像と事前・事後の損傷誘導の単一のイメージのシーケンスを生成するタイムラプス画像を組み合わせます。ユーザーできます表示募集照射領域に蛍光強度の変更の測定によって全体の核の間で測定した蛍光強度を基準 (代表の結果は、 図 1 を参照してください B。).
  2. 測定する各セルの最初に核を表す投資収益率の参照を生成します。核を構成するピクセルが含まれている蛍光信号の閾値処理アルゴリズムを使用して、投資収益率にこの領域を変換します。必要に応じて、参照として、明視野観察を使用して投資収益率を手動で描画できます。核面積正確に、ROI によって覆われていることを確認する時間にわたって投資収益率を調整し、フレームごとにこの ROI 内の蛍光信号の平均蛍光強度を報告します
    3. 。
  3. 測定する各セル 6 x 6 ピクセルの投資収益率を作成し、経過の各フレームの損傷の投資収益率の上に置きます。この大きな ROI は今損傷 ROI 分析のためです。各フレームの平均投資収益率の蛍光強度を報告します
    。 注: ほとんどの市販の画像解析ソフトには 2 D 物体追跡のためのモジュールが含まれます、ワークフローのスピードアップと高いスループット (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ を参照) を容易にするユーザー開発の ImageJ やフィジーのマクロの数があります
    4. 。
  4. は、タイムラプスの各フレームに対応する参照 ROI の平均被害 ROI の蛍光強度を標準化します。投資収益率の参照として平均核蛍光強度を使用するここでは、(代表の結果は、 図 1 を参照). 平均から平均参照 ROI の蛍光強度を差し引くことによって正規化を実行できますROI の蛍光強度の損傷または平均を割って損傷投資収益率 ROI の蛍光強度の平均の参照によって蛍光強度
    。 注: 分割による正規化は、非常に低い基準強度値との状況で使用する場合、予期しない結果を生じることができます
    5. 。
  5. は、少なくとも 2 つのコントロールは、無傷の細胞だけでなく、すべての損傷した細胞を繰り返します。必要な場合は、さらに正規化の制御細胞の結果を使用できます
    6. 。
  6. グラフは実験的な治療の機能として募集のダイナミクスの変化が表示に時間をかけて強度値を正規化します
    7. 。

7。画像解析, 蛍光抗体法によって検出される蛋白質募集

  1. オープン前と後の被害画像画像解析アプリケーション。前損傷画像には、ROI(s) 使用マイクロ照射損傷が含まれています。標的細胞を識別する後損傷画像に、ROI(s) をコピーして貼り付けます
    2. 。
  2. のタンパク質募集分析の 6 x 6 ピクセルの投資収益率を生成し、ROI の損傷の場所でこの投資収益率。この大きな ROI は今損傷 ROI 分析のためです。投資収益率の蛍光強度の平均の破損を報告します
    3. 。
  3. は、対応する参照 ROI の平均被害 ROI の蛍光強度を標準化します。投資収益率の参照として傷つけられた細胞の平均の核の蛍光強度を使用するここでは、(代表の結果は、 図 1 を参照)。DAPI 信号閾値アルゴリズムを使用して、核を定義する参照の投資収益率を生成し、この地域を投資収益率に変換します。平均参照 ROI の蛍光強度を報告します。正規化 ROI の蛍光強度の平均の被害から平均参照 ROI の蛍光強度を差し引くことによってまたは平均被害 ROI 蛍光強度で割って平均参照 ROI 蛍光強度によって実行できます
    。 注: 分割による正規化は、非常に低い基準強度値との状況で使用する場合、予期しない結果を生じることができます
    4. 。
  4. すべての損傷した細胞に繰り返し、前述のように少なくとも 2 つの制御細胞の同じ分析を実行します
    5. 。
  5. グラフは実験的な治療の機能として募集蛋白質または DNA 損傷の種類の変更を表示する時間に対してマイクロ照射イベントを測定各強度値を正規化します
    6. 。

