Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Bruk av Laser mikro-bestråling for undersøkelse av enkelt og dobbelt Strand pause reparasjon i pattedyrceller

Published: September 5, 2017 doi: 10.3791/56265

Summary

AC confocal fluorescens mikroskopi og laser mikro-bestråling tilbud-verktøy for inducing DNA skade og overvåking responsen av DNA reparasjon proteiner sub kjernefysiske barokkarkitektur. Denne teknikken har betydelig avanserte vår kunnskap om skade gjenkjenning, signalisering og rekruttering. Dette manuskriptet viser disse teknologiene for å undersøke enkelt- og dobbeltrom strand pause reparasjon.

Abstract

Svært koordinert DNA reparasjon trasé eksisterer for å oppdage, avgiftsdirektoratet og erstatte skadet DNA baser og koordinere reparasjon av DNA strand bryter. Mens molekylærbiologi teknikker har avklart struktur, enzymatisk funksjoner og kinetics reparasjon proteiner, er det fortsatt behov for å forstå hvordan reparasjon er koordinert i kjernen. Laser mikro-bestråling tilbyr et kraftig verktøy for inducing DNA skade og overvåking rekruttering av reparasjon proteiner. Induksjon av DNA skade av laser mikro-bestråling kan oppstå med et utvalg av bølgelengder, og brukere kan pålitelig indusere enkelt strand pauser, base lesjoner og doble strand bryter med en rekke doser. Her laser mikro-bestråling brukes til å undersøke reparasjon av enkelt og dobbelt strand bryter indusert av to vanlige AC confocal laser bølgelengder, 355 nm og 405 nm. Videre, riktig karakteristikk av brukt laser dosen for inducing spesifikk skade blandinger er beskrevet, slik at brukere kan reproduserbar utføre laser mikro-bestråling datainnsamling og analyse.

Introduction

Fluorescerende mikroskopi har dukket opp som en kraftfull teknikk for å visualisere mobilnettet arkitektur, undersøke protein lokalisering og overvåke protein-protein og protein-DNA interaksjoner. Bruke lysstoffrør mikroskopi for å studere DNA skade svar etter globale DNA skadelige stoffer, som ultrafiolett (UV) lys, har ioniserende stråling, kjemiske oksiderende eller alkylating agenter eller chemotherapeutics gitt ny innsikt i den innvielsen signalering og rekruttering av DNA reparasjon proteiner til områder av DNA skade1,2. Men disse globale og asynkrone skade hendelser er begrensende, hvis detaljert informasjon om rekruttering ordre, kinetics av tilknytning eller dissosiasjon, og forholdet mellom nøkkel DNA reparasjon proteiner er søkt. Heldigvis fremskritt innen laserskanning AC confocal mikroskop, bredere tilgjengeligheten av skaden-induserende laser bølgelengder, og forbedringer i fluorescerende proteiner de siste 25 årene har gitt forskerne med de forbedrede verktøyene for å undersøke dette aspekter av DNA reparasjon, gjennom målrettet DNA skade induksjon.

Bestråling av celler med laser microbeams for å studere mobilnettet og subcellular er et veletablert verktøy i cellen og stråling biologi3. Bruk av denne teknikken til studier av DNA-reparasjon dukket opp når Cremer og kolleger brukt en svært fokusert UV (257 nm) laser microbeam systemet å indusere DNA skade over en 0,5 µm i kinesisk hamster eggstokk (CHO) celler4 og etablerte induksjon av DNA photolesions av denne system5. Mens tilbyr betydelige forbedringer over UV microbeam metoder samtidig, adopsjon av dette skade system var begrenset sin spesialisert sett opp og dens manglende evne til å generere bryter Dobbel-strand (DSBs)6. Påfølgende undersøkelser av en rekke UV-B (290-320 nm) og UV-en (320-400 nm) bølgelengder av flere grupper avslørt at UV photoproducts, oksidativt base lesjoner, enkelt strand bryter (SSBs), og DSBs kan bli indusert avhengig av laser bølgelengde og makt brukt4,7,8,9,10 (omtalt i 3). Videre ble kombinasjoner av disse UV-B og UV-A bølgelengder med sensitiverende agenter, som legge psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) og Hoechst fargestoffer, også funnet for å indusere DNA skade avhengig bølgelengde, kraft og varigheten av eksponering, men kraften måtte indusere skade senkes ofte i nærvær av disse agenter11,12,13,14,15. Disse truslene utvidet bruk av mikro-bestråling, selv om det var fortsatt teknisk hurdles tas for bredere adopsjon av disse metodene.

Cremer og kolleger i betydelig grad fremmet innen mikro-bestråling ved å fokusere presist UV-microbeam for å bruke betydelig skade energi over et svært lokaliserte område i cellen. AC confocal mikroskop og laser microdissection systemer avansert, var tett fokusert lys mer generelt tilgjengelig; imidlertid presentert koble UV kilder til omfang og håndtere kromatiske avvik de indusert fortsatt betydelige utfordringer til de fleste brukere3,6,16. Som UV fargestoffer økt i popularitet på 1990-tallet, optikk kan fokusere og fange UV-spent fluorescens ble mer utbredt16, og forbedringer i laserskanning tilbys brukere fokusert muligheten til å lage svært UV eksitasjon steder innenfor cellene6,17. Men det var ikke før tidlig på 2000-tallet at følte den sanne effekten av denne kombinasjonen av tett fokusert bjelker med høyere intensitet lasere, når mange rapporter dukket opp demonstrere at DNA strand bryter kan bli indusert med og uten allergifremkallende stoffer i den UV-A området6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, og enda lenger synlig bølgelengder som 488 nm27. Disse truslene tillatt for mer utbredt bruk av mikro-bestråling teknikken på en rekke kommersielle systemer. Parallelt med denne utviklingen, to-fotonet teknikker også dukket opp som tillater presis induksjon av DNA skade; om disse truslene ikke vil bli omtalt her, er det en rekke gjennomgang artiklene diskuterer disse metoder9,28,29,30.

Med gjeldende tilgjengelighet av AC confocal mikroskop kan levere svært fokusert UV lys og utbredt tilgjengeligheten av fluorescerende proteiner tillate sanntidssporing av DNA reparasjon proteiner, mikro-bestråling teknikker har utviklet seg til kraftige verktøy for å undersøke DNA skade svar og reparere trasé. Brukere må imidlertid være klar over at generasjonen av DNA skade er svært avhengig av laser bølgelengde og makt på sub kjernefysiske regionen. Bruk av UV-C (~ 260 nm) bølgelengder tillate direkte DNA eksitasjon og høy selektivitet for induksjon av UV photoproducts7,8. UV-B og UV-A bølgelengder produserer blandinger av DNA skade (base lesjon, SSBs og DSBs), avhengig av brukte makt og mobilnettet bakgrunnen utnyttet7. Endogene photosensitizers og antioksidant nivåer i målrettede cellene kan påvirke DNA skade blandinger produsert av disse bølgelengder. I tillegg, kan bruk av ytre photosensitizers (BrdU, etc.) bistå i senke energien som trengs for induksjon av DNA skade. Men disse agentene kan indusere DNA skade seg selv, og de kan endre i cellen syklus og chromatin struktur, slik bruk kan gi uønskede effekter som må vurderes av brukeren. Derfor før du bruker micro-bestråling for å studere DNA skade respons og reparasjon, er nøye vurdering av DNA repair pathway interesse, bølgelengdene tilgjengelig for bruk og DNA skade blandingen opprettet nødvendig.

