Summary
Sekundäre Degeneration der retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors) tritt häufig bei Glaukom. Diese Studie beschreibt eine innovative operative Vorgehensweise für partielle Sehnerv Durchtrennung. Die Verwendung dieses platzsparende operativen Ansatzes erstreckt sich das Modell Einsatzbereich und ermöglicht Erforschung der sekundären Verletzungen Mechanismen in Routinggruppenconnectors in einer neuen Weise.
Abstract
Frühere Studien haben gezeigt, dass die sekundären Degeneration der retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors) häufig bei Glaukom tritt. Partielle Sehnerv Durchtrennung gilt als nützlich und reproduzierbare Vorbild. Verglichen mit anderen Sehnerv Verletzungen Modelle zur Bewertung von sekundären Degeneration, z.B. komplette Sehnerv Durchtrennung und Sehnerv Crush Modelle häufig verwendete, ist das teilweise Sehnerv Durchtrennung Modell überlegen, wie es primäre auszeichnet von sekundären Degeneration in Situ. Daher dient es als ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Bewertung der sekundären Degeneration. Diese Studie beschreibt einen neuartigen operativen Ansatz teilweise Sehnerv Durchtrennung durch direkten Zugriff auf den Bereich des retrobulbären Sehnerven durch die orbitale seitliche Wand des Augapfels. Darüber hinaus präsentieren wir eine neu gestaltete, low-cost chirurgischen Instrument, mit Durchtrennung zu unterstützen. Wie die repräsentativen Ergebnisse bei der Unterscheidung von der Grenze des primären und sekundären Verletzungen Bereichen gezeigt haben, das Instrument und neuer Ansatz sorgt für hohe Effizienz und Stabilität des Modells durch die Bereitstellung von ausreichend Platz für chirurgische Operation. Dies erleichtert wiederum den Sehnerv vor Durchtrennung der meningealen Mantel und ophthalmologische Schiffe getrennt. Ein weiterer Vorteil ist, dass dieser Platz sparende operativen Ansatz die Ermittler verbessert, Drogen, Träger oder selektive RGC Tracer auf den Stumpf der teilweise durchtrennten Sehnerv, so dass die Erforschung der Mechanismen hinter zu verwalten sekundäre Verletzungen in Routinggruppenconnectors, auf eine neue Weise.
Introduction
Sekundäre Degeneration tritt häufig in das zentrale Nervensystem (ZNS) nach traumatischen Verletzungen und folgenden akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 der Tod von Neuronen und Gliazellen als eine frühe Folge des primären pathologische Ereignisse wird primären Degeneration bezeichnet, während sekundäre Degeneration bezieht sich auf den Tod von Neuronen und Gliazellen, die nicht oder nur teilweise von primären betroffen sind Schäden. Sekundären Degeneration der Routinggruppenconnectors wird auch geglaubt, um in Glaukom auftreten. 6 Yoles Et al. 7 bestätigt, dass sekundäre Schädigung des Routinggruppenconnectors im Sehnerv Verletzungen Modell auftritt. Sie zeigten, dass Neuronen, deren Axone wurden nicht verletzt, nachdem ein akuter Schäden schließlich aufgrund degenerativer Umgebung degenerieren wird, durch die Verletzung umgibt diese Axone produziert. Sekundäre Degeneration betrifft die Neuronen in einer progressiven Art und Weise im Zusammenhang mit der Schwere der zugefügten Schaden. Bisher unklar die Mechanismen RGC Schaden bei Glaukom, insbesondere im Zusammenhang mit sekundären Schädigung führt zu unzureichender klinischer Behandlung. 8 , 9 , 10 darum, ist es notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen der sekundären Degeneration der Routinggruppenconnectors während der Entwicklung eines Glaukoms zu erkunden. 11 Errichtung von Tiermodellen der sekundäre Verletzungen, die quantitativ, Größe, Verteilung und Mechanismus der sekundären Degeneration der Routinggruppenconnectors beurteilen können zieht immer mehr Aufmerksamkeit von Wissenschaftlern studiert sekundäre Verletzungen von Routinggruppenconnectors.
Um diese Frage zu klären, wurde einem Rattenmodell PONT Levkovitch-Verbin Et al. 12 auszuwertende axonale Schädigung induziert Degeneration und Tod von Routinggruppenconnectors. Dieses Modell wird geglaubt, um ein gutes Werkzeug für die Erforschung der Mechanismen der sekundären Degeneration und identifizieren mögliche neuroprotektive Akteure dar. Das Instrument benutzt, um dieses Modell der sekundäre Verletzungen zu erzeugen ist ein Diamant-Messer mit einer Skala bis quantitativ Transekt durch die Tiefe des Abschneidens durch den Drehknopf zum Abschließen einer quantitativen Durchtrennung des Sehnervs einstellen. Die chirurgische Weg nähert sich aus Augapfel nach oben oder temporalen Bindehaut. Während des operativen Vorgangs werden der Netzhaut und der Sehnerven durch die Kraft der Zange, beeinträchtigt wiederum primär Verletzungen führen kann. Noch wichtiger ist, aufgrund des begrenzten Platzes der exponierten Sehnerv ist es schwierig, die meningealen Scheide vor dem Schnitt zu trennen. Daher ist es möglich, die ophthalmologische Schiffe während der partiellen Sehnerv Durchtrennung, beschädigen, retinale Ischämie und das Scheitern des Modells führt. Darüber hinaus das Diamant-Messer ist kostspielig, und jedem Gebrauch verringert die Spitze Schärfe. Dies beeinträchtigt wiederum die Tiefe und Wirkung der Modellierung.