Representative Results

DNA 損傷の評価
基本病変および鎖の誘導は選択した核領域に適用されるレーザー照射量に依存して、細胞モデルの細胞の微小環境使用7。蛍光タンパク質融合修復タンパク質 Rad51 Ku70、53BP1 XRCC1 のような便利な 1 つを提供して二重鎖損傷上の ROI 内の蛍光蛋白の蓄積を見るために必要な最小限のエネルギーを確立するためブレーク マーカー、バック グラウンド蛍光9,19,31。応答を引き起こす条件を見つけたら、その特定の波長と線量による損傷の混合物を特徴付けるために重要です。用量と使用する波長で期間の減衰は、複雑な損傷、混合物の形成を最小限に抑えるためにユーザーを許可できます。UV A 範囲内のレーザーの低用量は主に SSBs と基本病変、SSBR および BER の経路10,28を勉強のために適切の少量を生産する実証されています。複雑な底の病変、酸化を作成投与量を増加し、UV 誘発し Dsb7,10のより重要な番号を誘導します。DNA 損傷の単一種の誘導は特定の DNA 修復経路の検討が望ましいが、それはユーザーは SSBs 基本病変や Dsb よりはるかに頻繁にされているような特定の病変を DNA 損傷の混合物を誘導することらしい。これは過酸化水素 (H2O2) またはメチル メタンスルホン酸 (MMS)32のような化学剤によって誘発された DNA 損傷の混合物と同様です。ユーザーは、彼らは混合物に損傷を与える結果が発生することが報告線量および損傷のサイトで病変の慎重な評価が再現性とその結果の比較可能性を確保するため必要なときに知っておく必要があります。

マイクロ照射研究 XRCC1 GFP が基本病変と SSBs9,28の誘導のためのマーカーとしてよく使用されます。XRCC1 は SSB 修理 (SSBR) で重要な役割を果たしている足場蛋白質と基本切除修理 (BER)、ヌクレオチド除去修復 (NER)33,34,35 のような他の修復経路にも関与.数 poly(ADP-ribose) ポリメラーゼ (PARP 1)、1 DNA ポリメラーゼ β を含むキーの蛋白質との相互作用、DNA 修復における重要な調整の役割を果たしている (Pol β)、および DNA リガーゼ III。SSBs と Dsb を生成するために必要なレーザーの用量を決定する XRCC1 GFP 安定 CHO ‐ K1 細胞で発現を利用しました。まず各波長 (図 1)、XRCC1 GFP の観察可能な募集を誘導するために必要な最小線量がわかりました。355 nm の波長に定義された被害 2 秒滞留時間 ROI は終わった背景 (図 1A) 検出可能な DNA 損傷の誘発を示す、ROI 内の高められた蛍光信号を生成されます。405 の nm、スキャン、8 fps のレート投資収益率 (図 1A) 損傷を観察可能な募集を生成する必要があります。投与量が増加し (10 秒 355 nm、405 の 0.5 fps で nm) より強い作成する投資収益率 (図 1A) に損傷を与えます。

損傷のサイトで、XRCC1 GFP の採用と保持しタイムラプス イメージングによって監視されました。DNA 損傷のサイトでタンパク質の保持可能性がありますに DNA 修復、損傷のサイトからタンパク質の解離はしばしば BER や SSBR の完了のためのマーカーと見なされます。ただし、修理が完成するとレーザー照射による DNA 損傷部位から、XRCC1 の解離のリンクの明確な証拠はありませんされて。損傷のサイトに蛋白質の募集を測定するには、全体の核 (図 1B) 測定平均蛍光信号に破損した ROI 内蛍光信号の平均の強さを報告します。興味の蛋白質の細胞分布に応じて他の正規化手法を用いることができるが、正規化のこのタイプはアドレス核の信号強度揺らぎを役立ちます。ここでは、正規化を核面積測定損傷 ROI への信号の再配布、XRCC1 は核コンパートメントでローカライズされます。投資収益率の平均蛍光強度は、タイムラプス、前損傷画像 (図 1C) の時間の関数としてグラフ化などのイメージごとに記録されます。