Her laser mikro-bestråling utføres på to brukte bølgelengder, 355 nm og 405 nm, uten allergifremkallende stoffer å demonstrere blandinger av DNA skade forårsaket av disse bølgelengder og påvirkninger disse skade blandinger har på å undersøke reparasjon avSSBs og DSBs.-brukere bør være klar over at disse bølgelengder ikke Opprett én art strand bryter eller base lesjoner. For å skille mellom DNA reparasjon veier, må brukere nøye kontroll brukte makt over et bestemt område av kjernen og karakterisere indusert skaden bruke flere strand pause markører og DNA lesjon antistoffer. Hvis riktig brukt og preget, kan laser mikro-bestråling berike noen arter av DNA skade, tillater brukernes å vurdere reparasjon av base lesjoner og SSBs eller DSBs, med noen spesifisitet. Derfor har vi gitt en metode som tillater brukere å reproduserbar utføre laser mikro-bestråling karakterisere DNA skade blandinger av brukt laser dose og analysere data.

Protocol

1. cellekultur og generasjon stabil celler

  1. vokse CHO-K1 celler i minimal viktig medium med 10% fosterets bovin serum. Vedlikeholde celler i en fuktet inkubator med 5% CO 2 på 37 ° C.
  2. Transfect CHO-K1 celler med 1 µg plasmider DNA som inneholder menneskelige XRCC1 med en C-terminalen grønn fluorescerende protein (GFP) merke ved hjelp av en kommersiell transfection reagens etter produsenten ' s instruksjoner.
  3. Velg CHO-K1 celler stabilt uttrykke menneskelige XRCC1-GFP blanding med 800 µg/mL geneticin og berike XRCC1-GFP uttrykke befolkningen bruker fluorescens assistert celle sortering (FACS).
  4. Plate celler å være mikro-bestrålt i kultur fartøyer med coverglass bunnen, så de kommer ca 75% eller større confluency dagen. Noen mellomrom mellom celler er ønskelig, særlig hvis bruker registrering å gå tilbake til det samme bildefeltet (beskrevet i kapittel 3.2).

2. Mikroskopet oppsett

  1. Velg en laserskanning AC confocal mikroskop utstyrt med egnet lasere og optikk, og programvare for mikro-bestråling/photostimulation. Presentert eksperimenter bruk en laserskanning AC confocal mikroskop som er endret for å inkludere en 355 nm laser, fiber-koplet til en galvanometer photoactivation miniscanner og kontrollert ved hjelp av produsenten ' s kontroll og analyse programvare. Dette systemet kan utføre mikro-bestråling i en bruker-angitt region av interesse (ROI) photoactivation miniscanner (355 nm laser) eller standard AC confocal galvanometer (405 nm laser).
  2. Velg bølgelengden brukes til mikro-bestråling, at alle optisk komponenter i mikro-bestråling lightpath er egnet for valgte bølgelengden.
    Merk: Presentert systemet bruker en 40 × C-Apochromat (numerisk blenderåpning (NA) 1.2) nedsenkning oljeobjektiv sammen med en UV filter kube for 355 nm mikro-bestråling og et 20 × C-Apochromat (NA 0,75) tørr mål ved hjelp av standard AC confocal lightpath for 405 nm mikro-bestråling. 20 × målet i oppsettet er ikke kompatibel med 355 nm bølgelengden; Derfor vi brukte den 40 × for 355 nm bare. Bruker tørr målet for skade kan immunofluorescence protokoller brukes nedstrøms uten rengjøring av neddyppingsolje, det er derfor vi bruker dette målet når mulig.
  3. Konfigurere mikroskop for mikro-bestråling eksperimentet. Hvis du vil beholde konsekvensen mellom eksperimenter, kan du angi en standardisert konfigurasjon av mikroskopet komponentene som brukes for hver mikro-bestråling. Lagre innstillingene som en forhåndsinnstilling i mikroskopet ' s operativsystemprogramvare, hvis mulig.
    Merk: Presentert systemet, celler er mikro-bestrålt og fotografert med enveis skanning, en skanning oppløsning på 1024 x 1024 piksler med 1 x skanning zoom, på en bildefrekvens på 8 rammer per sekund (fps), og med hullet satt til ca 4 luftige enheter (AU), som bestemt for 488 nm laser (69 µm). Åpne pinhole innstillingen ble valgt til å maksimere mengden lys i hvert bilde, tillater bruk av lavere tenkelig laser krefter og redusere photobleaching.

