Summary
공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.
Abstract
높은 조정된 DNA 복구 경로 검색, 소비 세 및 손상 된 DNA 기초, 대체 및 DNA 가닥 나누기의 복구를 조정 존재 한다. 분자 생물학 기술 구조, 효소 기능 및 복구 단백질의 활동을 명확히 해야, 하는 동안 아직도 어떻게 수리는 핵 내에서 조정 필요가 하다. 레이저 마이크로-방사선 DNA 손상 유도 및 복구 단백질의 신규 모집을 모니터링을 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 레이저 마이크로-방사선에 의해 DNA 손상을 유도 파장의 범위와 함께 발생할 수 있으며 사용자가 안정적으로 단일 가닥 나누기, 기본 병 변 및 복용량의 범위와 이중 가닥 나누기를 일으킬 수 있다. 여기, 레이저 마이크로-방사선 조사 선 단일 및 이중 가닥 나누기 두 일반적인 confocal 레이저 파장, 355에 의해 유도 된 검사는 nm, 405 nm. 사용자 reproducibly 레이저 마이크로 조사 데이터 수집 및 분석을 수행할 수 있도록 유도 하는 특정 손상 혼합물에 적용 된 레이저 복용량의 추가, 적절 한 특성 설명 되어 있습니다.
Introduction
형광 현미경 검사 법은 셀룰러 아키텍처를 시각화 하 고, 단백질 지 방화, 시험 하 고 단백질-DNA와 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링 하는 강력한 기법으로 떠오르고 있다. DNA 손상 응답 글로벌 DNA 손상 자외선 (UV) 등 에이전트의 응용 프로그램 후 공부를 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이온화 방사선, 화학 산화 alkylating 에이전트, 또는 chemotherapeutics 제공 하고있다 새로운 통찰력 시작, 신호, 및 DNA의 모집 단백질 DNA 손상1,2의 사이트를 복구 합니다. 그러나, 이러한 글로벌 및 손상 이벤트 비동기는 제한 경우 채용 순서, 협회 또는 분리의 활동에 대 한 자세한 정보 및 주요 DNA 수 선 단백질 사이의 관계는 모색 하 고 있다. 다행히, 레이저 confocal 현미경 검사에서 발전, 손상 유도 레이저 파장, 및 형광 단백질에서 지난 25 년 동안 개선의 광범위 한 가용성 제공 향상 된 도구와 연구원은 이러한 검사 타겟된 DNA 손상 유도 통해 DNA의 복구.
세포 및 subcellular 기능을 공부 하기 위하여 레이저 microbeams 셀의 조사는 셀 및 방사선 생물학3확고 도구입니다. DNA 수리의 학문에이 기술의 응용 프로그램 등장 Cremer 및 동료 사용 매우 초점을 맞춘 UV (257 nm) 중국 햄스터 난소 (CHO) 자리는 0.5 µ m 이상의 DNA 손상 유도 레이저 microbeam 체계4 세포와의 유도 설립 DNA photolesions이 시스템5. 동안 제공 크게 향상 UV microbeam 방법에 비해이의 입양 당시 시스템을 손상의 특수 설정, 및 생성을 하지 못하는 제한 된 이중 가닥 나누기 (DSBs)6. 자외선 B (290-320 nm)와 UV의 다양 한 후속 조사-몇명의 그룹에 의해 (320-400 nm)의 파장 UV photoproducts, 산화 병 변, 기본 밝혀 단일 가닥 (SSBs), 휴식과 DSBs 레이저 파장에 따라 유도 될 수 및 파워4,7,8,,910 ( 3에서검토) 적용. 또한, 이러한 자외선-B와 자외선 파장 sensitizing psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU), Hoechst 염료, 같은 에이전트와의 조합 또한 발견 했다 파장, 전력, 그리고 노출의 기간에 DNA 손상을 유도 하 능력을 필요 유도 피해는 종종 이러한 에이전트11,12,13,,1415의 낮 췄 다. 이러한 방법의 더 넓은 채용을 위해 해결 되어야 아직 기술적인 장애물 있었지만 이러한 발전 마이크로-방사선의 사용 확대.
Cremer와 동료 셀에서 매우 지역화 된 영역 중요 한 파괴적인 에너지를 적용할 UV microbeam 정확 하 게 집중 하 여 마이크로-방사선 분야 고급 크게. Confocal 현미경과 레이저 서 시스템 고급, 긴밀 하 게 초점 맞춘된 빛이 더 광범위 하 게 액세스할 수; 그러나, UV 소스 범위에 커플링 하 고 그들은 여전히 유도 색수차를 다루는 대부분 사용자3,,616에 상당한 도전을 제시. UV 높은 만들 수 있는 능력에 초점을 맞춘 UV 염료 광학 초점의 수는 1990 년대 내내 인기에서 증가 하 고 캡처 UV 흥분 형광 되었다 더 광범위 하 게 사용할 수 있는16, 사용자가 제공 하는 레이저 스캐닝에서 개선 여기 셀6,17내 명소. 그러나, 그것이 2000 년대 초반까지 수많은 보고서와에 sensitizers 없이 DNA 가닥 나누기 유도 될 수 있는 시연 등장 때 높은 강도 레이저와 밀접 하 게 집중 된 광속의이 조합은의 진정한 영향 생각 했다는 UV-A 범위6,10,18,,1920, 405 nm21,22,,2324, 25,26, 488 nm27처럼 더 이상 보이는 파장에도. 이러한 발전은 다양 한 상업 시스템에 마이크로-방사선 조사 기술의 더 광범위 하 게 채택에 대 한 허용. 이러한 개발 병행, 2 광자 기술 또한 등장 DNA 손상;의 정확한 유도 허용 이러한 진보는 여기 논의 될 것입니다, 하지만이 방법론9,,2829,30논의 검토 기사 수가 있다.
Confocal 현미경 매우 집중된 UV 빛 및 DNA 수 선 단백질의 실시간 추적을 허용 하도록 형광 단백질의 대폭적인 가용성의 수의 현재 접근와 마이크로-방사선 조사 기술 진화 DNA 손상 응답 및 복구 경로 조사 하기 위한 강력한 도구. 그러나, 사용자는 DNA 손상의 세대는 매우 레이저 파장 및 하위 핵 영역에 적용 하는 파워에 의존 해야 합니다. UV-C의 사용 (~ 260 nm) 직접 DNA 여기 및 UV photoproducts7,8의 유도 대 한 높은 선택도 허용 하는 파장. 자외선-B와 자외선 A 파장이 DNA 손상 (기본 병 변, SSBs, 및 DSBs)의 혼합물을 생성, 적용 능력과 세포 배경에 따라 활용7. 타겟된 세포에 산화 수준과 생 photosensitizers이이 파장을 제작한 DNA 손상 혼합물을 좌우할 수 있다. 또한, 외 인 photosensitizers (BrdU, 등)를 사용 하 여 DNA 손상의 유도에 필요한 에너지를 낮추는에 도움이 수 있습니다. 그러나, 이러한 에이전트 스스로, DNA 손상을 일으킬 수 있다 그리고 그들의 사용 사용자가 고려해 야 하는 원치 않는 효과 생산할 수 있습니다 그래서 세포 주기 및 염색 질 구조를 변경할 수 있습니다 그들은. 따라서, 마이크로-방사선 조사를 사용 하 여 DNA 손상 응답 및 수리 공부를 하기 전에 관심, 사용, 사용할 수 있는 파장 그리고 만든 DNA 손상 혼합의 DNA 수 선 통로의 신중한 고려가 필요 합니다.