我々 は、さらに DNA 基本病変の形成を検討する 2 つの選択したレーザー線量による損傷を特徴付けられます。まず、CPD、かさばる紫外線誘起病変の形成は、NER 型病変 (図 2A) のマーカーとして蛍光抗体法によってプローブだった。その後、酸化誘導基本 lesion8-切断・酸化損傷は、BER 型病変 (図 2B) のマーカーとしてプローブだった。両方の波長の低線量の露出で CPD 病変の有意な増加は認められなかった (2 秒 355 nm 405 8 fps で nm) 高線量の両方の波長で治療しながら、(10 秒 355 nm、405 の 0.5 fps で nm) 蛍光灯で大幅な増加を見せた 投資収益率 (図 2A) 損傷の内で観察する信号。CPD の投資収益率の散布は損傷の形成と波長と用量、低用量で CPD 病変の低レベルがありますが、負荷が大きくできない可能性がありますを示すの両方で検出の各損傷細胞ショーの不均質性の強度を意味します。高用量が適用されるまでに検出されました。散布図には、損傷の混合の定量の正確さを制限可能性があります抗体の検出の効率の悪も示唆しています。

これはさらにマーカー 8 切断・酸化損傷 - によって誘導される酸化的 DNA 損傷の検出でハイライトされます。被害内蛍光信号の明確な増加はありません投資収益率ではレーザー波長または使用していません (図 2B) で 8 切断・酸化損傷が観察されました。この作業に使用する抗体は前出版物9,10,36; と一致してただし、抗体37,38と 8 切断・酸化損傷の形成を観察することに制限があることに注意してください。8-オキソグアニン DNA グリコシラーゼ (OGG1) DNA10から 8 切断・酸化損傷を除去するため責任がある酵素の募集のように、2 番目のマーカーによって勧め酸化誘起病変の欠如の確認もします。OGG1 募集当社 DNA 損傷サイトに見られなかったただし、酸化的 DNA 損傷の低レベルの形成支配して完全にできません。

最後に、Dsb の元で、53BP 1、γH2AX 2 つのマーカーを使用して形成を検討しました。蛍光抗体法による d レーザー線量 (図 3 & 4)。ΓH2AX、ストランド ブレーク マーカーとして使用されますが、レポート39,40数の Dsb に対する特異性を疑問視されています。さらに、鎖切断する信号の局在はこの信号の伝達のために制限できるように鎖休憩サイトから伝達されるリン酸化イベントです。したがって、被害の ROI 内 DSB 形成のより正確な評価のため、53BP 1 と γH2AX を組み合わせること。

マイクロ照射への γH2AX と 53BP 1 の応答は、波長と用量依存性の両方です。低用量 (2 s) 刺激 355 nm は 5 〜 20 分と両方のマーカーのための弱いと変数の応答の 10 分間ポスト照射 (図 3A) での反応を引き出します。高用量 (10 s) 355 nm マイクロ照射で 5、10、および 40 分 (図 3B) に低減されます 20 分ポスト照射損傷 ROI 内増加蛍光信号を誘発します。これらの結果を示す、355 nm 線量の滴定修復経路の相互刺激を最小限に抑えるために必要な初期の時点で二重鎖ブレーク マーカー γH2AX の減少の検出によって示されるように注意してください (< 20 分) 低用量で適用されます。

低 (8 fps) と高用量 (0.5 fps) 405 nm レーザ刺激法 (図 4) を使用して同様の実験を行った。この波長で損傷 ROI 内の蛍光強度の重要な蓄積は 53BP 1 の γH2AX これらの用量はほぼ単一および二重鎖切断の複雑な混合物を生成することを示す、適用用量に関係なく認めDNA 損傷 (図 4) の誘導後すぐ。さらに、405 nm を pan 核 γH2AX 染色損傷誘導 (図 4B下) の 10 分以内の増加の高用量を ROI の損傷の検出を困難 53BP 1 蓄積中のレポートは、被害投資収益率に含まれています。