3. Laser mikro-bestråling

  1. plass i forberedt kultur parabol, med celler av interesse, på mikroskopet scenen og låses trygt på plass.
    1. Hvis plassere kamret lysbilde i en scene-top inkubator og vedlikehold på 37 ° C med 5% CO 2 under skade Innledning. Dette trinnet er viktigst for live-celle timelapse imaging eller imaging lange økter. Ellers sted celler på mikroskopet scenen og utføre bestråling ved romtemperatur (~ 25 grader), og deretter raskt tilbake cellene til en inkubator på 37 ° C med 5% CO 2.
  2. Registrere bildefelt tillate forskeren til å returnere til samme sted etter utføre fiksering, flekker eller andre prosedyrer. Utføre registrering av skadet felt ved hjelp av en kodet, automatisert mikroskop stage eller celle kultur coverglass skip med en etset eller merket rutenett XY steder.
    1. Hvis bruk bilde registrering, velger en gjenkjennelig funksjon av kultur fartøyet (dvs. hjørne av coverglass eller barriere mellom brønner), samle inn et bilde og XY plasseringen. Dette vil tillate for justering og registrering av XY plasseringene til valgte felt etter eksempel forberedelse.
    2. Hvis bruker manuell registrering, registrere rutenett eller etset steder for hvert felt manuelt, pass til papirretningen og plasseringen av retten i scenen.
    3. Hvis ingen identifiserende funksjoner for celle kultur fartøyene er tilgjengelige, må du identifisere skadet felt av visuell inspeksjon av celle morfologi og tetthet. Ta vare for å velge felt med tilstrekkelig distinkte egenskaper være gjenkjennelig under senere imaging.
      Merk: Dette kan være tidkrevende å utføre hvis retningen og området av kultur fartøyet er strengt begrenset.
  3. Velg et felt for mikro-bestråling og fokusere prøven. For celler uttrykke fluorescently merket proteiner, Velg fokalplanet med maksimal kjernefysiske tverrsnitt i fluorescerende kanalen av interesse. For celler ikke uttrykke merket proteiner eller for dem uten klart kjernefysiske lokalisering, kontrast eller differensiell forstyrrelser kontrast (DIC) imaging kan brukes til å finne riktig fokalplanet.
    ​ Merk: en nyttig funksjon i kontrast og DIC imaging er det faktum at som fokalplanet går gjennom utvalget, den samme funksjonen kan vises lyse eller mørke avhengig av relativ fokalplanet.
    1. Velg en klar funksjon i kjernen, som en kjerne, og Flytt fokalplanet opp og ned mens observere denne endringen i utseendet. Sant fokalplanet vil ligge i overgangen fra lys til mørk. For å fokusere utvalget, Velg fokalplanet der den valgte funksjonen har skarpeste kontrasten.
  4. Registrere i plassering av interesse. Opprette en 3 x 3 pixel firkant avkastning i mikroskopet programvaren, plasserer denne avkastning over kjernen i en celle for å være skadet og sette denne avkastning skal skaden ROI.
  5. Samler en pre skade bilde, inkludert plasseringen av skaden avkastning.
    1. For eksperimenter som ikke bruker fluorescerende proteiner, erverve en kontrast eller differensial forstyrrelser kontrast (DIC) brightfield bilde å identifisere og registrere kjerner for skade.
    2. For live-celle eksperimenter med fluorescerende proteiner, skaffe et bilde som inneholder brightfield og fluorescens kanal for protein av interesse (dvs. laser linje 488 nm for magnetisering av GFP, laser linje 561 nm for magnetisering av RFP). Eksperimenter med CHO-1 XRCC1-GFP, fluorescens opphisset av 488 nm laser linjen innsamlede samtidig med overført DIC brightfield kanalen.
  6. Start laser skade.
    1. Presentert systemet, kontroll laser dosen av den totale tiden tilbrakte skanning skaden avkastning. Fordi galvanometer for 355 nm laser opererer på en fast avsøkingshastigheten, laser dose styres av tidsbruk gjentatte ganger skanning valgte skaden avkastning: i dataene som presenteres her, mikro-irradiation 355 nm utføres 2 og 10 sekunder.
    2. Derimot kontroll 405 nm laser dosen av modulerende avsøkingshastigheten og utføre en skanning av valgte skaden avkastning. I data pmotsatte her, bruk 8 og 0,5 fps for mikro-bestråling ved 405 nm. En avsøkingshastigheten 8 fps leverer en lavere laser dose enn 0,5 fps, fordi laser tilbringer mindre tid på hver piksel under skanningen. Begge lasere drives på 100% strøm. Se delen 3.7 instruksjoner om måling laser makt direkte.
      Merk: Hver individuelle mikroskop system kan avvike i hvordan laser makt leveres til en bestemt avkastning, ligner på hvordan 355 nm og 405 nm forskjellige presentert systemet. Brukernes ville nød å fastsette denne prosedyren for deres mikroskop system og rapportere disse parametrene innen deres metoder seksjoner.
    3. For levende celle imaging, utfører timelapse bildeopptak brightfield og fluorescens kanaler. Juster varigheten og frekvensen for timelapse å optimalisere datainnsamling, ideelt fange akkumulering av fluorescerende protein på skaden avkastning og sin avstandtagen over gang løpet av eksperimentet. Eksperimenter ved hjelp av XRCC1-GFP samlet bilder 30 sekunder i 20 minutter.
      ​ Merk: frekvensen av timelapse avbilding kan være begrenset av photobleaching av fluorophore, kompliserer analyse av akkumulering og dissosiasjon. Photobleaching kan evalueres ved å observere uskadet cellene under timelapse og justere oppkjøpet forhold å minimere fluorescerende signaltap i disse uskadet cellene. Noen photobleaching kan være uunngåelig, slik at brukere kan justeres i signaltap ved normalisering fluorescerende intensiteten av skadede celler de uskadede celler i hvert av timelapse.
      1. Etter time course er fullført, velger et nytt felt av celler for skade eller reparere skadede celler for videre analyse, som beskrevet i Seksjon 4.
      2. Fortsett mikro-bestråling og timelapse tenkelig til ønsket antall skadede celler.
        ​ Merk: Vi anbefaler skade totalt 10-25 celler per valgte betingelsen for å vurdere celle til celle heterogenitet svar indusert skaden. Selv om mest AC confocal systemer vil tillate brukere å skade mer enn én celle under hver mikro-bestråling, introduserer dette forskjøvet skade innvielsen times, som kan komplisere analyse av rekruttering periode over et stort antall celler eller avstandtagen tid for rask hendelser. I noen systemer redusere samtidig skade induksjon over flere ROIs laser dosen mottatt av hver uavhengige avkastning. Hvis problemene timing/strøm er direkte rettet av brukeren, det anbefales derfor at celler bli skadet individuelt.
    4. For analyse av immunofluorescence (hvis), utføre skade og umiddelbart fikse celler, som beskrevet i Seksjon 4, eller tillate at celler reparere for valgte tidsintervaller (dvs. 1, 5, 10 eller 20 min). Når tiden utløper, fikse og flekken cellene, som beskrevet i Seksjon 4.
      1. å øke samlede celle nummer for hvis-analyse, skade tilleggsfelt i kultur fartøyet til å generere en flerfelts tid selvfølgelig etter skade responsen. Registrere XY plassering for hvert felt og tidspunktet da skaden inntraff. Etter ønsket summen reparere lenge det går, fikse og flekken cellene som beskrevet under.
  7. Etter å observere av protein rekruttering på valgte doser, mål og rapporten laser makt nivåer etter fiber og etter målet nøyaktig karakterisere og rapportere laser doser. Vi bruker en kompakt digital power meter og to forskjellige photodiode sensor hoder; en koblet direkte til Laseren fiber måle etter fiber produksjon, og den andre plasseres på mikroskopet scenen å måle post-objective utdata.
    1. Måle laser makt, plasserer sensoren i ønsket konfigurasjon (etter fiber eller post-objective) og utføre mikro-bestråling som beskrevet ovenfor, mens målingene gjort av strømmåleren. At samplingsfrekvensen for strømmåleren kan ikke være rask nok til å fange svært rask mikro-bestråling hendelser, så det kan være nødvendig å kjøre flere gjentakelser av å sikre at strømmåleren nøyaktig registrerer anvendt dosen.
      Merk: For 355 nm laser, vi målt en gjennomsnittlig peak strøm av ca 5 mW etter fiber og ca 19 µW etter mål. For 405 nm laser, mikro-bestråling ble utført i ledd 30 gjentakelser å overvinne 0,01 s maksimal samplingsfrekvensen av makt meter, og gjennomsnittlige høyeste krefter 1.5 mW og 2.4 mW ble målt ved hjelp søkehastighet 8 og 0,5 rammer per sekund , henholdsvis. Hver strømmåleren er forskjellig. Brukerne må bestemme operative bølgelengder og prøvetaking priser for sine personlige strømmåleren.