여기, 레이저 마이크로-방사선 두 가지 일반적으로 사용 되 파장, 355에서 수행 됩니다 및 405 nm,이 파장 및 이러한 손상 혼합물의 수리 검토에 영향에 의해 유도 된 DNA 손상의 혼합물을 보여 sensitizers 없이SSBs 및 DSBs. 사용자는이 파장 스트랜드 나누기 또는 기본 병 변의 단일 종 생성 하지 않는 알고 있어야 합니다. DNA 복구 경로 구분 하기 위해 사용자는 핵의 특정 영역에 적용 된 파워 제어 고 여러 가닥 휴식 마커 및 DNA 병 변 항 체를 사용 하 여 유도 된 손상 특성화 신중 하 게 해야 합니다. 제대로 적용을 특징 레이저 마이크로-방사선 DNA 손상으로 일부 기본 병 변 및 SSBs 또는 DSBs, 수리를 평가 하기 위해 사용자의 일부 수 종을 풍요롭게 수 있습니다. 따라서, 우리 사용자가 reproducibly 레이저 마이크로-방사선 조사를 수행, 적용 된 레이저 복용량에 의해 유도 된 DNA 손상 혼합물의 특성 및 데이터 분석을 수행 하는 방법을 제공.
Protocol
1. 세포 배양 및 안정 된 세포의 생성
- 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 하는 최소한의 필수 매체에 성장 조-K1 셀. 5% CO 2 37 습도 인큐베이터에서 셀 유지 ° c.
- C 터미널으로 인간의 XRCC1를 포함 하는 플라스 미드 DNA의 1 µ g 조-K1 transfect 세포 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 제조 업체에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 ' s 지침.
- 선택 조-K1 XRCC1 GFP 표현 인구를 이용한 형광 세포 분류 (FACS)를 사용 하 여 풍부 하 게 안정적으로 800 µ g/mL geneticin를 사용 하 여 인간의 XRCC1 GFP 융합을 표현 하는 셀.
- 그래서 그들은 약 75% 또는 더 큰 confluency에 도달 다음 날 coverglass 바닥으로 문화 선박에 마이크로 반구 되도록 플레이트 세포. 셀 사이의 공백은 바람직한 돌아가려면 동일한 이미지 필드 (설명된 섹션 3.2) 등록을 사용 하는 경우에 특히 일부.
2. 현미경 설정
마이크로-방사선/photostimulation에 대 한 적합 한 레이저 및 광학, 및 제어 소프트웨어를 갖춘- 레이저 스캔 선택 confocal 현미경. 355 nm 레이저, 검 류 계 photoactivation miniscanner에 섬유 결합을 포함 하도록 수정 된 confocal 현미경 스캐닝 레이저 실험 사용을 제시 하 고 제조 업체를 사용 하 여 제어 ' s 제어 및 분석 소프트웨어. 이 시스템은 마이크로-방사선 조사 (ROI)의 사용자 지정 영역에서 photoactivation miniscanner (355 nm 레이저) 또는 표준 confocal 검 류 계 (405 nm 레이저)를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
- 마이크로-방사선, 마이크로 조사 광에 모든 광학 구성 요소는 선택한 파장에 적합 확인에 사용할 파장 선택.
참고: 제시 시스템 사용 355 nm 마이크로-방사선, 자외선 필터 큐브 함께 40 × C-Apochromat (수 가늠 구멍 (NA) 1.2) 기름 침수 목표 및 표준 공초점 레이저 광을 사용 하 여 20 × C-Apochromat (NA 0.75) 건조 목적 대 한 방사선-405 nm 마이크로. 설치에 사용 되는 20 × 목표 355 nm 파장;와 호환 되지 않습니다. 따라서 우리 용 40 × 355 nm만. 면역 형광 검사 프로토콜 하류 침수 기름 떨어져 청소 없이 적용 될 수 있습니다 손상 건조 목표를 사용 하 여,이 때문에 우리가이 목표를 가능 하면 사용. - 는 마이크로 방사선 실험에 대 한 현미경을 구성합니다. 실험 간의 일관성을 유지 하려면 각 유형의 마이크로 조사에 사용할 현미경 부품의 표준화 된 구성을 지정 합니다. 이러한 설정을 현미경 내 프리셋으로 저장 ' 운영 소프트웨어, 가능 하면 s.
참고: 제시 시스템에서 셀 마이크로 반구 있으며 단방향 검색, 검색 줌, 1 1024 x 1024 픽셀의 스캔 해상도 사용 하 여 몇 군데 8 프레임 (초당 프레임), 그리고 pinhole의 프레임 속도로 설정 약 4 공기 단위 (AU)로 488 nm 레이저 (69 µ m)에 대 한 결정. 이 오픈 pinhole 설정을 낮은 레이저 파워를 이미징 및 photobleaching 감소 사용할 수 있도록 각 이미지에 캡처된 빛의 양을 최대화 하기 위해 선정 되었다.
3. 레이저 마이크로 조사
- 장소는 준비 문화 접시, 현미경 스테이지 및 장소에 안전 하 게 잠금에 관심사의 세포를 포함 하.
- 가능 하다 면, 무대 상단 인큐베이터에서 연 발된 슬라이드 놓고 손상 유도 중 5% CO 2와 37 ° C에서 유지 합니다. 이 단계는 라이브 셀 timelapse 이미징 또는 긴 세션 이미징에 대 한 가장 중요 한. 그렇지 않으면 장소 세포는 현미경에 무대와 실내 온도에 조사 수행 (~ 25 ˚C), 다음 신속 하 게 돌아가려면 셀 5% CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터.
- 연구원 고정, 얼룩, 또는 다른 절차를 수행한 후 같은 위치로 돌아갈 수 있도록 이미지 필드를 등록. 인코딩된, 자동화 된 현미경 단계를 사용 하 여 손상 된 필드의 등록을 수행 하거나 XY 위치의 에칭 또는 레이블이 눈금 문화 coverglass 혈관 세포.
- 문화 선박 (즉, coverglass 또는 우물 사이 방 벽의 모서리)의 인식할 수 있는 기능을 선택 하는 이미지를 수집 하 고 XY 위치를 기록 소프트웨어 이미지 등록을 사용 하 여
- . 이 정렬 및 선택한 필드를 다음 샘플 준비의 XY 위치 등록에 대 한 허용 됩니다.
- 수동 등록을 사용 하는 경우 기록 그리드 또는 각 필드에 대 한 에칭된 위치 수동으로, 스테이지의 방향 및 접시의 배치를 기록 주의.
- 셀 문화 선박에 대 한 식별 기능이 없는 사용할 수 있다면 세포 형태 및 밀도의 검사에 의해 손상 된 필드를 식별 합니다. 충분히 고유한 기능 나중 이미징 동안 인식할 수 있는 필드를 선택 하.
참고:이 방향 및 지역 문화 선박의 밀접 하 게 제한 하지 않는 한 수행에 시간이 걸릴 수 있습니다.