これらの結果は、405 nm マイクロ照射が SSBR や BER、監視するために適切ではないと誘導病変と DNA 修復応答を完全に特徴づけること DNA の複数のマーカーを内転、ストランドの改を採用すべきことを明確に示します。

XRCC1 GFP の採用と保持の用量依存的変化
一度誘発 DNA 損傷が特徴づけられているマイクロ レーザーは DNA 修理蛋白質のダイナミクスを研究するための理想的なプラットフォームをすることができます。XRCC1 GFP の固定・解離動態は各波長によってさまざまな損傷が混合物の誘導は、予期しないが量依存性 (図 1) を示しています。最高の照射線量 (10 s および 0.5 fps) は、20 分時間経過 (図 1C) 低用量を基準にして、XRCC1 GFP の高強度募集と損傷のサイトで、XRCC1 GFP の保存期間の延長を示しています。これは 355、405 nm の高用量で作成された DNA 損傷は、外観と DSB マーカー、γH2AX、53BP 1 の保持と一致している実験の過程で解決されない可能性があることを示します (図 3 & 4).

興味深いことに、低損害用量 (2 s と 8 fps) 表示被害サイトする XRCC1 GFP の迅速な採用と予備照射レベル (図 1C) に実験的な回にわたって XRCC1 GFP の解離。損傷の混合物の完全な特性評価なしこれは SSBs と基本病変が完全に解決されるこれらの有害な条件を使用して結論に導くかもしれない。しかし、γH2AX と 53BP-1 355 の 40 分でのプレゼンス nm と、405 の 5 分で nm がさまざまな解釈につながる可能性があります。355 nm 2 の線量被害混合物可能性があります主に SSBs、40 分で DSB マーカーの外観は、いくつかの未修理病変を Dsb につながるかもしれない、または長い時間のスケールのこのエネルギーによって生成される Dsb が修復されますを示すことがありますので。SSBR と DSB の修復の時間スケールの違いは、以前に報告された28,41,42をされています。同様に、405 nm 低用量 (8 fps) 解離は SSBs の低レベルを示すことがありますまたはマイクロ照射と DNA 損傷物質を損傷のクラスタ リングの偏向に変換される急速に SSBs 高に記載されています、以前43,44,45。

一緒にこれらの結果は、損傷の混合物の評価の重要性を強調、複数の DNA を利用した修復タンパク質と通訳募集と DNA の保存のためのマーカー修復損傷部位でのタンパク質。

Figure 1
図 1.マイクロ レーザー誘導 XRCC1 GFP の募集です。
(安定 XRCC1 GFP を発現する A) CHO ‐ K1 細胞は照射され、損傷誘導直後をイメージします。マイクロ照射線量の場所を示す矢印とスケール バーは、10 μ m. (B) 募集は損傷の ROI 内平均蛍光強度を決定して全体の核の平均蛍光強度への正規化によって測定されます。(C) 募集のダイナミクスは、タイムラプス イメージごとに測定できます。グラフが SEM を表す誤差範囲を持つ 2 つの独立した実験の代表者 (n = 24)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.レーザー マイクロは、塩基損傷を誘発します。
CHO ‐ K1 細胞マイクロ レーザーを受ける, 損傷誘導直後後固定.CPD を検出する蛍光を行い 8 切断・酸化損傷の付加します。(A) 上部には、CPD の染色後損傷した細胞を ROI の平均蛍光強度で観察の散布。下、CPD の染色の代表的なイメージ。マイクロ照射の位置を示す矢印とスケール バーは 10 μ m (n = 12)。(8 切断・酸化損傷汚損のため B) 代表的なイメージ。矢印マイクロ照射の位置を示すし、スケール バーは、10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.DNA 二重鎖ブレーク マーカーは用量依存的に 355 nm マイクロ照射に応答します。
CHO ‐ K1 細胞マイクロ照射を受ける, 時間ポイント示された後刺激で固定.DSB マーカー γH2AX と 53BP 1 蛍光抗体法を行った。(A) 投資収益率は、破損、損傷した細胞の蛍光強度測定を意味正規化された損傷の散布図。誤差は、SEM の代表者 (n = 12)。(ΓH2AX と 53BP 1 染色 B) 代表的なイメージ。マイクロ照射の位置を示す矢印とスケール バーは、10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4。DNA 二重鎖ブレーク マーカーは確実 405 nm マイクロ照射に応答します。
CHO ‐ K1 細胞マイクロ照射を受ける, 時間のポイント示されたポストの刺激で固定.DSB マーカー γH2AX と 53BP 1 蛍光抗体法。(A) 投資収益率は、破損、損傷した細胞の蛍光強度測定を意味正規化された損傷の散布図。誤差は、SEM の代表者 (n = 12)。(ΓH2AX と 53BP 1 染色 B) 代表的なイメージ。マイクロ照射の位置を示す矢印とスケール バーは、10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