4. Immunofluorescence flekker prosedyrer

  1. analyser strand pause induksjon av hvis flekker.
    1. Fastsette celler med 3,7% formaldehyd (advarsel) i fosfat bufret saltvann (PBS) for 10 min. leveringstanken formaldehyd løsning og vask 3 ganger med PBS. Protokollen kan stoppes her ved å plassere PBS tilbake på cellene, og cellene kan lagres på 4 grader for opptil 1 uke.
      FORSIKTIG: Formaldehyd er giftige og kreftfremkallende. Bruk riktig personlig verneutstyr og kast det giftige stoffet som instruert av institusjonelle miljømessig helse og sikkerhet prosedyrer.
    2. Permeabilize celler med 0,25% Triton X-100 i PBS i 10 min ved romtemperatur (RT) og deretter vaske 3 ganger med PBS.
    3. Blokk ikke-spesifikke antistoffer bindende ved rugende i 30 min i PBS med 1% bovin serum albumin (BSA) på RT.
    4. Incubate med primær monoclonal antibody mot γH2AX og primære polyklonale antistoff mot 53BP-1 både utvannet 1:750 på PBS med 1% BSA 1t på RT, og deretter vaske 3 ganger med PBS.
    5. Incubate med Alexa 488 geit anti-musen og Alexa 546 geit anti-kanin både fortynnet 1:2000 på PBS med 1% BSA 1t på RT og deretter vaske 3 ganger med PBS.
    6. Stain kjernefysiske DNA med en 10 mg/mL løsning av DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, forsiktig) utvannet til 1:5000 i PBS for 5 min eller bruk sammenlignbare kjernefysiske fargestoff, og deretter vaske 3 ganger med PBS.
      FORSIKTIG: DAPI er giftige og mutagene. Bruke riktig personlig verneutstyr og kast det giftige stoffet som instruert av institusjonelle miljømessig helse og sikkerhet prosedyrer.
    7. Sted PBS eller PBS + 0,1% Natriumazid (advarsel) tilbake på farget cellene. Protokollen kan stoppes her og lagret på 4 grader i flere dager, eller fortsette til bildeopptak i del 5.
      ​ Forsiktig: Natriumazid er giftig. Bruke riktig personlig verneutstyr og kast de giftige stoffene som instruert av institusjonelle miljømessig helse og sikkerhet prosedyrer.
  2. Analyser induksjon av base lesjonene eller DNA-addukter av hvis flekker.
    1. Fastsette og permeabilize celler i iskalde metanol (advarsel) for 20 min på -20 ° C.
      FORSIKTIG: Metanol er giftige og brennbare. Bruke riktig personlig verneutstyr og kast det giftige stoffet som instruert av institusjonelle miljømessig helse og sikkerhet prosedyrer.
    2. Sug opp megthanol og la prøven tørke helt 15 min. protokollen kan stoppes her og celler som er lagret på-20 grader tørke opp til 3 dager.
    3. Rehydrate cellene i PBS i 15 min.
    4. Denature DNA bruker 2 N HCl (advarsel) for 45 min RT og vask 3 ganger med PBS.
      FORSIKTIG: HCl er etsende. Bruke riktig personlig verneutstyr og kast det etsende stoffet som instruert av institusjonelle miljømessig helse og sikkerhet prosedyrer.
    5. Nøytralisere i 50 mM Tris-HCl pH 8,8 i 5 min etterfulgt av 3 vasker med PBS.
    6. Incubate celler i blokkering buffer laget med 5% normal geit serum og 0,1% Triton X-100 i PBS 1t på RT.
    7. Incubate med primær antistoffer for 8-oxo-2´-deoxyguanosine (8-oxodG, 1:400) eller cyclobutane pyrimidine dimer (CPD, 1:1, 000) i geit serum blokkerer bufferen 1t RT, og deretter vaske 3 ganger med PBS.
    8. Ruge celler med Alexa 488 geit anti-mus i 1:2000 forholdet i geit serum blokkerer bufferen 1t på RT og vaskes 3 ganger med PBS.
    9. Stain kjernefysiske DNA bruke 1:5000 DAPI (10 mg/mL) i PBS for 5 min og vaskes 3 ganger med PBS.
    10. Hvis bruker kamret coverglass, plassere PBS eller PBS + 0,1% Natriumazid tilbake på farget cellene. Protokollen kan stoppes her og lagret på 4 grader i flere dager, eller fortsette til bildeopptak i del 5.
    11. Montere eventuelt cellene i foretrukne montering medium, hvis en ekstra coverglass kan plasseres oppå kultur fartøyet. Når herdet, montert celler kan lagres på 4 grader i lange perioder.

5. Image vinningen for immunofluorescence eksperimenter

  1. ren coverglass nederst kultur fartøyet med etanol og legg den tilbake på AC confocal mikroskop scenen. Kontroller at retningen og posisjonen til skipet på scenen samsvarer med retningen og posisjonen registrert når skaden ble indusert. Sikre kultur fartøyet for å sikre optimal registrering og bildebehandling.
  2. Finne tidligere fotografert felt ved hjelp av registrering teknikken valgt (beskrevet i 3,2).
    1. For manuell registrering ved hjelp av en coverglass med en etset grid, bringe rutenettet i fokus og finne identifisere merker. Så bruk innspilte XY-koordinater finner skadede celler.
    2. For avbildningsbasert automatisert registrering, Finn strukturelle funksjonen brukes som en referanse i trinn 3.2.1, og deretter justere visningen for gjeldende live mikroskop så nært til det registrerte bildet som mulig. Når justert, måle gjeldende XY mikroskop scenen plassering og sammenlign det med hvor XY referansebildet. Den lineære avstanden mellom de to plasseringene angir X- og Y-forskyvning. Denne forskyvning gjelde hvert registrerte XY sted å identifisere bildet felt som inneholder bestrålt cellen. Denne forskyvning funksjonen kan automatisert i mikroskopet kontroll programvare eller utført manuelt.
    3. Hvis ingen passende registrering poeng kan identifiseres, manuelt finne celler ved skanning lysbildet og finne funksjonene tidligere identifisert cellen.
  3. Hente bilder med passende mikroskop innstillinger for å samle alle farget mål, inkludert et brightfield bilde (innstilling i avsnitt 2.3 og fokuserer i Seksjon 3.3). Presentert eksperimenter, flerkanals bilder ble samlet ved hjelp av følgende eksitasjon laser linjer og fluorophores: 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 og overført DIC brightfield) og 561 nm (Alexa 546). Alle lasere passerer gjennom et enkelt acousto-optiske tunable filter kontrollere overføring av både laser bølgelengde og makt.