Das Modell der sekundären Degeneration der Routinggruppenconnectors beschrieben in dieser Studie wurde durch eine neue operative Vorgehensweise von orbital Seitenwand des Augapfels erhalten. Dieses neuartige operative Vorgehensweise greift direkt auf der retrobulbären Sehnerv orbital Muskel-Kegel, primäre Schädigung des Augapfels und des Sehnervs zu vermeiden, beim Ziehen nach unten oder in Richtung der nasalen lateralen Seite des Augapfels umgeben. Dies erhöht den Raum des chirurgischen Eingriffs bei Modell auch und ermöglicht meningealen Mantel Isolierung vor teilweise zu den Sehnerv. Es ist wichtig zu bemerken, dass die ungewollte Beteiligung und Verletzungen der ophthalmologischen Schiffe auf das Scheitern des Modells führen können. Darüber hinaus ermöglicht das Modell eine Follow-up-Bewertung der transfizierten Zellen, Drogen und Reagenzien auf den Stumpf der teilweise durchtrennten Sehnerv. Die selbst entworfene chirurgische Instrument kann ist billig und gebrauchte mehrmals, wodurch die Kosten der Modellierung. Das sekundäre Verletzungen Modell der Routinggruppenconnectors gegründet von dieser Methode zeigte gute Reproduzierbarkeit und Stabilität haben.
Protocol
Verfahren mit tierische Probanden durch das institutionelle Tier genehmigt wurden kümmern und Ausschuss (IACUC) von der Hauptstadt medizinischen Universität zu verwenden. Alle chirurgischen Instrumente und Lösungen wurden vor der Operation, mikrobielle Infektion zu begrenzen sterilisiert.
Hinweis: das chirurgische Protokoll enthalten fünf Teilen, nämlich Anästhesie, chirurgische Vorgehen, Sehnerv Bewertung, Schließung und Erholung. Um mit teilweise quantitative Durchtrennung des Sehnervs zu unterstützen, wurde ein neue, kostengünstige chirurgisches Instrument entwickelt. Alle Verfahren wurden nach ethischen Regeln und der Operationstechnik durchgeführt.
1. Operationstechnik
- Durchführung von Experimenten mit der aseptischen Technik; Protokolle für die Verwendung von Tieren sollte bestimmten Institution werden.
- Sterilisation Instrumente und Materialien (Lösungen, Testsubstanzen, Tracer, Nadeln, etc.) zur Vermeidung von Infektionen und nachteilige Auswirkungen auf den Tierschutz sowie potenzielle negative Auswirkungen auf die Studie die Berührung lebendes Gewebe .
2. Narkose
- Anesthetize SD-Ratten mit einem tierärztlichen Isofluran-Vaporizer-System. Verwenden Sie medizinischem Sauerstoff mit einer Rate von 1 L/min, um das Isofluran Gas verdampfen. Legen Sie das Tier im Feld beigefügten Anästhesie und führen Isofluran in einer Konzentration von 4,5 % bis langsame Atmung und tierischen Sedierung.
- Wechseln die Gaszufuhr an der Gasmaske Anlage und legen Sie das Tier auf dem OP-Tisch. Senken Sie die Isofluran-Konzentration um 2 % und Monitor Anästhesie. Größere Tiere (> 300 g) erfordern eine höhere Konzentration von Isofluran. Überwachen Sie Anästhesie während der Operation mit Isofluran Dosierung entsprechend angepasst. Ständig bewerten die Tiefe und die Atmung, und führen Sie Zehe Prise Bewertung alle 5 min um die Abwesenheit von tiefen Schmerz zu gewährleisten.
- Wenn die Operation abgeschlossen ist, schalten Sie die Isoflurane und lassen das Tier atmen Sauerstoff für einige Minuten vor dem Entfernen aus dem OP-Tisch. Körpertemperatur beizubehalten, indem das Tier mit einer chirurgischen Decke abdecken und/oder mit einer geregelten Wärme-Unterbett intraoperativ.
3. Selbst entworfen, chirurgische Assistenten Instrument (SSAI)
- Verwendung einer SSAI aus rostfreiem Stahl, und vor allem umfasst ein Hand-Held Pole (Länge, 100 mm, Durchmesser 9 mm) und einem gerillten Kopf ( Abbildung 1). Die geriffelte Oberfläche des gerillten Kopfes ist halbrund, vertikale Tiefe, Breite und Länge von 200 µm, 500 µm und 1.000 µm. Zwischen den beiden Teilen gibt es einen gemeinsamen Abschnitt mit einer Länge von 50 mm. Die gerillten Kopf ' s Edge ist 300 µm Breite.