참고: 단계 대조 및 DIC 이미징의 유용한 기능은 초점 비행기는 샘플을 통해 이동, 동일한 기능 또는 나타날 수 있습니다 빛 상대 초점면에 따라 어두운 하는 사실 이다.
- 핵소체, 같은 핵 내의 명확한 기능을 선택 하 고 모양에 있는이 변화를 관찰 하는 동안 아래로 초점면을 이동. 진정한 초점면 빛에서 어둠에 전환 내 거짓말을 합니다. 샘플을 집중 하는 선택 된 기능에 날카로운 대조 초점 평면을 선택.
- 형광 단백질을 사용 하지 않는 실험 단계 대조 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 대물 이미지를 식별 하 고 핵 손상에 대 한 기록 취득 대.
- 라이브 셀 형광 단백질을 사용 하 여 실험에 대 한 명시와 형광 채널 관심 (즉, 레이저 라인 488 nm GFP, RFP의 여기에 대 한 레이저 라인 561 nm의 여기에 대 한)의 단백질을 포함 하는 이미지를 취득 합니다. 실험 조 K1 XRCC1 GFP를 사용 하 여, 형광 흥분된 488 nm 레이저 라인으로 동시에 수집 전송 DIC는 명시 야 채널.
- 제시 시스템 제어 레이저 복용량 총 시간으로 보냈다 피해 ROI를 검색. 355 nm 레이저 검 류 계, 고정된 스캔 속도에서 작동 하기 때문에 레이저 복용량은 반복적으로 선택한 손상 ROI 검색 소요 시간에 의해 제어: 데이터에 여기에 제시 된, 마이크로-방사선 355에 nm는 2 초에서 10 초에 대 한 수행.
- 반면, 스캔 속도 변조 하 여 405 nm 레이저 복용량을 제어 하 고 선택 된 손상 ROI의 한 검색을 수행. 데이터 p마이크로-405에서 방사선에 대 한 8 및 0.5 fps를 사용 여기에 분개, nm. 레이저 스캔 하는 동안 각 픽셀에 적은 시간을 지출 하기 때문에 8 fps의 스캔 속도 0.5 fps 보다 낮은 레이저 복용량을 제공 합니다. 두 레이저는 100% 전력에서 운영 한다. 직접 레이저 전력 측정에 대 한 지침은 3.7 섹션을 참조 하십시오.
참고: 각 개별 현미경 시스템 지정 투자 수익, 어떻게 유사 355 레이저 파워를 전달 하는 방법에서 다를 수 있습니다 및 405 nm 제시 시스템에 다릅니다. 사용자가 그들의 현미경 시스템에 대 한이 절차를 확인 하 고 그들의 방법 섹션에서 이러한 매개 변수를 보고 해야 합니다. - 라이브 셀 이미징에 대 한 명시와 형광 채널 timelapse 이미지 수집을 수행. 기간 및 데이터 수집, 이상적으로 실험의 시간 과정 동안 손상 ROI에 형광 단백질의 분리의 축적을 캡처 최적화 timelapse의 주파수를 조정 합니다. 실험 XRCC1 GFP를 사용 하 여 수집 이미지 20 분 30 초 마다.
참고: timelapse 영상의 주파수 축적 및 분리 분석을 복잡 하 게 fluorophore의 photobleaching에 의해 제한 될 수 있습니다. Photobleaching는 timelapse 동안 손상 되지 않은 세포를 관찰 하 고 이러한 손상 되지 않은 세포에 형광 신호 손실을 최소화 하기 위해 인수 조건 조정 하 여 평가할 수 있습니다. 일부 photobleaching 수 있습니다 피할 수 있는, 그래서 사용자는 timelapse의 각 프레임에서 손상 되지 않은 세포의 손상 된 세포의 형광 강도 정상화 하 여 신호 손실에 대 한 보상 수 있습니다.- 시간 과정을 완료 한 후 손상에 대 한 셀의 새 필드를 선택 하거나 섹션 4에서에서 설명한 대로 추가 분석에 대 한 손상 된 세포를 수정.
- 계속 마이크로-방사선 및 timelapse 이미징 손상 된 세포의 원하는 수에 도달할 때까지.
참고: 유도 된 손상에 대 한 응답에서 셀 셀이 평가 선택한 조건 당 10-25 셀의 총을 손상 하는 것이 좋습니다. 대부분 confocal 시스템 사용자가 각 마이크로 조사 하는 동안 하나 이상의 셀을 손상 하면, 비록이 정열된 손상 개시 시간, 큰 수를 셀의 피크 모집 시간 분석을 복잡 하 게 수 또는 분리 시간 소개 빠른 이벤트에 대 한. 일부 시스템에서 여러 ROIs 이상 동시 손상 유도 각 독립적인 투자 수익을 받은 레이저 복용량을 줄일 수 있습니다. 따라서, 직접 사용자 이러한 타이밍/전원 문제를 해결 하지 않는 것이 좋습니다 셀 개별적으로 손상 될.
- 면역 (IF), 형광 분석 수행 손상 및 중 즉시에 설명 된 대로 셀, 수정 4, 또는 시간 (즉, 1, 5, 10 또는 20 분)의 선택 된 증가 복구 하는 세포를 허용. 원하는 시간이 지난 후 수정 하 고 섹션 4에서에서 설명한 대로 셀을 얼룩.
- 분석에 대 한 전반적인 세포 수를 증가, 손상 후 손상 응답의 다중 필드 시간 과정 생성 하 문화 선박 내에서 추가 필드를
- . 손상이 발생 한 시간과 각 필드의 XY 위치를 기록 합니다. 원하는 총 후 시간 경과 복구, 수정 및 아래 설명한 대로 셀을 얼룩.
- 레이저 파워를 측정 하는 센서 원하는 구성에 후 섬유 (post-objective) 놓고 전원 측정기에 의해 측정을 기록 하는 동안 위에서 설명한 대로 마이크로 조사를 수행 합니다. 파워 미터의 샘플링 속도 충분히 빨리 파워 미터 정확 하 게 적용 된 복용량을 감지 하도록 실험의 여러 반복을 실행 해야 할 수 있습니다 그래서 매우 빠른 마이크로 조사 이벤트를 잡으려고 하지 않을 수 있습니다 것을 유의.
참고: 355 nm 레이저에 대 한 약 5 mW 후 섬유와 약 19 µW 후 목표의 평균 피크 전력을 측정 했습니다. 405 nm 레이저에 대 한 마이크로-방사선의 파워 미터의 0.01 s 최대 샘플링 속도 1.5의 평균 피크 힘을 극복 하기 위해 30 반복 루프에서 수행한 mW 및 2.4 mW의 8, 0.5 프레임 / 초 스캔 속도 사용 하 여 측정 되었다 각각. 모든 파워 미터는 다릅니다. 사용자 운영 파장 및 그들의 개인 전원 측정기에 대 한 샘플링 속도 결정 해야 합니다.
4. 면역 형광 검사 절차를 얼룩
- 경우 얼룩에 의해 분석 가닥 휴식 유도.
- 수정 셀 3.7% 포름알데히드 (주의) 인산 염 (PBS) 10 분 Aspirate 포름알데히드 솔루션 및 PBS로 3 회 세척 버퍼링. 프로토콜 PBS 셀을 다시 배치 하 여 여기에 중지할 수 있습니다 및 셀 4 ˚C에 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.