6. Live celle bildeanalyse av rekrutteringen av fluorescerende proteiner til mikro-bestrålt nettsteder

  1. Åpne ervervet bilder i et bilde analyse program (dvs. NIS elementer eller ImageJ). Eventuelt kombinere før bestråling bildet med timelapse bilder til genererer enkeltbilde pre- og post skade induksjon. Brukere kan vise rekruttering ved å måle endringer i fluorescerende intensitet over bestrålt området forhold til fluorescens intensiteten på hele kjernen (se representant resultater figur 1 B. ).
  2. For hver celle som skal måles, generere en referanse avkastning som representerer kjernen. Bruk en terskelverdi algoritme på fluorescerende signalet som inneholder bildepunkter utgjør kjernen, og deretter konvertere dette området til en avkastning. Om nødvendig kan Avkastningen trekkes manuelt ved brightfield som referanse. Justere Avkastningen gjennom tid å sikre kjernefysiske området er nøyaktig dekket av Avkastningen, og rapportere mener fluorescens intensiteten av fluorescerende signalet i denne Avkastningen for hvert delbilde.
  3. For hver celle som skal måles opprette en 6 x 6 piksler avkastning og plassere den over skaden avkastning for hver ramme av time course. Dette større avkastning er nå skaden avkastning for analyse. Rapport gjennomsnittlig avkastning fluorescens intensiteten for hver ramme.
    Merk: De fleste kommersielle analyseprogramvare inneholder moduler for 2D objekt sporing, og det er flere bruker-utviklet makroer for ImageJ eller FIJI som letter raskere arbeidsflyt og høyere frekvens (se https://imagej.nih.gov/ij/plugins/).
  4. Normalisere mener skade ROI fluorescens intensiteten som en tilsvarende referanse avkastning i hvert av timelapse. Her mener kjernefysiske fluorescens intensiteten brukes som referanse avkastning (se representant resultater figur 1). normalisering kan utføres ved å trekke mener referansen ROI fluorescens intensitet fra middelverdien skade ROI fluorescens intensitet, eller ved gjennomsnittet skade ROI fluorescens intensitet av mener referansen ROI fluorescens intensitet.
    Merk: Normalisering av division kan gi uforutsigbare resultater, hvis brukt i situasjoner med svært lav intensitet referanseverdier.
  5. Gjenta for alle skadede celler og minst to control, uskadet celler. Kontroll cellen resultater kan brukes til videre normalisering, eventuelt.
  6. Graf normalisert intensitetsverdiene over tid å vise endringer i rekruttering dynamikken som en funksjon av eksperimentell behandling.

7. Bildeanalyse av protein rekruttering oppdaget av immunofluorescence

  1. Åpne før og etter skade bilder i et bilde analyse program. Før skade bilder inneholder skaden ROI(s) brukes for mikro-bestråling. Kopier av ROI(s) og lim inn etter skade bildene til å identifisere målrettet celler.
  2. Genererer en 6 x 6 piksler avkastning for analyse av protein rekruttering og plassere denne Avkastningen på plasseringen av skaden avkastning. Dette større avkastning er nå skaden avkastning for analyse. Rapportere mener skaden ROI fluorescens intensitet.
  3. Normalisere mener skade ROI fluorescens intensiteten som en tilsvarende referanse avkastning. Her mener kjernefysiske fluorescens intensiteten av skadet cellen brukes som referanse avkastning (se representant resultater figur 1). Generere referansen Avkastningen ved hjelp av en terskelverdi-algoritmen på DAPI signalet for å definere kjernen, og deretter konvertere dette området til en avkastning. Rapportere mener referansen ROI fluorescens intensitet. Normalisering kan utføres trekke mener referansen ROI fluorescens intensiteten av mener skade ROI fluorescens intensitet eller dele mener skaden ROI fluorescens intensiteten av mener referansen ROI fluorescens intensitet.
    Merk: Normalisering av division kan gi uforutsigbare resultater, hvis brukt i situasjoner med svært lav intensitet referanseverdier.
  4. Gjenta for alle skadede celler, og utføre den samme analysen på minst to control celler, som beskrevet ovenfor.
  5. Graf normalisert intensitetsverdiene for hver målt mikro-bestråling hendelse mot tiden for å vise endringer i protein rekruttering eller type DNA skade som en funksjon av eksperimentell behandling.

Representative Results

Karakteristikk av indusert DNA skade
Induksjon av base lesjoner og strand bryter er avhengig av laser dosen brukes på det valgte kjernefysiske området i cellular microenvironment av celle modell brukte7. Fluorescerende proteiner smeltet å reparere som XRCC1, 53BP1, Ku70 eller Rad51, gi nyttig singel og dobbel tråd pause markører for å etablere minimal energien som kreves for å se opphopning av et fluorescerende protein i en skade avkastning over de bakgrunn fluorescens9,19,31. Når forholdene som induserer svar er funnet, er det avgjørende å karakterisere skade blandingen av at bestemt bølgelengde og dose. Demping av dose og varighet på bølgelengde brukt kan tillate brukeren å minimere dannelsen av komplekse skade blandinger. Lavt laser doser i UV-A området har blitt demonstrert for å produsere hovedsakelig SSBs og en liten mengde base lesjoner, passende for å studere SSBR og BER veier10,28. Øke dosen skaper mer komplekse base lesjoner, oksidativt og UV indusert og induserer mer betydelig antall DSBs7,10. Mens induksjon av én art av DNA skade er ønskelig for undersøkelse av bestemte DNA reparasjon stier, er det mer sannsynlig at brukere er inducing en blanding av DNA lesjoner, med en bestemt leksjonen som SSBs blir mye oftere enn base lesjonene eller DSBs. Dette ligner på DNA skade blandinger av kjemiske stoffer som hydrogenperoksid (H2O2) eller methyl methanesulfonate (MMS)32. Brukernes nød å være oppmerksomme når de rapporterer resultatene som skade blandinger kan forekomme, og forsiktig karakterisering av dose og lesjoner på webområdet indusert skade er nødvendige for å sikre reproduserbarhet og sammenlignbarhet sine resultater.