Hinweis: Die gerillte Oberfläche ermöglicht die Stabilisierung des ventralen Sehnerven zur Durchtrennung. Die dorsale Sehnerv ist an der Außenseite der Nut ausgesetzt, wenn die ventrale Seite des Sehnervs darin legt; Unterdessen kann der dorsalen Sehnerv ausgesetzt an den geriffelten Rand transected werden als vertikaler Ausschnitt durchgeführt wird. Der ventralen Sehnerv innerhalb der geriffelten Oberfläche wird durch den geriffelten Kopf geschützt ' s Rand. - Zu erreichen primären Verletzung in Routinggruppenconnectors entsprechend quantitativ durchtrennten Sehnerv Axone (Rückenseite), während die sekundäre Verletzungen würde in Routinggruppenconnectors untransected Sehnerv Axone (Bauchseite) ohne direkten Schaden entsprechend durchgeführt werden.
4. Chirurgisches Vorgehen
- Ort der rechten Seite der Ratte nach oben auf den OP-Tisch mit Kopf nach der Chirurg. Stellen Sie die richtige Umlaufbahn in der Mitte des chirurgischen Sichtfeld. Reinigen Sie dann die Schnitt-Bereich mehrmals entlang der seitlichen Augenwinkel zu externen akustische Foramen der rechts orbital Haut, Anwendung von 0,5 % Chlorhexidin in 75 % Ethanol. Entfernen Sie das Fell zwischen den seitlichen Augenwinkel zu externen akustische Foramen mit Iris Schere.
- Stellen einen Hautschnitt mit Iris-Schere entlang der seitlichen Augenwinkel zu externen akustische Foramen mit einer Länge von 0,5 bis 1 cm. Dann kneifen Sie die Faszie und ziehen Sie nach oben, um einen dreieckigen Keil mit 0,12 mm gezahnte Pinzette zu erstellen. Untermesser Vannas Feder Schere in der Schnitt-Bereich einfügen und die Faszie in die gleiche Richtung Schere aufschneiden.
- Schnitt die Faszie mit Vannas Frühling Schere und setzen die orbitale Vene. Einsatz scharf gezackte Pinzetten, Klemmen Sie die Seiten der orbital Ader und stumpf öffnen Sie beide Seiten des Schnittes. Die orbitale Vene in chirurgische Richtung der orbital Muskel-Oberfläche positioniert ist, um Follow-up-Vorgang zu vereinfachen und eine Operation vermeiden im Zusammenhang mit Blutungen der orbital Ader.
- Iris-Schere zum Schneiden der rechten seitlichen Augenwinkel entlang der Schnittführung, vollständig aussetzen das Sichtfeld für stumpfe Dissektion der orbital Muskeln während auseinander folgen up verwenden
- Weiter, um Klemmen Sie den Ordner mit den Subfascial orbital Muskel und stumpf trennen vertikal in Richtung der Haut und Faszien Einschnitt. Separate Seiten nach und nach um die orbital Tiefe bis erscheinen des orbitalen Fettgewebes zu erreichen.
- Nach der Belichtung des orbitalen Fettgewebes Richtungswechsel der Ratte Kopf vor der Chirurg vertikal an der rechten Seite des Chirurgen. Unterdessen halten Sie den Bereich ständig feucht mit chirurgischen oder Wattestäbchen mit sterilen PBS. Dieses Verfahren sorgt für eine klare Vision des Operationsfeldes, wobei das Gewebe feucht und weich.
5. Zugriff auf den Sehnerv
- abgeschnitten orbitale Fettgewebe für den orbitalen Muskel Kegel um den Sehnerv in die Augenhöhle. Dies sorgt für eine bessere Belichtung für das entsprechende chirurgische Vorgehen. Halten Sie Resektion des Fettgewebes begrenzt, um zu vermeiden, nachhaltig Blutungen.
- Schneiden das Fettgewebe, die seitlichen Rectus auszusetzen. Klemmen Sie die seitlichen Rectus nach außen, und dann schneiden Sie es mit einer Schere Vannas Frühling. Bleibt das Fettgewebe unter der seitlichen Rectus, ziehen Sie das Fett über den Sehnerv mit 0,12 mm gezahnte Pinzette und schneiden Sie es mit einer Schere Vannas Frühling.
Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt der Gewebe Mantel um den optischen Nerv sollte sichtbar sein. - Weiter, die Gewebe-Hülle entlang der Richtung des Sehnerven in die Tiefe des orbitalen bis Gesamtbelastung des Sehnervs zu trennen. Halten Sie den Bereich sauber mithilfe von chirurgischen Tupfer reinigen kleine Mengen von Blut, die durch Gewebeentnahme entstehen.
Hinweis: Nun, den Sehnerv sollte sichtbar sein. - Um darauf zuzugreifen, entfernen Sie die meningealen Hülle, die den Nerv umgibt, ohne Beschädigung der Augenarterie. Sanft drehen die Scheide untersuchen die vaskuläre Muster der Dura bei hoher Vergrößerung unter einem Operationsmikroskop.
- Ein Gebiet frei von Blutgefäßen zu identifizieren, und führen Sie einen längs-Schnitt auf die Dura. 13 rip die Scheide parallel zur Richtung des Sehnervs mit 26G Nadelspitze oder Messerspitze Saphir chirurgische Probe sorgfältig, Vermeidung von Schäden an das Gefäßsystem mit seitlichen Einschnitte.
Hinweis: Die einzige übrig gebliebene deckt den Nerv sollte die Arachnoidea membraNe, die sehr dünn und transparent ist.
- Ein Gebiet frei von Blutgefäßen zu identifizieren, und führen Sie einen längs-Schnitt auf die Dura. 13 rip die Scheide parallel zur Richtung des Sehnervs mit 26G Nadelspitze oder Messerspitze Saphir chirurgische Probe sorgfältig, Vermeidung von Schäden an das Gefäßsystem mit seitlichen Einschnitte.