주의: 포름알데히드는 독성과 발암 성 이다. 착용 적절 한 개인 보호 장비 및 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시 되는 것으로 서 독성 물질의 dispose. - 0.25%를 사용 하 여 세포를 permeabilize PBS로 3 회 10 분 실 온 (RT)와 다음 세척에서 PBS에 트라이 톤 X-100.
- 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실시간에서를 포함 하는 PBS에서 30 분 동안 배양 하 여 블록 일반적인 항 체 바인딩
- 53BP-1 둘 다 1:750 RT에 1 시간에 1 %BSA 포함 하는 PBS에 희석 후 PBS로 3 번 세척에 대 한 기본 polyclonal 항 체와 γH2AX에 대 한 기본 monoclonal antibody 품.
- 알 렉 사 488 염소 반대로 마우스와 알 렉 사 546 염소 안티 토끼 품 셀 1: 2000 RT에 1 시간에 1 %BSA 포함 하는 PBS에 희석와 다음 PBS로 3 회 세척.
- 얼룩 DAPI의 10 mg/mL 해결책 핵 DNA (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, 주의) 5 분, 또는 사용 하 여 유사한 핵 염료, PBS에서 1: 5000 희석 및 후 PBS로 3 회 세척.
주의: DAPI 독성 및 돌연변이 이다입니다. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시로 독성 물질 폐기. - 장소 PBS 또는 PBS + 0.1% 나트륨 아 지 드 (주의) 스테인드 셀에 다시. 프로토콜 여기 중지 될 수 있습니다 및 셀 몇 일 동안 4 ˚C에 저장 하거나 섹션 5에서에서 이미지 수집.
주의: 나트륨 아 지 드 이다 독성. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시로 독성 물질 폐기.
- 수정 셀 3.7% 포름알데히드 (주의) 인산 염 (PBS) 10 분 Aspirate 포름알데히드 솔루션 및 PBS로 3 회 세척 버퍼링. 프로토콜 PBS 셀을 다시 배치 하 여 여기에 중지할 수 있습니다 및 셀 4 ˚C에 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.
- 분석 유도의 기본 병 변 또는 DNA adducts 경우 얼룩에 의해.
- 수정 및 차가운 메탄올 (주의)-20에서 20 분 동안에 세포를 permeabilize ° c.
주의: 메탄올은 유독 하 고 가연성. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시로 독성 물질 폐기. - 발음 나는thanol 15 분 프로토콜에 대 한 완전히 건조 샘플 여기 중지 수와 최대 3 일 동안 건조-20 ˚C에 저장 하는 셀.
- 15 분에 대 한 PBS에 셀 리하이드레이션
- Denature RT와 PBS로 3 회 세척에서 45 분 2 N HCl (주의)를 사용 하 여 DNA.
주의: HCl 부식성입니다. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시 부식성 물질을 처리. - PBS 가진 3 세척 뒤 5 분 동안 50 mM Tris HCl pH 8.8에에서 중화.
- 0.1%와 5% 정상 염소 혈 청 만들어진 블로킹 버퍼 품 세포 실시간에서 1 시간에 대 한 PBS에 트라이 톤 X-100
- PBS로 3 회 8-옥 소-2´-deoxyguanosine (8-oxodG, 1:400) 또는 cyclobutane pyrimidine 이합체 (일일, 1:1, 000) RT, 및 다음 씻어 1 시간에 대 한 염소 혈 청 블로킹 버퍼에 대 한 1 차 항 체와 품.
- 셀 렉 488 염소 염소 혈 청 블로킹 버퍼에 RT, 1 시간에 1: 2000 비율에서 반대로 마우스를 품 어 그리고 PBS로 3 회 세척.
- 핵 DNA PBS에 5 분, 1: 5000 DAPI (10mg/mL)을 사용 하 여 얼룩 하 고 PBS로 3 회 세척.
- 경우 연 발된 coverglass를 사용 하 여 배치 PBS 또는 PBS + 0.1% 나트륨 아 지 드 스테인드 셀으로 다시. 프로토콜 여기 중지 될 수 있습니다 및 셀 몇 일 동안 4 ˚C에 저장 하거나 섹션 5에서에서 이미지 수집.
- 또는 추가 coverglass 문화 선박 위에 배치 될 수 있습니다 경우 기본 장착 매체에 셀을 탑재 합니다. 일단 치료, 탑재 된 셀 시간의 오랜 기간 동안 4 ˚C에 저장할 수 있습니다.
- 수정 및 차가운 메탄올 (주의)-20에서 20 분 동안에 세포를 permeabilize ° c.
5. 면역 형광 검사 실험에 대 한 수집 이미지
- 에탄올 문화 선박의 coverglass 하단을 청소 하 고 다시 제자리에 confocal 현미경 단계. 위치 기록 손상 유도 되었다 때 방향에 해당 하는 방향과 무대에서 선박의 위치 확인 하십시오. 최적의 등록 및 영상 문화 선박 보안.
- 이전 몇 군데 찾기 필드 등록 기술을 사용 하 여 선택 (설명된에 3.2).
- 수동 등록에 대 한 에칭된 그리드와는 coverglass를 사용 하 여 가져올 그리드 포커스와 마크를 식별 하는 찾을. 사용 하 여 손상 된 세포를 찾으려고 XY 좌표를 기록 하는 다음.
- 이미지 기반 자동된 등록을 위한 단계, 3.2.1에서에서 참조로 사용 하는 구조적 기능 찾아서 다음 현재 라이브 현미경 보기 가능한 기록 된 이미지를 밀접 하 게 정렬. 일단, 현재 XY 현미경 단계 위치를 측정 하 고 참조 이미지의 XY 위치에 그것을 비교. 두 위치 사이의 선형 거리 X 및 Y 오프셋을 정의합니다. 이 오프셋 비친된 셀을 포함 하는 이미지 필드를 식별 하기 위해 각 기록 된 XY 위치에 적용 됩니다. 이 오프셋된 함수를 현미경 제어 소프트웨어에 자동 또는 수동으로 수행할 수 있습니다.
- 없는 적절 한 등록 포인트를 식별할 수 수동으로 슬라이드를 검색 하 고 이전 확인 된 셀 기능을 찾는 하 여 세포를 찾습니다.
- 명시 이미지 (섹션 2.3에에서 설정 하 고 섹션 3.3에서에서 초점)를 포함 하 여 모든 스테인드 목표를 수집 적절 한 현미경 설정을 사용 하 여 이미지. 제시 실험, 멀티 채널 이미지 다음 여기 레이저 라인 및 fluorophores 사용 하 여 수집 된: 405 nm (DAPI), 488 nm (알 렉 사 488 및 전송된 DIC는 명시 야), 그리고 561 nm (알 렉 사 546). 모든 레이저 레이저 파장 및 힘의 전송 제어 단일 acousto 광학 가변 필터 통과.
6. 라이브 사이트 마이크로 반구에 형광 단백질의 신규 모집의 셀 이미지 분석
- 오픈 (즉, NIS 요소 또는 ImageJ) 이미지 분석 응용 프로그램에서 이미지를 획득. 필요한 경우, 사전 및 사후 손상 유도의 단일 이미지 시퀀스를 생성 timelapse 이미지 사전 조사 이미지를 결합. 사용자가 보여줄 수 있는 채용 조사 영역 형광 강도에 변화를 측정 하 여 전체 핵에 걸쳐 측정 하는 형광 강도를 상대 (대표 결과 그림 1 참조 B. ).