I mikro-bestråling studier brukes XRCC1-GFP ofte som en markør for induksjon av base lesjoner og SSBs9,28. XRCC1 er et stillas protein som spiller en viktig rolle i SSB reparasjon (SSBR) og base excision reparere (BER) og deltar også i andre reparasjon pathways, som nukleotid excision reparasjon (NER)33,34,35 . Det spiller en viktig koordinerende rolle i DNA-reparasjon, samhandle med en rekke viktige proteiner, inkludert poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1), DNA polymerase β (Pol β), og DNA ligase III. Vi utnyttet XRCC1-GFP stabilt uttrykt i CHO-K1 celler for å fastslå laser doser å generere SSBs og DSBs. Vi først identifisert minimum dose nødvendig å indusere en observerbar rekruttering av XRCC1-GFP for hver bølgelengde (figur 1). 355 nm bølgelengde, en 2 s holdetiden over definerte skaden ROI generert en økt fluorescerende signal i at Avkastningen, indikerer induksjon av DNA skade som var synlig over bakgrunnen (figur 1A). For 405 nm, en 8 fps avsøkingshastigheten var nødvendig for å generere en observerbar rekruttering til skaden avkastning (figur 1A). Dosen ble da økt (10 s 355 nm og 0,5 fps for 405 nm) til å opprette en mer intens skade avkastning (figur 1A).

Rekruttering og oppbevaring av XRCC1-GFP på stedet av indusert skade ble deretter kontrollert av timelapse bildebehandling. Oppbevaring av protein på stedet av DNA skade kan indikere pågående DNA-reparasjon, mens av protein fra webområdet indusert skade regnes ofte som en markør for gjennomføring av BER eller SSBR. Imidlertid har det vært ingen klare bevis knytter dissosiasjon av XRCC1 fra laser-indusert DNA skade nettsteder med ferdigstillelsen av reparasjon. Rekruttering av protein til området av skade målt ved rapportering mener intensiteten av fluorescerende signalet i skadet Avkastningen over mener fluorescerende signalet til hele kjernen (figur 1B). Denne typen normalisering hjelper adresse intensitet svingninger i kjernefysiske signalet, men andre normalisering teknikker kan være ansatt avhengig av mobilnettet fordelingen av protein av interesse. Her er XRCC1 lokalisert i kjernefysiske rommet, så normalisering kjernefysiske området måler videreformidling av signalet til skaden avkastning. ROI mener fluorescerende intensiteten registreres deretter for hver avbildning i timelapse, inkludert før skade bildet og grafisk som en funksjon av tid (figur 1C).

Vi deretter preget videre skader forårsaket av de to valgte laser doser undersøke dannelsen av DNA base lesjoner. Først ble dannelsen av CPD, en omfangsrik UV-indusert leksjonen, undersøkt av immunofluorescence som en markør for NER type lesjoner (figur 2A). Deretter undersøkt av oxidatively indusert base lesion8-oxodG som en markør for BER type lesjoner (figur 2B). Ingen betydelig økning i CPD lesjoner ble observert på lav doseeksponering for begge bølgelengder (2 s 355 nm og 8 fps for 405 nm), mens høy dose behandling på både bølgelengder (10 s 355 nm og 0,5 fps for 405 nm) viste en betydelig økning i lysstoffrør signal observert i skaden avkastning (figur 2A). Et spredningsdiagram av CPD ROI mener intensitet for hver skadet celle viser heterogenitet i skade dannelse og gjenkjenning både bølgelengder og doser, om at lave CPD lesjoner kan finnes på lavere doser, men belastningen kan ikke være betydelig oppdaget til en høyere dose brukes. Scatterplot foreslår også at ineffektivitet i antistoff oppdagelsen som kan begrense nøyaktig kvantifisering av skade blandinger.

Dette er ytterligere markert i registreringen av oxidatively indusert DNA lesjoner ved merketråden 8-oxodG. Ingen klar økning i fluorescerende signalet i skaden ROI ble observert i 8-oxodG laser bølgelengde eller dose brukes (figur 2B). Antistoffer brukes for dette arbeidet er i samsvar med tidligere publikasjoner9,10,36; Det bør imidlertid bemerkes at det kan være begrensninger i observere dannelsen av 8-oxodG med antistoffer37,38. Bekreftelse av mangel på oxidatively indusert lesjoner er også anbefalt av en andre markør, som rekruttering av 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), enzymet ansvarlig for fjerning av 8-oxodG fra DNA10. Vi observerer ikke OGG1 rekruttering til våre DNA skade steder; imidlertid dannelsen av lave nivåer av oxidatively indusert DNA skade kan ikke utelukkes helt.

Til slutt, vi undersøkte dannelsen av DSBs bruke to markører, γH2AX og 53BP-1, i markered laser doser av immunofluorescence (Figur 3 & 4). ΓH2AX brukes ofte som en strand pause markør, men dens spesifisitet for DSBs har blitt avhørt på en rekke rapporter39,40. I tillegg er det en fosforylering hendelse som overfører fra webområdet strand pause, slik lokalisering av signalet til en strand pause kan være begrenset på grunn av denne signal overføringen. Derfor gir kombinere γH2AX med 53BP-1 mer nøyaktig vurdering av DSB formasjonen i skaden avkastning.

Svaret av γH2AX og 53BP-1 mikro-bestråling er både bølgelengde og dose avhengige. Lav dose (2 s) stimulering på 355 nm utløser ingen reaksjon på 5 og 20 min, og en svak og variabel 10 min post bestråling (Figur 3A) i begge merkene. Høy dose (10 s) av 355 nm mikro-bestråling induserer en økt fluorescerende signal i skaden avkastning på 5, 10 og 20 min post bestråling som er redusert til 40 min (Figur 3B). Disse resultatene indikerer at forsiktig Serine 355 nm dosen er nødvendig for å minimere kryss-stimulering av reparasjon, som demonstrert av redusert påvisning av dobbel strand pause markør γH2AX på tidlig tidspunkt (< 20 min) på lav dose brukt.

Lignende eksperimenter som ble utført med både lav (8 fps) og høy dose (0,5 fps) 405 nm laser stimulering (Figur 4). På denne bølgelengde ble betydelige ansamling av fluorescerende intensiteten i skaden ROI observert både 53BP-1 og γH2AX uavhengig av påført dose, indikerer at disse doser genererer en kompleks blanding av enkel og dobbel-strand bryter nesten omgående etter induksjon av DNA skade (Figur 4). I tillegg de høye doser av 405 nm viser en økning i pan-kjernefysiske γH2AX flekker i 10 min av skade induksjon (Figur 4B, nederst) som gjør påvisning av skaden ROI vanskelig rapporten, mens 53BP-1 akkumulering er mer inne i skaden avkastning.

Disse resultatene viser tydelig at 405 nm mikro-bestråling passer ikke for overvåking SSBR eller BER, og at flere markører for DNA-addukter og strand pauser bør brukes for fullt karakterisere indusert lesjoner og DNA reparasjon svar.