- Ähnlich wie bei Schritt 5.2, rip die Arachnoidea Membran vorsichtig mit einer Nadelspitze 26G oder Messerspitze Saphir chirurgische Probe parallel zur Richtung des Sehnervs. 13
- legen den Sehnerv innerhalb der Instrument-Nut sanft und vorsichtig, was in den dorsalen Sehnerv wird etwas höher als der gerillten Kopf Rand. Zu diesem Zeitpunkt Transekt dorsalen Sehnerven über die Kante der gerillten Kopf Plattform mit einer Nadelspitze 26G oder Messerspitze Saphir chirurgische Probe teilweise Sehnerv Durchtrennung abschließen.
6. Schließung und Verwertung
- Bewegung des Instruments ein wenig tiefer in Richtung der vertikalen Richtung des Sehnervs, Letzteres zu befreien. Dann entfernen Sie sanft die geriffelten Kopf des Instrumentes. Versuchen Sie nicht zu kratzen die Augenmuskeln oder anderen Geweben, zusätzlichen Schaden zu vermeiden. Der Stumpf des teilweisen Sehnerv Durchtrennung beobachtet werden.
- Ersetzen die seitlichen Rectus, Faszien und anderen umliegenden Gewebe des Auges an ihren ursprünglichen Positionen. Dann Naht der Muskel und die Hautschichten der Umlaufbahn in Folge. Wenn die Blutung anhält, sanft mit einem medizinischen Wattebausch vor dem Verschließen der Wunde füllen Sie, und halten Sie dies für einen bestimmten Zeitraum hinweg. Wenden Sie antibiotische Salbe auf die Wunde, um Infektion zu verhindern.
- Turn off Isofluran-Quelle und lassen das Tier zu atmen Sauerstoff für einige Minuten. Bei der Ratte Reanimation vorbereiten Wärmedämmung mit einer beheizten Matte oder Abdeckung der Käfig mit trockenen Polsterung. Decken die Tiere mit Decken, Ratte Fluglinie Durchgängigkeit des Wiederherstellungsvorgangs sicherzustellen.
- Haustiere individuell nach der Operation. Verwalten Sie postoperative Schmerzmittel nach den Richtlinien von institutionellen Tierbetreuung Behörden zur Verfügung gestellt. Tiere nach der Operation sorgfältig zu überwachen.
Representative Results
Um Erfolg bezüglich der Einrichtung eines sekundären Verletzungen-Modells mit dem neuen operativen Ansatz mit SSAI (Abbildung 2A)zu überprüfen, wurden die Routinggruppenconnectors Doppelthebel sofort nach Gründung Modell beschriftet. Der Zweck dieses Verfahrens war Label Routinggruppenconnectors Doppelthebel durch Einspritzen von neuronaler Tracer Farbstoff (3 % Fluorophor (z.B.Fluorogold) in sterilen Phosphat Puffer Kochsalzlösung) in den superior Colliculus (Abb. 2 b). Dieser Ansatz liefert reproduzierbare Kennzeichnung von lebensfähigen Routinggruppenconnectors mit geringen Abweichungen. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 der Farbstoff wird von Routinggruppenconnectors in der Netzhaut Doppelthebel aufgenommen werden und ist einen Marker für live Routinggruppenconnectors mit der Axone nicht durchtrennten auf dem rechten Auge. Unterdessen Routinggruppenconnectors entspricht teilweise durchtrennten Sehnerv, die Axone auf dem rechten Auge nicht mit Tracer Farbstoff (Abbildung 2)beschriftet werden konnten. Als Kontrolle Auge das linke Auge ohne Operation, Routinggruppenconnectors entlang des Sehnervs, der Netzhaut wurden alle beschriftet mit gold Leuchtstofffärbung retrograde gewissermaßen aus dem superior Colliculus (Abb. 2D).
Sieben Tage nach teilweiser Sehnerv Durchtrennung und retrograde Kennzeichnung von Routinggruppenconnectors, wurden die Netzhaut geerntet, fixiert, abgeflacht und montiert. Die beschrifteten Routinggruppenconnectors wurden unter einem fluoreszierenden Mikroskop in definierten Regionen der Netzhaut abgebildet. Die Ergebnisse der Fluoreszenz-markierten Routinggruppenconnectors mit oder ohne teilweise Sehnerv Durchtrennung sind in Abbildung 3dargestellt. Nur die Routinggruppenconnectors in der richtigen Netzhaut entsprechend des untransected Teils des optischen Nervs mit fluoreszierenden Gold beschriftet waren, und eine klare Abgrenzung der unbeschrifteten und beschriftet Routinggruppenconnectors könnte visualisiert (Abb. 3A, Abb. 3 b), demonstriert die partielle Transaktion des Sehnervs. Als Kontrolle Auge, alle Routinggruppenconnectors der linken Auge Netzhaut zeigte Fluoreszenz (Abbildung 3, Abbildung 3D).