- 측정 각 셀에 대 한 먼저 핵을 나타내는 투자 수익에 대 한 참조를 생성. 핵을 구성 하는 픽셀을 포함 하는 형광 신호에 임계 처리 알고리즘을 사용 하 고은 투자 수익으로이 영역을 변환. 필요한 경우, 투자 수익 기준으로는 관찰법을 사용 하 여 수동으로 그릴 수 있습니다. 핵 지역은 정확 하 게는 투자 수익에 의해 덮여 되도록 시간 동안 투자 수익을 조정 하 고 각 프레임에 대 한이 투자 수익 내 형광 신호의 평균 형광 강도 보고.
- 측정 각 셀에 대 한 6 x 6 픽셀 ROI 만들고 시간 과정의 각 프레임에 대 한 투자 수익 손상 위에 놓습니다. 이 더 큰 ROI 분석에 대 한 손상 ROI 지금 이다. 각 프레임에 대 한 평균 투자 수익 형광 강도 보고.
참고: 대부분의 상용 이미지 분석 소프트웨어는 2D 개체 추적 모듈 그리고 빠른 워크플로 및 높은 처리량 (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ 참조) ImageJ 또는 피지에 대 한 사용자 개발 매크로 많습니다. - 평균 피해 투자 수익 형광 강도 timelapse의 각 프레임에 해당 참조 투자 수익의 정상화. 여기, 말은 핵 형광 강도 참조 ROI로 사용 됩니다 (대표 결과 그림 1 참조). 정규화 평균에서 평균 참조 ROI 형광 강도 빼서 수행할 수 있습니다 투자 수익 형광 강도, 손상 하거나 의미를 나누어 손상 ROI ROI 형광 강도 의미 참조로 형광 강도.
참고: 정규화 사단에 의해 얻을 수 있습니다 예측할 수 없는 결과, 매우 낮은 기준 강도 값에 사용 하는 경우. - 적어도 두 개의 제어, 손상 되지 않은 셀 뿐 아니라 모든 손상 된 세포에 대 한 반복합니다. 필요한 경우 추가 정규화에 대 한 제어 셀 결과 사용할 수 있습니다.
- 그래프 실험적인 치료의 기능으로 모집 역학에서 변경 내용을 표시 하는 시간이 지남에 강도 값을 정규화.
7. 면역 형광 검사에 의해 감지 단백질 모집의 분석 이미지
이미지 분석 응용 프로그램에서- 오픈 사전 및 사후 피해 이미지. 사전 손상 이미지 손상 ROI(s) 마이크로 조사에 대 한 사용 포함. ROI(s)을 복사 하 고 붙여넣이 대상된 셀을 식별 후 손상 이미지.
- 는 단백질 모집의 분석에 대 한 6 x 6 픽셀 투자 수익을 생성 하 고이 투자 수익 ROI 손상의 위치에 배치. 이 더 큰 ROI 분석에 대 한 손상 ROI 지금 이다. 평균 피해 투자 수익 형광 강도 보고.
- 해당 참조 투자 수익의 말은 피해 투자 수익 형광 강도 정상화. 여기, 손상 된 세포의 평균 핵 형광 강도 ROI 참조로 사용 됩니다 (대표 결과 그림 1 참조). 핵, 정의 DAPI 신호에 임계 처리 알고리즘을 사용 하 여 참조 투자 수익을 생성 하 고이 분야는 투자 수익에 변환. 투자 수익 형광 강도 의미 참조를 보고 합니다. 정규화 수행 평균 피해 투자 수익 형광 강도에서 평균 참조 ROI 형광 강도 빼서 하거나 평균 피해 투자 수익 형광 강도 나누어 투자 수익 형광 강도 의미 참조로.
참고: 정규화 사단에 의해 얻을 수 있습니다 예측할 수 없는 결과, 매우 낮은 기준 강도 값에 사용 하는 경우. - 모든 손상 된 세포를 반복 하 고 위에서 설명한 대로 적어도 두 개의 셀에 같은 분석을 수행.
- 그래프 각 실험 치료의 기능으로 단백질 모집 또는 DNA 손상의 종류에 변화를 표시 하는 시간에 대 한 마이크로 조사 이벤트 측정에 대 한 강도 값을 정규화.
Representative Results
유도 된 DNA 손상의 특성
기본 병 변 및 스트랜드 나누기의 유도 선택한 핵 영역에 적용 된 레이저 복용량에 따라 달라 집니다 그리고 셀 모델의 휴대폰 microenvironment 사용7. 형광 단백질 융합 단백질 XRCC1, 53BP1, Ku70, 또는 Rad51 같은 복구, 제공 하는 유용한 단일 및 이중 가닥 손상 ROI 위의 내 형광 단백질의 축적을 참조 하는 데 필요한 최소한의 에너지를 설정 하기 위한 휴식 마커는 배경 형광9,,1931. 응답을 유도 하는 조건이 발견 되 면 그 특정 파장 및 복용량에 의해 유도 된 손상 혼합물의 특성에 중대 하다. 복용량과 기간 사용 하는 파장에서의 감쇠는 복잡 한 피해 혼합물의 형성을 최소화 하기 위해 사용자를 허용할 수 있습니다. UV-A 범위에서 낮은 레이저 복용량 SSBs와 작은 양의 기본 병 변, SSBR 및 BER 경로10,28공부에 대 한 적절 한 주로 생산 증명 있다. 복용량을 증가 더 복잡 한 기본 병 변, 산화 만들고 UV 유도, 그리고 DSBs7,10의 더 큰 숫자를 유도 합니다. 단일 종의 DNA 손상의 유도 특정 DNA 수 선 통로의 검사에 대 한 바람직한, 사용자 기본 병 변 또는 DSBs 보다 훨씬 더 자주 되 고 SSBs 같은 특정 병 변으로 DNA 변의 혼합 유도 더 가능성이 높습니다. 과산화 수소 (H2O2) 또는 메 틸 methanesulfonate (MM)32같은 화학 약품에 의해 유도 된 DNA 손상 혼합물와 비슷합니다. 사용자가 때 그들은 혼합물을 손상 결과 발생할 수 있습니다, 그리고 복용량 및 유도 피해 사이트에서 병 변 주의 특성화 comparability 그들의 결과의 재현성을 보장 하는 데 필요한 보고를 해야 합니다.
마이크로 조사 연구에서 XRCC1 GFP 기본 병 변 및 SSBs9,28의 유도 대 한 표식으로 종종 사용 됩니다. XRCC1 SSB 복구 (SSBR)에서 중요 한 역할을 하는 비 계 단백질 이며 기본 절단 (BER)를 수리 하 고 또한 뉴클레오티드 절단 복구 (NER)33,34,35 같은 다른 복구 경로에 참여 . 그것은 중요 한 역할 조정 poly(ADP-ribose) 중 합 효소 1 (PARP-1), DNA 중 합 효소 β를 포함 한 주요 단백질의 수와 상호 작용 하는 DNA 수리에서 (Pol β), 그리고 DNA 리가 III. 우리가 활용 XRCC1-GFP 안정적 조 K1 셀에 표현 SSBs DSBs 생성 하는 데 필요한 레이저 복용량을 결정. 우리는 먼저 각 파장 (그림 1)에 대 한 XRCC1 GFP의 관찰 채용을 유도 하는 데 필요한 최소 복용량을 식별. 355 nm 파장에 대 한 정의 손상 이상의 2 s 면만 시간 투자 수익 생성 배경 (그림 1A) 감지 했다 DNA 손상의 유도 나타내는 그 투자 수익 내 증가 형광 신호. 405에 대 한 nm, 8 fps 스캔 속도 ROI (그림 1A) 손상에 현저한 모집을 생성 하기 위해 필요 했다. 복용량 증가 다음 (10 s 355 nm을 405에 대 한 0.5 fps nm) 더 강렬한 만들려고 ROI (그림 1A) 손상.
모집 및 XRCC1-GFP 유발된 손상의 사이트에서의 보존 되었다 다음 timelapse 이미징에 의해 모니터링 됩니다. DNA 손상의 사이트에서 단백질의 보존 유발된 손상의 사이트에서 단백질의 분리는 종종 BER 또는 SSBR 완료에 대 한 마커를 간주가 DNA 수리를 나타낼 수 있습니다. 그러나, 명확한 증거가 수리의 완료와 함께 레이저 유도 DNA 손상 사이트에서 XRCC1의 분리를 연결 되었습니다. 손상의 사이트에 단백질의 신규 모집 의미 형광 신호 전체 핵 (그림 1B)에 대 한 측정을 통해 손상 된 투자 수익을 내는 형광 신호의 평균 강도 보고 하 여 측정 됩니다. 이 유형의 정규화 다른 정규화 기술 관심사의 단백질의 세포 분포에 따라 사용할 수 있지만 주소 강도 변동 핵 신호에 도움이 됩니다. 여기, 그래서 핵 영역에 정규화 측정 신호 손상 ROI 재배포 XRCC1 핵 구획, 지역화 됩니다. 투자 수익 평균 형광 강도 다음 사전 손상 이미지를 포함 하 고 시간 (그림 1C)의 함수로 그래프로 timelapse의 각 이미지에 대 한 기록 됩니다.
우리 다음 추가 특징 DNA 기본 병 변 형성 검사 두 선택한 레이저 복용량에 의해 유도 된 손상. 첫째, 일일, 부피가 UV 유도 된 병 변의 형성 NER 종류 병 변 (그림 2A)에 대 한 표식으로 면역 형광 검사에 의해 조사 되었다. 다음, oxidatively 유도 기본 lesion8 oxodG BER 유형 병 변 (그림 2B)에 대 한 표식으로 조사 했다. 일일 병 변에서 크게 증가 두 파장에 대 한 낮은 복용량 노출에서 관찰 되었다 (2 355 nm와 405에 대 한 8 fps에 대 한 s nm), 높은 복용량 두 파장에서 처리 하는 동안 (10 355 nm, 405에 대 한 0.5 fps에 대 한 s nm) 형광에 상당한 증가 보여주었다 신호 손상 ROI (그림 2A) 내에서 관찰. 각 손상 된 셀 쇼가 손상 형성 및 파장에 복용량, 일일 병 변의 저수준 더 낮은 복용량에 있을 수 있지만 부하 크게 되지 않을 수 있습니다 나타내는 탐지에 대 한 강도 의미 하는 일일 투자 수익의 점도 더 높은 복용량 적용 됩니다 때까지 발견 했습니다. scatterplot 또한 손상 혼합물의 정확한 정량화를 제한할 수는 항 체 탐지의 그 비효율성을 제안 합니다.
이것은 더 마커 8-oxodG에 의해 oxidatively 유발 DNA 변의 탐지에 강조 된다. 피해 내 형광 신호에 명확한 증가 투자 수익 8-oxodG 레이저 파장 또는 복용량 사용 (그림 2B)에 대 한 관찰 되었다. 이 작품에 사용 되는 항 체는 이전 간행물9,,1036;와 일치 그러나, 그것은 8-oxodG 항 체37,38와 형성을 관찰에 제한이 있을 수 있습니다 주목 해야한다. Oxidatively 유도 장애의 부족의 확인은 또한 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), 효소 DNA10에서 8 oxodG의 제거에 대 한 책임의 모집 같은 두 번째 표식에 의해 권장 됩니다. 우리가 우리의 DNA 손상 사이트; OGG1 모집을 준수 하지 않았다 그러나, oxidatively 유도 DNA 손상의 저급의 형성 수 없습니다 배제할 수 완전히.
마지막으로, 우리는 정도에서 53BP 1, γH2AX 및 2 개의 마커를 사용 하 여 하는 DSBs 형성 검사면역 형광 검사에 의해 d 레이저 복용량 (그림 3 & 4). ΓH2AX 일반적으로 스트랜드 휴식 마커로 사용 하지만 DSBs에 대 한 그것의 구체적 보고서39,40수에 조사 되어 있다. 또한, 지역화 가닥 틈에 신호의 제한 때문에이 신호 전파 수 가닥 휴식 사이트에서 전파 되는 인 산화 이벤트입니다. 따라서, 53BP-1와 γH2AX를 결합 수 있습니다 손상 투자 수익 내 DSB 형성의 더 정확한 평가.
ΓH2AX과 53BP-1의 마이크로 조사에 응답은 파장 복용량 의존. 낮은 복용량 (2 s) 자극에 355 nm 5, 20 분, 그리고 모두 표시에 대 한 약한 및 가변 응답 10 분 게시물 방사선(그림 3)에서 응답을 elicits. 높은 복용량 (10 s) 355 nm 마이크로-방사선의 5, 10, 및 (그림 3B) 40 분 감소는 20 분 게시물 방사선 손상 ROI 내의 증가 형광 신호를 유도 한다. 이러한 결과 초기 시간 포인트에서 이중 가닥 휴식 마커 γH2AX의 감소 감지에 의해 증명으로 355 nm 복용량의 적정 수리 통로의 상호 자극을 최소화 하기 위해 필요한 주의 표시 (< 20 분) 낮은 복용량에서 적용.
비슷한 실험은 모두 낮은 (8 fps)와 높은 복용량 (0.5 fps) 405 nm 레이저 자극 (그림 4)를 사용 하 여 수행 했다. 이 파장에서 형광 강도 피해 ROI 내에서 상당한 축적 53BP-1와 γH2AX 적용 된 복용량,이 복용이 생성 거의 단일 및 이중 가닥 나누기의 복잡 한 혼합물을 나타내는에 대 한 관찰 DNA 손상 (그림 4)의 유도 후 즉시. 또한, 405 nm 쇼 팬 핵 γH2AX 얼룩이 손상 유도 (그림 4B, 아래)의 10 분 이내에 증가의 고용량을 어려운 손상 투자 수익의 검색 53BP 1 축적 하는 동안 보고서를 더 피해 투자 수익에 포함.
이러한 결과 405 nm 마이크로-방사선 모니터링 SSBR 또는 BER, 적합 하지 않습니다 그리고 그 여러 DNA adducts 표식과 휴식 물가 완전히 유발된 병 변 및 DNA 복구 응답 특성을 고용 한다 명확 하 게 보여줍니다.