ここで説明されている条件を使用して、UV A または 405 nm のレーザー、または製造元によって統合されたエンド ・ ユーザーによって追加された共焦点顕微鏡することができます細胞の核内の DNA 損傷を誘発して DNA 修復タンパク質のサイトに募集を許可します。監視対象となる DNA 損傷を誘発します。ただし、プロトコルおよび代表的な結果、波長選択でない限り力を適用、すべて修復経路の特定の DNA を研究するためにユーザーが最初に対処しなければならない問題の重要な特性です。また、ユーザーによっても考慮する必要があります実験のデザインでその他の考慮事項があります。

生きているセルの記事でタンパク質の挙動を監視するために, マイクロ照射蛍光に分類された蛋白質を作らなければなりません。スペクトルに分けることができる蛍光蛋白質の広い範囲の可用性では、DNA 損傷の誘発細胞応答を特徴づけるために使用ことができます蛋白質の融合を作成するためのツールを提供しています。興味の蛍光タンパク質のトランスフェクションにより有害な条件や突然変異も阻害剤の迅速なスクリーニングのため固定して transfected セルを提供しながら表現のレベルの詳細に制御、他の生化学は、実行される特徴マイクロ照射の結果を検証します。波長の異なる蛍光蛋白質は蛋白質同じ経路内または異なる経路間の相互作用を監視する同じセルにも利用できます。蛍光タンパク質はまた興味の各蛋白質のための特定の抗体のための必要性を排除し、生細胞は損傷の誘導の後の時間の長い期間のため蛋白質の動作の監視を許可します。

ただし、蛍光タンパク質の使用にも欠点があります。興味の蛋白の欠損遺伝的背景なし蛍光付けられた蛋白質と内因性のタンパク質を競います。蛍光タンパク質の N または C 末端タグの活用がタンパク質の折り畳みを変更、キーの蛋白質蛋白質の相互作用を妨げるまたは転信号をブロック関数の変更および募集のダイナミクスに影響を与える可能性があります。これらの効果は、免疫蛍光染色, 劇的に異なる募集被害サイト28で内因性のタンパク質の保持時間レポートの数で実証されています。トランスフェクションや安定したクローンの使用もタンパク質発現レベルの変動を通して、通常観察応答を変更できます。さらに、単一の実験で複数の蛍光タンパク質の使用可能性がありますものダイナミクスを変更募集、蛋白質のレベルがよく平衡ない場合、または大きな蛍光タグ付きタンパク質の募集ブロック他の蛋白質の募集.最後に、弱い感作性剤、活性酸素種の形成の増加と潜在的 DNA 損傷の混合物誘導46,47を変更として蛍光タンパクを使用できます。これらの欠点にもかかわらず、蛍光蛋白質提供勉強 DNA の明確な利点の数マイクロ照射の修復し、新しい洞察力を提供することができますユーザーは、ここで説明の損傷評価などの適切なコントロールを組み込む場合応答および蛋白質蛋白質の相互作用3を損傷します。

ライブセル イメージングが必要ない場合、蛍光は損傷への応答を監視する使用できます。特定のタイミングでセルを固定することによって損傷誘導と染色抗体タンパク質とタンパク質を構築することができます修理の保持および興味、損傷誘導の静的なスナップショットと募集の病変のために特定を記事します。抗体を使用して利率や翻訳後修飾 DNA 損傷応答による複数のタンパク質の募集を監視することができます。蛍光抗体法の使用は蛍光タンパク質の必要性を排除、調査する内因性のタンパク質の動作できます。ただし、この方法にも欠点があります。特異性の高い抗体が必要で、透過と遮断手順十分な信号強度と募集の検出を実現するように最適化する必要があります。固定プロシージャは瞬時にない、この物理的な制約は、このアプローチの時間分解能を制限します。細胞は染色後再配置することができます損傷誘導サイトのマッピングも重要な課題が生じます。この作業で使用する共焦点顕微鏡でき画像レジストレーションのため前述のように、損傷した細胞を高精度に移動できます。損傷誘導とイメージの募集と固有の遅延と相まって、ステージ登録せず移転細胞が蛍光抗体法をすることができるステージ登録またはエッチング coverglass が利用できない場合、投資に関与します。一部のユーザーに魅力がないです。しかし、最も正確かつ完全なマイクロ照射実験デザインは提案するプロトコルで説明するよう蛍光タンパク質の使用と並行してアプローチのこれらのタイプを組み込む予定します。

ここでは、ライブセル イメージングと蛍光抗体法、マイクロ レーザーの有用性を検証する使用されます。免疫蛍光染色により作成された DNA 損傷の混合物を正確に調べると方ができる各レーザによる蛋白質の募集募集と XRCC1 GFP の保持の観察された変化を解釈します。これらの結果に基づき、405 nm レーザーの使用は BER と SSBR タンパク質の検査のため限られたする必要があります。さらに、最適な実験的なデザインには、目的、使用すると、セルの行ごとに完全混合特性および募集の検証後パワー測定が含まれます、蛍光で観察された保持タグが付いている蛋白質蛍光抗体法。明らかに、設備、時間、およびコストに関する考慮事項不可能になるこれらの最適な実験設計一部のユーザー。これらの各要素の重要性を紹介し、ユーザーする必要がありますこれらの考慮事項場合覚えておいてマイクロ照射実験を開始します。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、博士サミュエル ・ h ・ ウィルソンで、国立環境衛生研究所この作業で使用する細胞のために感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope Nikon
NIS Elements software Nikon
355 nm laser PicoQuant VisUV Radiation source
Galvanometer photoactivation miniscanner Bruker
Microscope slide photodiode power sensor THORLabs S170C
Fiber photodiode power sensor THORLabs S150C
Digital handheld optical power and energy meter THORLabs PM100D
CHO-K1 From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Minimal essential media Hyclone SH3026501
Fetal bovine serum Atlanta biologicals S11550
XRCC1-GFP Origene RG204952
Jetprime Polyplus transfection 11407
Geneticin ThermoFisher 10131035
4 chambered coverglass ThermoFisher 155382
8 chambered coverglass ThermoFisher 155409
Anti 53BP-1 Novus NB100304
Anti-phospho-histone H2AX  Millipore 05-636-I
Anti cyclobutane pyrimidine dimer Cosmo Bio clone CAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine  Trevigen 4354-MC-050
Alexa 488 goat anti-mouse ThermoFisher A11029
Alexa 546 goat anti-rabbit ThermoFisher A11010
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher R37606 Caution toxic!
Phosphate buffered saline ThermoFisher 0780
Normal goat serum ThermoFisher 31873
Bovine serum albumin (BSA) Jackson Immuno Research 001-000-162
37% Formaldehyde ThermoFisher 9311 Caution toxic!
Ethanol Decon Labs 2716
Methanol VWR BDH1135 Caution toxic!
HCl Fisher SA49
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Caution toxic!
Tris Hydrochloride Amresco O234
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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References

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がん研究、問題 127、DNA 修復、レーザー マイクロ照射、DNA 損傷、ストランドの休憩、XRCC1、ガンマ H2AX、ストランドのブレーク信号
マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション
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Holton, N. W., Andrews, J. F.,… More

Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (127), e56265, doi:10.3791/56265 (2017).

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