Um zu beurteilen, ob das Gefäßsystem des Sehnervenkopfes und der Augenarterie, das Blut der Entoretina versorgt wurden verletzt und während des Betriebs, dem rechten Auge-Fundus betroffen war vor und nach der Operation abgebildet. Die Bilder zeigten Blut-Versorgungsmaterial auf dem rechten Auge (operative) vor und 1 Stunde nach Operation. Blut in den Arterien war angemessen. Keine Behinderung der Vene wurde beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, dass während des Betriebs (Abbildung 4A, 4 b Abbildung)gab es keine Schäden an der Blut-Versorgung-System. Daher wurde das Modell der sekundären Degeneration der Routinggruppenconnectors erfolgreich etabliert.
Abbildung 1 : Fotos von selbst entworfenen OP-Assistenz Instrument, SSAI. (A) einen Panoramablick über das chirurgische Instrument mit zwei Hauptteile, einschließlich ein Hand-Held Pole und einen geriffelten Kopf. Dazwischen gibt es ein gemeinsamen Abschnitt mit einer Länge von 50 mm. Die Länge der Hand Stange beträgt 100 mm und der Durchmesser der Handheld Stange beträgt 9 mm. (B) eine Funktion der SSAI Nut. Die geriffelte Oberfläche des gerillten Kopfes ist halbrund, ermöglicht es den Sehnerv an darin lag für Durchtrennung stabilisiert wird. Die gerillte Oberfläche ist mit einer vertikalen Tiefe von 200 µm und eine breite von 500 µm und eine Länge von 1.000 µm. Die Breite des Randes der gerillten Kopf beträgt 300 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Schematische Darstellung der RGC Markierung auf der Netzhaut nach partielle Durchtrennung der rechten Sehnerv mit selbst entworfenen OP-Assistenz-Instrument (SSAI) und Doppelthebel Kennzeichnung der superior Colliculus mit dem Fluorophor. (A) die chirurgische Ansicht der teilweisen rechten Sehnerv Durchtrennung bei Ratten mit dem Instrument selbst entworfenen OP-Assistenz (SSAI). (B) nach der Modellierung, wurden Routinggruppenconnectors Doppelthebel beschriftet durch Einspritzen von neuronaler Tracer Farbstoff (gelb, 3 % Fluorophor in sterilen Phosphat Puffer Kochsalzlösung) in den superior Colliculus im Gehirn. Da die Axone der Routinggruppenconnectors in superior Colliculus wohnen, der Tracer-Farbstoff ist von Routinggruppenconnectors Doppelthebel aufgegriffen und bildet einen Marker für lebende Zellen. Der Querschnitt in der Abbildung stellt einen Querschnitt des Sehnervs. OD, operierten Auge; OS, Kontrolle Auge ohne Operation. (C)wurden nur die Routinggruppenconnectors entspricht des untransected Teils des Sehnervs mit Fluorophore beschriftet. Blau steht für ungetrennten ventralen Sehnerven und die entsprechenden Routinggruppenconnectors auf der Netzhaut; Rot spiegelt teilweise durchtrennten dorsalen Sehnerven und die entsprechenden Routinggruppenconnectors auf der Netzhaut. (D) der Netzhaut waren Routinggruppenconnectors des linken Auges (Kontrolle Auge) ohne operativen Eingriff alle durch den Farbstoff beschriftet. Dorsalen und ventralen Sehnerven waren alle durch den Farbstoff so gut beschriftet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Gesamte Netzhaut Epifluoreszenz Mikrographen des Fluorophore beschriftet Routinggruppenconnectors 7 Tage nach der Gründung der teilweisen Sehnerv Durchtrennung modellieren und retrograde Kennzeichnung von den Colliculus superior. Die entsprechenden Schemata von Fluorogold gebeizt RGC Bereiche auf der Netzhaut werden ebenfalls vorgestellt. (A) und (C) die schematischen Darstellungen von Routinggruppenconnectors in der Netzhaut des Rechts (operativ) und links (Kontrolle) Augen nach Markierung mit Fluorophor, bzw. vertreten. Gelb zeigt den Bereich mit gold Leuchtstofffärbung beschriftet. Die Netzhaut ist in dorsale, ventrale und zentralen Teile unterteilt. (B) und (D) repräsentieren die gesamte Netzhaut Epifluoreszenz Mikrographen erhalten unter dem Fluoreszenzmikroskop; Gelb ist die Routinggruppenconnectors mit Fluorophore beschriftet. In der chirurgischen Auge (rechtes Auge) in Bgezeigt vertritt die unbeschriftete Region Bereich Routinggruppenconnectors entsprechend des Sehnervs, die teilweise, vor allem auf der dorsalen Seite der Netzhaut durchtrennten ist. Die Region von gold Leuchtstofffärbung beschriftet ist der Bereich der Routinggruppenconnectors entspricht den Sehnerv nicht durchtrennten und hauptsächlich in den zentralen und ventralen Seiten der Netzhaut. Die bounzwischen den Bereichen beschriftete und unbeschriftete Routinggruppenconnectors Dary ist klar. Primären Degeneration der RGC Körper wäre auf der dorsalen Netzhaut beschränkt, und alle Verluste der RGC stellen in der zentrale und ventralen Netzhaut könnte zu einer sekundären Degeneration zugeschrieben werden. (D) der gesamten Netzhaut Mikrophotographie des linken Auges nach Kennzeichnung von Routinggruppenconnectors mit Fluorophor. Die Routinggruppenconnectors des linken Regler Auges ohne chirurgischen Eingriff waren völlig vom Fluorophor befleckt. Skalieren von Balken = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Präoperative und postoperative Bilder des Augenhintergrundes des rechten Auges erzielten Funduskamera. (A) Darstellung des Augenhintergrundes vor dem rechten Augenchirurgie in Ratten, gute Blutversorgung des Augenhintergrundes, arterielle Füllung und keine venösen Rückfluss oder Obstruktion, zeigt ein gutes retinalen Blut Versorgungssystem. (B) Bild des Augenhintergrundes des rechten Auges 1 Stunde nach der Operation. Im Vergleich mit dem präoperativen Bild des Augenhintergrundes, wurden keine signifikanten Veränderungen beobachtet in retinal Blutversorgung, darauf hinweist, dass das Blut Versorgungssystem des Augapfels während des Prozesses der Modellierung nicht betroffen war. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Fotos von der retrobulbären Sehnerv und der Augenarterie befindet sich auf der meningealen Scheide, eingefangen durch das chirurgische Vorgehen. Nach dem komplett entfernen die gezielte Länge des Sehnervs, war der Augenarterie (Pfeilspitze) mit der meningealen Mantel des Sehnervs ausgesetzt, und parallel zu den Sehnerv. Skalieren von Balken = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Schematische Darstellung der primären und sekundären Degeneration lagen in den Sehnerv. Partielle Inzision des Sehnervs wurde erreicht mit dem Instrument selbst entworfenen OP-Assistenz (Pfeilspitze). Die Axone direkt beschädigten Websites (dorsale schneiden Standort des Sehnervs im Stirnschnitt in grau) unterziehen primären Degeneration, während diejenigen in indirekt beschädigte Seiten (Mittel- und ventralen Bereiche des Sehnervs im Stirnschnitt in gelb) sekundäre Degeneration zu unterziehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Operative Verfahren
Es gibt einige Punkte verdient Bekanntmachung in den Prozess der Modellbau. Im Schritt 4.2 sollte die chirurgische Bewegung sorgfältig durchgeführt werden, um nicht zu beschädigen das Gefäßsystem über dem Subfascial Muskel. Vor allem beim Schneiden der subkutanen Faszie in die äußeren seitlichen Augenwinkel sollte scharf gezackte Zange verwendet werden, die subkutane Faszie an der Faszie Oberfläche nach oben vertikal zu ziehen; die Faszie sollte Vannas geschnitten werden mit Feder Schere zur Vermeidung von Beschädigungen, die orbitale Vene am äußeren Augenwinkel, die Modell-Ausfall durch übermäßige Blutungen führen kann. Schritt 4.3 hat den Vorteil der potenziell verhindert Blutungen, wenn Sie direkt aus den Blutgefäßen zu entfernen. Orbitale Muskeln im Schritt 4.5, der Grund für die Kommissionierung scharf gezackte Zange aber nicht Vannas zu trennen ist Frühling Schere, ständige Blutungen und Blutungen zu vermeiden. Die Muskeln werden unverblümt auf beiden Seiten in Richtung senkrecht zu der Hautinzision Faszie getrennt; Unterdessen werden die tiefen Muskeln der Umlaufbahn nach außen und peripher gestreckt. Dieses Verfahren wird tiefer Teile der Augenhöhle, ein größeres chirurgischen Fenster und ungehinderten Zugang zu den Geweben, die Überlagerung der Sehnerv offenbaren. In den oben genannten Verfahren, wenn Blutungen auftreten, Druck angewandt werden mit sterilen chirurgischen oder Wattestäbchen. Kleinere Blutungen wird durch diesen Vorgang nach einigen Sekunden beendet. Schritt 4.6 soll Nachfolgeoperationen entfernen Sie leicht einige Fetten und separate Muskeln in der Umlaufbahn Muskel Kegel des Sehnervs entlang der Richtung des Sehnerven in die orbitale Tiefe aussetzen zu erleichtern.
Die wichtigsten Teile des derzeitigen Protokolls sind Schritte 5.1-5.6. Es ist wichtig, nicht zu beschädigen das Gefäßsystem um den Sehnerv Kopf. Der Sehnerv sollte teilweise transected mindestens 1,5-2,0 mm von der Rückseite des Auges, um Schäden an der Augenarterie zu vermeiden, die den Nerv innerhalb 1 mm des Auges dringt ein und liefert Blut an der inneren Netzhaut. Das Schneiden der seitlichen Rectus soll bessere Belichtung des Sehnervs zu erreichen, wie die seitlichen Rectus breit ist und offensichtlich die Sicht des Sehnervs versperrt. Inzwischen, um zu vermeiden, entfernen der Augenarterie, der mit der meningealen Scheide (Abbildung 5)verbunden ist, ist es notwendig zu trennen und die Dura rund um den Sehnerv zu distanzieren und das vaskuläre Muster der meningealen Hülle zu untersuchen, verwenden Zange um die Scheide sanft zu drehen. Darüber hinaus sollte eine Fläche frei von Blutgefäßen identifiziert werden, erlauben einen längs-Schnitt in der meningealen Scheide. Es ist auch notwendig, einen kleinen arbeiten Abstand von der Rückseite des Auges, die Teil der Dura zu vermeiden, die eng mit der Augenarterie verbunden ist. Die Netzhaut ist normalerweise transparent, und Blutgefäße können klar abgegrenzt. Im Falle eines beschädigten Netzhaut Blut-Versorgungsmaterial ist die Netzhaut verkommen, führt zu einem milchig-weißes flockiges Aussehen. Die gläserne Kammer des Auges und das Objektiv wird in der Regel im Laufe der Zeit bewölkt sowie mit verringerter Auge Größe geworden. In dieser Studie bestätigt präoperative und postoperative Bilder des Augenhintergrundes keine Schäden an den Fundus Blutversorgung im Modell nach der Anwendung der oben genannten Schritte.