모집 및 XRCC1 GFP의 보존에 복용량 의존 변경
일단 유발된 DNA 손상, 성격 레이저 마이크로-방사선 DNA 수 선 단백질의 역학을 공부 하기 위한 이상적인 플랫폼을 수 있습니다. XRCC1 GFP의 보존 및 분리 활동은 예기치 않은 다른 손상 혼합물의 유도 각 파장에 의해 주어진 복용량 종속성 (그림 1)를 보여 줍니다. 높은 방사선 복용량 (10 s와 0.5 fps) 더 낮은 복용량에 상대적인 XRCC1 GFP의 높은 강도 모집 및 손상의 사이트에서 XRCC1 GFP의 더 긴 보존 20 분 시간 과정 (그림 1C) 표시합니다. 355와 405 nm에 대 한 더 높은 복용량에서 만든 DNA 손상 임을 나타냅니다 가능성이 모양과 DSB 마커, γH2AX 및 53BP-1의 유지와 일치 하는 실험의 과정에서 해결 되지 않은 (그림 3 & 4 ).
흥미롭게도, 손상의 더 낮은 복용량 (2 s와 8 fps) 표시 XRCC1-GFP 피해 사이트의 신속한 채용 및 사전 조사 수준 (그림 1C) 실험 시간에 걸쳐 XRCC1 GFP의 분리. 손상 혼합물의 완전 한 특성 없이이 결론 SSBs 및 기본 병 변은 완전히 해결 한다는 이러한 손상 조건을 사용 하 여 발생할 수 있습니다. 그러나, γH2AX 및 53BP-355 위한 40 분에서 1 nm 405에 대 일 분에 nm는 다른 해석으로 이어질 수 있습니다. 355 nm 2의 복용량에 대 한 피해 혼합물 수 주로 SSBs, 있으므로 일부 배달된 병 변 DSBs 선도 수 있습니다 또는 DSBs이이 에너지에 의해 생성 된 더 긴 시간 규모에 수리는 40 분에서 DSB 마커 모양을 나타낼 수 있습니다. 시간 규모 차이 SSBR DSB 수리 이전에 보고 된28,,4142되었습니다. 마찬가지로, 405 nm 낮은 복용량 (8 fps) 분리 SSBs의 낮은 수준을 나타낼 수 있습니다 또는 에이전트 손상 마이크로 조사와 다른 DNA 손상 한 클러스터링 SSBs DSBs, 신속 하 게 변환 되는의이 대 한 언급 되었습니다 이전43, 44 , 45.
함께 특성화 유도 손상 혼합물의 중요성을 강조 하는이 결과 고 단백질 복구 여러 DNA를 이용 하 여 모집 및 DNA의 보존을 해석 하기 위한 마커 단백질 유도 손상의 사이트에 복구.
그림 1 . 레이저 마이크로-방사선 유도 XRCC1 GFP 모집 합니다.
(A) 조-K1 셀 XRCC1 GFP를 표현 안정적으로 반구 되었고 전후 즉시 손상 유도 몇 군데. 화살표 표시 마이크로 방사선 복용량의 위치와 눈금 막대는 10 µ m. (B) 모집 손상 ROI 내의 평균 형광 강도 결정 하 고 전체 핵의 평균 형광 강도를 정상화 하 여 측정 됩니다. 각 timelapse 이미지 (C) 신규 모집의 역학을 측정할 수 있습니다. 그래프는 두 개의 독립적인 실험 SEM를 나타내는 오차 막대를 (n = 24). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 레이저 마이크로-방사선 뉴클레오티드 손상을 유도합니다.
조-K1 셀 레이저 마이크로 조사를 받게 되었고 손상 유도 후 즉시 고정. 면역 형광 검사 일일 검색을 수행 하 고 8 oxodG adducts. (A) 가기, 점도 투자 수익 평균 형광 강렬에서 관찰의 일일 비용 얼룩 후 세포 손상. 하단, 일일 얼룩의 대표 이미지입니다. 화살표 표시 마이크로 방사선의 위치와 눈금 막대는 10 µ m (n = 12). (8-oxodG 얼룩에 대 한 B) 대표 이미지. 화살표마이크로-방사선의 위치를 표시 하 고 눈금 막대는 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . DNA 이중 가닥 휴식 마커 복용량 의존 방식에서 355 nm 마이크로 조사에 응답.
조-K1 셀 마이크로 조사를 받게 되었고 시간 포인트 표시 후 자극에 고정. DSB 마커 γH2AX 및 53BP-1에 대 한 면역 형광 검사 수행 되었다. (A) 정규화 된 손상 손상 및 손상 된 세포에 대 한 형광 강렬 측정을 의미 하는 투자 수익의 음모를 피해 라. 오차 막대는 SEM의 대표 (n = 12). (ΓH2AX 및 53BP-1 얼룩 B) 대표 이미지. 화살표 표시 마이크로 방사선의 위치와 눈금 막대는 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. DNA 이중 가닥 휴식 마커 튼튼하게 405 nm 마이크로 조사에 응답.
조-K1 셀 마이크로 조사를 받게 되었고 시간 포인트 표시 된 게시물 자극에 고정. DSB 마커 γH2AX 및 53BP-1에 대 한 면역 형광. (A) 정규화 된 손상 손상 및 손상 된 세포에 대 한 형광 강렬 측정을 의미 하는 투자 수익의 음모를 피해 라. 오차 막대는 SEM의 대표 (n = 12). (ΓH2AX 및 53BP-1 얼룩 B) 대표 이미지. 화살표 표시 마이크로 방사선의 위치와 눈금 막대는 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기 설명 하는 조건을 사용 하 여, UV-A 또는 405 nm 레이저, 제조 업체에 의해 통합 또는 최종 사용자에 의해 추가 된 모든 confocal 현미경 세포의 핵 내 DNA 손상 유도 고 수의 사이트에 DNA 수 선 단백질의 신규 모집을 허용 모니터링할 DNA 손상을 유도 한다. 그러나, 프로토콜 및 대표 결과, 파장 선택 했 듯이 전원, 적용 하 고 손상을 특성화는 모든 중요 한 문제 해결 되어야 합니다 먼저 사용자가 특정 DNA를 연구 하기 위해 복구 통로. 또한, 사용자가 또한 고려 되어야 하는 실험 설계에서 다른 고려 사항이 있다.
라이브 셀 게시물에 단백질의 동작을 모니터링 하기 위해 마이크로-방사선, 붙일 레이블된 단백질 생성 되어야 합니다. 다양 한 괴기 하 게 분리 될 수 있다 형광 단백질의 가용성은 DNA 손상 유도 세포 응답을 특성화에 사용할 수 있는 단백질 융해를 만들기 위한 도구를 제공 합니다. 관심사의 형광 단백질의 과도 transfection 손상 조건, 돌연변이, 또는 심지어 억제제의 빠른 심사 안정적 transfected 세포를 제공 하는 동안 더 식 수준 이상의 제어 하 고 다른 생 화 확 적인 허용 수행 characterizations 마이크로 조사 결과 검증. 괴기 하 게 고유한 형광 단백질 또한 동일한 경로 또는 다른 경로에서 단백질 간의 상호 작용을 모니터링 하는 같은 셀에 활용할 수 있습니다. 형광 단백질 또한 관심사의 각 단백질을 위한 특정 항 체에 대 한 필요성을 제거 하 고 라이브 세포 손상의 유도 후 오랜 기간에 대 한 단백질 동작의 모니터링 허용.
그러나, 형광 단백질의 사용 또한 단점이 있다. 유전 배경 관심의 protein(s) 부족, 없이 생 단백질 붙일 태그가 단백질 경쟁할 것 이다. 단백질의 N 또는 C terminus에 형광 태그의 활용 수 있습니다 단백질 접기 변경, 주요 단백질-단백질 상호 작용을 방해 또는 차단 전 신호; 기능을 변경 하 고 잠재적으로 모집 역학에 영향을 미치는입니다. 이러한 효과 다양 한 보고서를 극적으로 다른 모집 및 피해 사이트28생 단백질에 대 한 보존 시간 시연 immunofluorescent 얼룩에 입증 되었습니다. 과도 transfection 또는 안정적인 클론의 사용 또한 관찰, 일반적으로 단백질 표정 수준에 변화를 통해 응답을 변경할 수 있습니다. 또한, 단일 실험에서 여러 형광 단백질의 사용 또한 변경할 수 있습니다 모집의 역학 단백질 레벨은 잘 equilibrated 하지 또는 다른 단백질의 신규 모집을 차단 하는 큰 붙일 태그가 단백질의 신규 모집 . 마지막으로, 형광 단백질 약한 과민성 에이전트, 반응성 산소 종의 형성을 증가 하 고 잠재적으로 DNA 손상 혼합물 유도46,47변경으로 작동할 수 있다. 이러한 단점에도 불구 하 고 형광 단백질 공부 DNA에 뚜렷한 장점을 마이크로-방사선, 복구 및 사용자 설명 여기, 피해 특성 등의 적절 한 컨트롤을 통합 하는 경우에, 그들은 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다 제공 에 손상 응답 및 단백질-단백질 상호 작용3.
라이브 셀 이미징 필요 하지 않으면, 면역 형광 유도 된 손상에 대 한 응답을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 특정 시간에 세포를 고정 하 여 손상 유도 및 항 체와 단백질 및 관심, 손상 유도의 정적 스냅샷 및 모집 병 변 및 단백질을 만들 수 있습니다 수리의 보존에 대 한 특정 얼룩 게시. 항 체는 관심의 포스트 번역 상 수정 DNA 손상 응답에 의해 유도 된 여러 단백질의 신규 모집을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 면역 형광의 사용 형광 성 단백질에 대 한 필요성을 제거 하 고 생 단백질 동작 검사를 허용 합니다. 그러나,이 메서드는 너무 그 단점이 있습니다. 매우 특정 항 체는 필요, 그리고 permeabilization 및 차단 절차 충분 한 신호 강도 가진 신규 모집의 검색 수 있도록 최적화 해야 합니다. 해결 절차는 순간, 고이 물리적 제약이이 접근의 시간 해상도 제한 합니다. 세포 염색 후 다시 찾을 수 있도록 손상 유도 사이트 매핑 또한 중요 한 과제를 제시할 수 있습니다. 이 작품에 사용 하는 confocal 현미경 수 있습니다 이미지 기반 등록 위에서 설명한 대로 그래서 손상 된 세포 높은 정밀도로 이전 될 수 있습니다. 고유한 간격으로 손상 유도 및 이미지 모집 된 결합 단계 등록을 하지 않고 재배치 세포 면역 형광을 만들 수 있습니다 단계 등록 또는 에칭된 coverglass 사용할 수 없는 경우, 투자에 참여 하는 시간 일부 사용자에 게 매력적. 그러나, 가장 정확 하 고 완전 한 마이크로 방사선 실험 디자인 제시 프로토콜에 설명 된 대로 이러한 유형의 형광 단백질의 사용과 동시에 접근을 통합할 예정 이다.
여기, 라이브 셀 이미징 및 면역 형광 레이저 마이크로-방사선의 유틸리티를 설명 하는 데 사용 됩니다. Immunofluorescent 얼룩 수 있도록 만든 DNA 손상의 혼합물을 정확 하 게 검사 하 고 더 나은 수 있게 하는 각 레이저 파워에 의해 유도 된 단백질의 채용 모집 및 XRCC1 GFP의 보존에 관찰된 변경 해석. 이러한 결과 바탕으로, 405 nm 레이저를 사용 하 여 BER 및 SSBR 단백질의 검사에 대 한 제한 되어야 합니다. 또한, 최적의 실험 설계 목적, 사용 하 고, 각 셀 라인에 대 한 전체 손상 혼합물 특성화 및 채용의 유효성 검사 후 전력 측정 포함 하 고에 놓여있는지 관찰 보존 태그와 단백질 면역 형광 검사입니다. 물론, 장비, 시간, 및 비용 고려 할 수 있습니다 이러한 최적의 실험 설계 불가능 한 일부 사용자에 대 한. 그러나, 이러한 요소 각각의 중요성은 여기, 증명 하 고 사용자가 이러한 고려 사항을 염두에 두어야 마이크로 조사 실험을 시작 하는 때.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 박사 사무엘 H. 윌슨에서 국립 연구소의 환경 건강 과학이이 작품에 사용 된 셀 라인에 대 한 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| 355 nm laser | PicoQuant VisUV | Radiation source | |
| Galvanometer photoactivation miniscanner | Bruker | ||
| Microscope slide photodiode power sensor | THORLabs | S170C | |
| Fiber photodiode power sensor | THORLabs | S150C | |
| Digital handheld optical power and energy meter | THORLabs | PM100D | |
| CHO-K1 | From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS | ||
| Minimal essential media | Hyclone | SH3026501 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11550 | |
| XRCC1-GFP | Origene | RG204952 | |
| Jetprime | Polyplus transfection | 11407 | |
| Geneticin | ThermoFisher | 10131035 | |
| 4 chambered coverglass | ThermoFisher | 155382 | |
| 8 chambered coverglass | ThermoFisher | 155409 | |
| Anti 53BP-1 | Novus | NB100304 | |
| Anti-phospho-histone H2AX | Millipore | 05-636-I | |
| Anti cyclobutane pyrimidine dimer | Cosmo Bio clone | CAC-NM-DND-001 | |
| Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine | Trevigen | 4354-MC-050 | |
| Alexa 488 goat anti-mouse | ThermoFisher | A11029 | |
| Alexa 546 goat anti-rabbit | ThermoFisher | A11010 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | R37606 | Caution toxic! |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher | 0780 | |
| Normal goat serum | ThermoFisher | 31873 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| 37% Formaldehyde | ThermoFisher | 9311 | Caution toxic! |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Methanol | VWR | BDH1135 | Caution toxic! |
| HCl | Fisher | SA49 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Caution toxic! |
| Tris Hydrochloride | Amresco | O234 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
- Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
- Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
- Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).
- Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
- Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68 (2009).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
- Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
- Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
- Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
- Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
- Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
- Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
- Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
- Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
- Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301 (2012).
- Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
- Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
- Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
- Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
- Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
- Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
- Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
- Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).
- Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
- Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
- London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
- Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
- Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
- Cooke, M. S., Lunec, J. Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , World Scientific. 275-293 (2003).
- Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
- Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
- Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
- Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
- Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
- Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
- Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059 (2011).
- Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
- Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).
- Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).