Doseavhengig endring i rekruttering og oppbevaring av XRCC1-GFP
Når indusert DNA skade har vært preget, kan laser mikro-bestråling være en ideell plattform for å studere dynamikken i DNA reparasjon proteiner. The oppbevaring og dissosiasjon kinetics av XRCC1-GFP viser en dose avhengighet (figur 1), noe som ikke uventet induksjon av ulike skade blandinger av hver bølgelengde. Høyeste bestråling doser (10 s og 0,5 fps) viser en høyere intensitet rekrutteringen av XRCC1-GFP i forhold til lavere doser og lengre oppbevaring av XRCC1-GFP på stedet av skade gjennom 20 min tid (figur 1C). Dette indikerer at DNA skaden opprettet ved høyere doser for både 355 og 405 nm er sannsynlig ikke løst i løpet av eksperimentet, som samsvarer med utseendet og oppbevaring av DSB markører, γH2AX og 53BP-1 (tall 3 & 4 ).

Interessant, viser nederst skader doser (2 s og 8 fps) raske rekrutteringen av XRCC1-GFP til skade områder og Avstandtagen for XRCC1-GFP gjennom eksperimentell tid før bestråling nivåer (figur 1C). Uten fullstendig karakterisering av skade blandingen, kan dette føre til konklusjonen at SSBs og base lesjoner er helt løst disse skadelige betingelser. Men γH2AX og 53BP-1 40 minutter for 355 nm og 5 minutter for 405 nm kan føre til ulike tolkninger. For 355 nm 2 s dose være skade blandingen hovedsakelig SSBs, slik at utseendet på DSB markører på 40 min kan tyde på at noen ikke er reparert lesjoner kan fører til DSBs eller at DSBs generert av denne energien er reparert i en lengre tidsskala. Tid skala forskjellene mellom SSBR og DSB reparasjon har vært tidligere rapporterte28,41,42. Tilsvarende 405 nm lav dose (8 fps) dissosiasjon kan tyde på et lavt nivå av SSBs eller en klynging av SSBs som konverteres raskt til DSBs, som har vært kjent for høy skade mikro-bestråling og andre DNA skade agenter tidligere43, 44 , 45.

Sammen disse resultatene markere betydningen av karakteriserer indusert skade blandinger og utnytte flere DNA reparasjon proteiner og markører for å tolke rekruttering og oppbevaring av DNA reparasjon proteiner på steder av indusert skade.

Figure 1
Figur 1 . Laser mikro-bestråling induserer rekrutteringen av XRCC1-GFP. 
(A) CHO-K1 celler uttrykke stabilt XRCC1-GFP var irradiated og fotografert før og umiddelbart etter skade induksjon. Pilene angir plasseringen av mikro-bestråling dose og skala bar er 10 µm. (B) rekruttering er målt ved fastsettelse mener fluorescerende intensiteten i skaden avkastning og normalisere til mener fluorescerende intensiteten av hele kjernen. (C) dynamikken i rekruttering kan måles for hvert timelapse bilde. Grafer er representant for to uavhengige eksperimenter med feilfelt representerer SEM (n = 24). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Laser mikro-bestråling induserer nukleotid skade. 
CHO-K1 celler var utsatt for laser mikro-bestråling og fast umiddelbart etter skade induksjon. Immunofluorescence ble utført for å oppdage CPD og 8-oxodG addukter. (A) toppen, spredningsdiagram av Avkastningen mener fluorescens intensiteter observert i skadede celler etter CPD farging. Bunnen, representant bilder av CPD flekker. Pilene angir plasseringen av mikro-bestråling og skala bar er 10 µm (n = 12). (B) representant bilder for 8-oxodG flekker. PilerAngir plasseringen av mikro-bestråling og skala baren er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . DNA dobbel strand pause markører svarer på 355 nm mikro-bestråling i en dose avhengige måte. 
CHO-K1 celler ble utsatt for mikro-bestråling og fast på tide poeng angitt etter stimulering. Immunofluorescence for DSB markørene γH2AX og 53BP-1 ble utført. (A) punktdiagram tomten normalisert skade ROI mener fluorescens intensiteter målt for uskadet og skadede celler. Feilfelt er representant for SEM (n = 12). (B) representant bilder for γH2AX og 53BP-1 flekker. Pilene angir plasseringen av mikro-bestråling og skala bar er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. DNA dobbel strand pause markører robust svare på 405 nm mikro-bestråling.
CHO-K1 celler ble utsatt for mikro-bestråling og fast på tid poeng angitt post stimulering. Immunofluorescence for DSB markørene γH2AX og 53BP-1. (A) punktdiagram tomten normalisert skade ROI mener fluorescens intensiteter målt for uskadet og skadede celler. Feilfelt er representant for SEM (n = 12). (B) representant bilder for γH2AX og 53BP-1 flekker. Pilene angir plasseringen av mikro-bestråling og skala bar er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Bruke forholdene beskrevet her, kan noen AC confocal mikroskop med en UV-A eller 405 nm laser, integrert av produsenten eller lagt til av sluttbrukeren, indusere DNA skade i kjernen av en celle og la rekruttering av DNA reparasjon proteiner til området av indusert DNA skade som skal overvåkes. Brukes imidlertid makt, som nevnt i protokollen og representant resultater, valg av bølgelengde og skade karakteristikk er alle viktige spørsmål som må tas først av brukeren for å studere en bestemt DNA reparasjon veien. I tillegg er det andre hensyn i eksperimentell design som må også vurderes av brukere.

For å overvåke et protein atferd i lever celler innlegg mikro-bestråling, en fluorescently merket protein må opprettes. Tilgjengeligheten av en rekke fluorescerende proteiner som kan skilles spectrally tilbyr verktøy for å lage protein fusjoner som benyttes for å karakterisere mobilnettet Svar å induksjon av DNA skade. Forbigående transfection fluorescerende proteiner rundt tillater rask screening av skadelige forhold, mutasjoner eller selv hemmere, stabilt transfekterte celler kan tilby mer kontroll over uttrykk nivåer og tillate andre biokjemiske karakteristikkene som skal utføres, validere mikro-bestråling resultater. Spectrally distinkte fluorescerende proteiner kan også benyttes i samme celle overvåke interaksjoner mellom proteiner i den samme veien eller i ulike veier. Fluorescerende proteiner også eliminere behovet for spesifikke antistoffer for hver protein rundt og la levende celle overvåking av protein for lange perioder etter induksjon av skade.