Darüber hinaus ist besonderer Sorgfalt erforderlich, in mehreren Schritten dieses Modells. Bei Sharp-gebogen-Wellenschliff Pinzette oder andere chirurgische Instrumente verwenden, um den Sehnerv zu entlarven, vermeiden der Chirurg übermäßigen Kraft, es des Sehnervs, der Augapfel oder Augenarterie, beschädigen was primäre Verletzung und retinale Ischämie. Darüber hinaus sollten Blutgefäße rund um das Auge nicht beschädigt werden, um zu vermeiden, anhaltende Blutungen, führen könnte zum Ausfall der Modellierung. Die in diesem Experiment verwendet SSAI erfordert empfindliche Nutzung. Wenn der Sehnerv innerhalb der Instrument-Nut platziert wird, müssen die Sehnerven und gerillte Oberfläche fest montiert werden, um gute Konsistenz und Wiederholbarkeit der einzelnen Tiermodell zu gewährleisten. Mit etwas Übung kann das vollständige chirurgische Verfahren innerhalb von 15-20 Minuten pro Auge, abgeschlossen werden, nachdem die erstmalige Einreise Kürzungen vorgenommen wurden.
Wang Et al. 19 veröffentlicht eine ähnliche Tiermodell der teilweisen Sehnerv Durchtrennung über ein Sehnerv quantitative Item hergestellt. Die chirurgische Eingriffe umfasst: 1) auseinander schneiden, die äußeren Augenwinkel, Aussetzung und Befestigung der palpebrale Superior; (2) des Sehnervs zu erforschen und zu den überlegenen Teil des Sehnervs mithilfe der Item; und 3) Nähen die Bindehaut und die Haut. Obwohl der Eingriff relativ einfach war, wurden die folgenden Probleme während des Vorgangs gefunden. Obwohl seitlichen Augenwinkel Einschnitt bestimmten Raum für den Betrieb aussetzen könnte, gab es eine unvermeidliche Notwendigkeit, ständig den Augapfel Strecken um die retrobulbären Sehnerven Scheide offen zu legen, vor allem, wenn die Chirurgen eine längere retrobulbären aussetzen wollte Sehnerv Mantel Mantel isoliert weiter zu erleichtern; die Kraft für die Dehnung des Augapfels war größer, die direkte Traktion Verletzungen des Augapfels und der Sehnerven führen dürfte. Keine besondere Aufmerksamkeit galt an den Blutgefäßen, die zusammen mit den Sehnerv Mantel geschnitten werden könnte, und Schäden an den Blutgefäßen wird voraussichtlich zu gescheiterten Modell führen. Die wichtigsten Verfahren der sekundären Schädigung Modell in diesem Dokument beschriebenen sind: eine neue Operative nähern von orbital Seitenwand des Augapfels direkt zugänglichen retrobulbären Sehnerven umgeben von orbital Muskel Kegel, primäre Schädigung zu vermeiden die Augapfel und Sehnerv, beim Ziehen nach unten oder in Richtung der nasalen lateralen Seite des Augapfels. Diese neue operative Vorgehensweise erhöht den Raum des chirurgischen Eingriffs beim Modellieren und ermöglicht einfache Isolierung der meningealen Hülle, die eng mit der Augenarterie vor partielle Durchtrennung des Sehnervs verbunden ist. Partielle Sehnerv Durchtrennung erfolgte mit einem selbst entworfenen chirurgischen Instrument, die kostengünstige und wiederverwendbar, reduzieren die Gesamtkosten der Modellierung ist. Die Ratte orbital Struktur ist verschieden von denen anderer Säugetiere, mit der Umlaufbahn am nächsten an die Augenwinkel und keine knöcherne Struktur, aber mit Muskeln bedeckt. Das chirurgische Vorgehen könnte den hinteren Teil des Augapfels ohne Zerstörung der orbital Knochen und Periost erreichen. Durch strenge präoperative Desinfektion und postoperative antibiotische Prophylaxe wurden Infektion, Entzündung und Ödem stark reduziert.
Selbst entworfene chirurgische Assistenten Instrument
Rattenmodell der teilweisen Sehnerv Durchtrennung entstand, indem er die selbstentworfenen OP-Assistenz-Instrument, deren wichtigste Merkmale wie folgt sind. Es hilft bei teilweise quantitative Durchtrennung des Sehnerven an den geriffelten Rand, auch die Durchtrennung Kohärenz zwischen verschiedenen Tieren ausgesetzt. Wir haben getestet und überprüft die Wiederholbarkeit der Modell-Einrichtung mit SSAI. Der maximale Variationskoeffizient war 1,85 %, mit einem durchschnittlichen Wert 0,67 % ±0. 44 %. 20 diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die SSAI verwendet werden könnten, teilweise Sehnerv Durchtrennung Modelle, zu befriedigend Reproduzierbarkeit und UN-knüpfenIformity.
Die gerillte Oberfläche Breite und das Design des Halbkreises der inneren Oberfläche der Nut können mehr feste wirken auf den Sehnerv und die gerillte Oberfläche und Sehnerv befestigen enger, auch experimentellen Fehler und unerwünschte Arzneimittelwirkungen verringern. Die geriffelte Rand ermöglicht einen besseren Schutz des Sehnervs in die Nut während der Operation, die den Sehnerv in der Nut, unabhängig von der Fräser Schärfe nicht beschädigt wird. Ein weiterer Vorteil des geriffelten Rand ist verknallt Verletzungsprävention beim Sehnerv Durchtrennung.
Es eignet sich für den Betrieb bei tiefen und schmalen Raum. Obwohl die neuen operative Ansatz erweitert worden ist, der Weg bleibt tief und Handheld Pol und gemeinsamen Abschnitt können verwendet werden, um den gerillten Kopf leicht unter den Sehnerv Mantel zum Follow-up-Operationen zu platzieren. Wenn das Gerät für den Betrieb verwendet wird, kann eine Vielzahl von Messern für Durchtrennung, z. B. einer Nadelspitze 26 G verwendet werden. Auch ein Saphir chirurgische Probe Messer kann ausgewählt werden, zu vermeiden, Quetschungen und Verletzungen durch Scheren zu vernichten. Nut Oberflächen können in verschiedenen vertikalen tiefen erfolgen, um unterschiedliche Grade der Sehnerv schneiden abzuschließen.
Verglichen mit der Item von Wang hat Et Al. die SSAI eine einfachere Struktur. Darüber hinaus ist der Schneiden Schritt bequemer mit der SSAI mit verbesserte Konsistenz und Wiederholbarkeit der Tiermodell. Zu guter Letzt ist die Palette der Werkzeuge für das Schneiden mit der SSAI auch breiter. SSAI, wodurch quantitative und einheitliche Einschnitte des Nervs kann zusammenfassend als wirksames Instrument für die Festlegung der Ratte-Modelle für die Beurteilung der Sehnerv Durchtrennung dienen.
Merkmale des Modells Ratte teilweise Sehnerv Durchtrennung
Das teilweise Sehnerv Durchtrennung Modell ist nützlich, um sekundäre Degeneration Routinggruppenconnectors zu beurteilen. Das mögliche Verdienst dieses Modells ist die Fähigkeit, primäre von sekundären Degeneration genau trennen in Situ, sowohl in den Sehnerv und Netzhaut. Die zentrale und ventralen Sehnerven wurden anfälliger für sekundäre Verletzungen nach partielle Durchtrennung (ca. 1/3 bis 1/2) des dorsalen Sehnerven (Abbildung 6). In der Netzhaut die regionale Lage des primären und sekundären Verletzungen von Routinggruppenconnectors die Topographie des Sehnervs entspricht retinalen Routinggruppenconnectors nach partielle Durchtrennung beruhen. Wenn die gesamte Netzhaut der Ratte in dorsalen (Superior) und ventralen (unterlegen) Teile geteilt wird, sind primäre und sekundäre Verletzungen in beiden Teilen vorhanden. Jedoch sollte auf der Grundlage der Beziehung zwischen Routinggruppenconnectors auf der Netzhaut und der Sehnerv Axon RGC Tod in der ventralen Netzhaut vor allem sekundäre Verletzungen (Abbildung 3)zugeschrieben werden. 12 , 22 , 23 die Vorteile dieses Modells sind: einfach und leicht zu bedienende Instrument mit Standardverfahren; kein Effekt auf ophthalmologische Schiffe; gute Reproduzierbarkeit und Stabilität. Diese Technik kann verwendet werden, um Routinggruppenconnectors von diesem Platz sparende operativen Ansatz zu transfizieren, durch die kurzen interferierenden RNAs (SiRNAs), Plasmide, Anwendung und virale Vektoren des teilweisen Sehnerven stumpf; Darüber hinaus könnte die teilweise Sehnerven Stumpf für die selektive Behandlung oder Kennzeichnung von Routinggruppenconnectors Reagenzien auferlegt werden.
Insgesamt, primäre und sekundäre Verletzungen von Routinggruppenconnectors koexistierten nach teilweiser Sehnerv Durchtrennung in diesem Tiermodell mit eine klare Grenze in der Netzhaut zwischen zwei Verletzungen. Obwohl der Verband der RGC Lage auf der Netzhaut und Sehnerv Axone weiteren Untersuchungen für eine genauere Unterscheidung benötigt, dieser Platz sparende operative Vorgehensweise erstreckt sich den Anwendungsbereich des Modells und erlaubt es den Forschern zu erkunden die Mechanismen der sekundäre Verletzungen in Routinggruppenconnectors in einer neuen Weise.
Disclosures
Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Beijing Natural Science Foundation (7152038), die grundlegende Forschungsmittel für die zentralen Universitäten Central South University (2016zzts162) und der Science Foundation der Aier Auge Krankenhaus Forschungsgruppe (Grant Nr. unterstützt. AF156D11). Zu guter Letzt Dank Fancheng Yan Yiping Xu für die wertvolle Unterstützung im Laufe der Jahre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
| Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
| Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
| Fluorogold | Biotium | 80014 | |
| Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
| Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
| Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
| Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
| Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
| 26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
| 10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
| 5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
| Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
| Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
| Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
| RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
| Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |
References
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