Bruk av fluorescerende proteiner har imidlertid også ulemper. Uten genetisk bakgrunn mangelfull i protein(s) rundt konkurrerer endogen proteiner med fluorescently merket proteiner. Bøyning av fluorescerende koden til N eller C endestasjonen til protein kan endre proteinfolding, hindre nøkkel protein-protein interaksjoner, eller blokkere translokasjon signaler; endre funksjon og potensielt påvirker rekruttering dynamikk. Disse effektene har vært vist i en rekke rapporter der immunofluorescent flekker vist dramatisk annerledes rekruttering og tid for endogene proteiner på skade nettstedet28. Bruk av forbigående transfection eller stabil kloner kan også endre svaret observert, vanligvis gjennom variasjoner i protein uttrykk nivå. Videre kan bruk av flere fluorescerende proteiner i et enkelt eksperiment også endre dynamikken i rekruttering, hvis protein nivå ikke er equilibrated godt eller rekruttering av større fluorescently-merket protein blokkerer rekrutteringen av andre proteiner . Til slutt, fluorescerende proteiner kan fungere som svak sensibilisering agenter, øker dannelsen av reaktive oksygen arter, og potensielt endre DNA skade blandinger indusert46,47. Til tross for disse ulempene tilbyr fluorescerende proteiner en rekke forskjellige fordeler i studere DNA reparasjon med mikro-bestråling og hvis brukere innlemme aktuelle kontroller, for eksempel skade karakterisering beskrevet her, kan de gi ny innsikt i skade respons og protein-protein interaksjoner3.

Om levende celle imaging ikke er nødvendig, kan immunofluorescence brukes til å overvåke svaret indusert skade. Innlegg skade induksjon og flekker med antistoffer spesifikke for proteiner og lesjoner av interesse, statiske øyeblikksbilder av skade induksjon og rekruttering og oppbevaring av reparasjon proteiner kan bygges ved å feste cellene til bestemte tider. Antistoffer kan brukes til å overvåke rekruttering av flere proteiner av renter og/eller post-translasjonell modifikasjoner av DNA skade responsen. Bruk av immunofluorescence eliminerer behovet for fluorescerende proteiner, og tillater endogene protein problemet undersøkes. Denne metoden har imidlertid også sine ulemper. Svært spesifikke antistoffer er nødvendig, og permeabilization og blokkerer prosedyrer må være optimalisert for å tillate oppdaging av rekruttering med tilstrekkelig signal intensitet. Fikse prosedyrene er ikke umiddelbar, og denne fysiske betingelsen begrenser timelige oppløsningen på denne tilnærmingen. Tilordne området av skade induksjon slik at cellene kan ligge igjen etter farging kan også vise betydelige utfordringer. AC confocal mikroskopet brukt i dette arbeidet kan for avbildningsbasert registrering som beskrevet ovenfor, så skadede celler kan gjenopprettes med høy presisjon. Hvis scenen registrering eller etset coverglass ikke er tilgjengelig, gang investering involvert i gjør flytte celler uten scenen registrering, kombinert med den iboende forsinkelsen mellom skade induksjon og fotografert rekruttering, immunofluorescence skjemmende for noen brukere. Men vil den mest nøyaktige og fullstendige mikro-bestråling eksperimentell design inkludere slike tilnærminger parallelt med bruk av fluorescerende proteiner, som beskrevet i presentert protokollen.

Her, både levende celle bildebehandling og immunofluorescence til å vise nytten av laser mikro-bestråling. Immunofluorescent flekker tillater oss å undersøke nøyaktig blanding av DNA skade opprettet og rekruttering av proteiner av hver laser makt, som tillater oss å bedre tolke de observerte endringene på rekruttering og oppbevaring av XRCC1-GFP. Basert på disse resultatene, bør bruk av 405 nm lasere begrenses for undersøkelse av BER og SSBR proteiner. Videre den optimale eksperimentell designen inkluderer makt mål etter mål, full skade blanding karakterisering av hver celle linje som brukes og validering av rekruttering og oppbevaring observert i fluorescently merket proteiner med immunofluorescence. Selvfølgelig, utstyr, tid og kostnadsvurderinger kan gjøre disse optimal eksperimentell design umulig for noen brukere. Men betydningen av hvert av disse elementene er vist her, og brukere bør huske disse vurderingene på når du starter mikro-bestråling eksperimenter.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Samuel H. Wilson på National Institute of Environmental helse Sciences for cellen linjene i dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope Nikon
NIS Elements software Nikon
355 nm laser PicoQuant VisUV Radiation source
Galvanometer photoactivation miniscanner Bruker
Microscope slide photodiode power sensor THORLabs S170C
Fiber photodiode power sensor THORLabs S150C
Digital handheld optical power and energy meter THORLabs PM100D
CHO-K1 From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Minimal essential media Hyclone SH3026501
Fetal bovine serum Atlanta biologicals S11550
XRCC1-GFP Origene RG204952
Jetprime Polyplus transfection 11407
Geneticin ThermoFisher 10131035
4 chambered coverglass ThermoFisher 155382
8 chambered coverglass ThermoFisher 155409
Anti 53BP-1 Novus NB100304
Anti-phospho-histone H2AX  Millipore 05-636-I
Anti cyclobutane pyrimidine dimer Cosmo Bio clone CAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine  Trevigen 4354-MC-050
Alexa 488 goat anti-mouse ThermoFisher A11029
Alexa 546 goat anti-rabbit ThermoFisher A11010
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher R37606 Caution toxic!
Phosphate buffered saline ThermoFisher 0780
Normal goat serum ThermoFisher 31873
Bovine serum albumin (BSA) Jackson Immuno Research 001-000-162
37% Formaldehyde ThermoFisher 9311 Caution toxic!
Ethanol Decon Labs 2716
Methanol VWR BDH1135 Caution toxic!
HCl Fisher SA49
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Caution toxic!
Tris Hydrochloride Amresco O234
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
  2. Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
  3. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  4. Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
  5. Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
  6. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).
  7. Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
  8. Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
  9. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68 (2009).
  10. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  11. Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
  12. Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
  13. Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
  14. Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
  15. Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
  16. Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
  17. Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
  18. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
  19. Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
  20. Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301 (2012).
  21. Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
  22. Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
  23. Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
  24. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  25. Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
  26. Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
  27. Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
  28. Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
  29. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
  30. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  31. Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).
  32. Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
  33. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
  34. London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
  35. Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
  36. Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
  37. Cooke, M. S., Lunec, J. Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , World Scientific. 275-293 (2003).
  38. Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
  39. Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
  40. Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
  41. Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
  42. Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
  43. Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
  44. Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059 (2011).
  45. Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
  46. Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).
  47. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).

Tags

Kreftforskning problemet 127 DNA-reparasjon laser mikro-bestråling DNA skade strand pause XRCC1 gamma-H2AX strand pause signalisering
Bruk av Laser mikro-bestråling for undersøkelse av enkelt og dobbelt Strand pause reparasjon i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holton, N. W., Andrews, J. F.,More

Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (127), e56265, doi:10.3791/56265 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter