Summary
ويصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لرصد استمرار الخلايا وبيوديستريبوشن البشرية المستمدة من الدهنية الخلايا الجذعية الوسيطة (هامسكس) التي استعملنا fluorescence تسمية في نموذج الفئران ركبة هشاشة العظام (كوا) عن طريق الحقن (IA) داخل المفصل.
Abstract
وبغية دعم التطبيق السريري للبشرية المستمدة من الدهنية الوسيطة (هامسك) العلاج بالخلايا الجذعية للركبة هشاشة العظام (كوا)، قمنا بدراسة فعالية استمرار الخلايا وبيوديستريبوشن من هامسكس في نماذج حيوانية. أظهرنا أسلوب تسمية غشاء الخلية هامسكس بصبغة الفلورسنت محبتين. في وقت لاحق، تم رصد الحقن داخل المفصل للخلايا المسماة في الفئران مع كوا جراحيا المستحث بشكل حيوي في فيفو نظام التصوير. نحن العاملين في محبتين كاربوسيانينيس هل (ديلك18 (5))، النظير ديل (ديالكيلكاربوسيانينيس) استعملنا فلورسنت، والتي تستخدم ليزر أحمر لتجنب إثارة أوتوفلوريسسينسي الخضراء الطبيعية من الأنسجة المحيطة. وعلاوة على ذلك، يسمح أطياف الانبعاث تحول الأحمر لتصوير الأنسجة العميقة في الحيوانات الحية وإجراءات وضع العلامات ولم تتسبب الآثار السامة للخلايا أو الأضرار الوظيفية إلى هامسكس. هذا النهج قد ثبت أن أسلوب تعقب تتسم بكفاءة هامسكس في نموذج كوا الفئران. كما يمكن تطبيق هذا الأسلوب لتحديد مسار الإدارة المثلى وجرعة MSCs من مصادر أخرى في الدراسات ما قبل السريرية.
Introduction
فصال الركبة (كوا) هو اضطراب التنكسية الناتجة عن فقدان الغضروف المفصلي والتهاب التدريجي، الذي أصبح أمراض مزمنة رئيسية لدى كبار السن في جميع أنحاء العالم1. ومع ذلك، قد فقط توفر العلاجات الحالية باستخدام العقاقير المضادة للالتهابات، والمكملات الغذائية المادية، والعمليات الجراحية الإغاثة المؤقتة للأعراض الألم2.
وأصبحت البشرية المستمدة من الدهنية الخلايا الجذعية الوسيطة (هامسكس) علاج التجدد واعدة لهشاشة العظام الركبة، سبب عن التمايز multipotent المحتملة لتجديد الغضاريف و خصائص إيمونومودولاتوري3، 4. بالمقارنة مع الطرق الدوائية للتحقيق وآليات للعمل في فيفو، تتبع هامسكس يعيش في نماذج حيوانية كوا الصغيرة حاليا من المفيد أن تضع مبررات وجدوى العلاج هامسك قبل التطبيق السريري. للتجارب الإكلينيكية، يزعزع مينيسسيكتومي الآنسي (مم) تحميل الميكانيكية المشتركة لحمل كوا في الفئران، الذي يقدم نموذجا عمليا نسبيا مع إمكانية تكرار نتائج متسقة5. بداية كوا الناجم عن مم أقدم من الرباط الصليبي الأمامي ترانسيكشن منفردة أو مجتمعة مع مينيسسيكتومي الآنسي الجزئي6. ولذلك، غالباً ما يتم تقييم التفاعلات طويلة الأجل بين هامسكس حقن مع المكروية المرضية من كوا في الفئران التي تسببها ملم7،8.
على الرغم من الفعالية العلاجية من هامسكس كانت المعارف ذات الصلة المبلغ عنها على نطاق واسع، وعلى استمرار في فيفو هامسكس مزروع عن طريق الحقن (IA) داخل المفصل هو ندرة9،10. ومن ثم، مختلف أساليب وصفها الخلوية وقد وضعت، بما في ذلك إيمونوهيستولوجي11، لوسيفراس12،13 بروتين فلوري أخضر تعداء، أكسيد الحديد وسم للتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)14 ، و عديدة الخلية الفلورية الأصباغ،8،15،16. بالمقارنة مع تحاليل الأنسجة كثيفة العمالة، توظف في فيفو تصوير غير الغازية الأجهزة البصرية للكشف عن التوزيع في الوقت الحقيقي، وديناميات الخلايا المسماة بإشارات الفلورسنت10،17. لتصوير الخلية الحية الوظيفية، وضع العلامات الفلورية سيتوكومباتيبلي تقنية متطورة تتبع خالية من المشعة للكشف عن الأنشطة الخلوية بعد زرع الخلايا الجذعية18. وعلاوة على ذلك، تمتلك متعدد الألوان الفلورية الأصباغ محبتين مزايا أكثر من الأصباغ ماء الأمينية المتفاعلة أو البروتينات الفلورية، نفاذية الخلية المحسنة والأسفار المحسن الكم غلة19.
وهكذا، تستخدم البروتوكولات المضمنة هنا حمراء ليزر لإثارة الخلايا المسماة محبتين كاربوسيانينيس فعل (ديلك18(5))، وهو استعملنا فلورسنت ديل (ديالكيلكاربوسيانينيس) تناظرية20. يتجنب التدخل أوتوفلوريسسينت الأطياف الإثارة والانبعاثات تحول الأحمر من ويسمح التصوير على مدى فترة طويلة من الزمن في الحيوانات الحية8الأنسجة العميقة. هذا الأسلوب لتتبع الخلايا في الجسم الحي المسمى بهل صالحة للرصد زرع الخلايا الجذعية، مثل هامسكس، في نماذج حيوانية، هو أمر أساسي لفهم وتحسين العلاج التجديدي الخلايا الجذعية الحالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق برعاية الحيوان المؤسسية المحلية ولجنة الأخلاقيات، الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان مع محاولة لتقليل معاناة الحيوانات. وأقر البروتوكول التالية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في "شانغهاي التاسعة والناس" ’ s المستشفى التابعة "جامعة شانغهاي جياوتونغ كلية الطب" مع البروتوكول رقم [2017] 063.
1-إنشاء "نموذج فصال الركبة الفئران سورجيكالييندوسيد"
- لهذا الإجراء الجراحي، استخدام 8-12 أسبوع القديمة ذكور الفئران سبراغ داولي (SD) بوزن جسم بين 250 و 300 غ.
- تخدير الحيوانات مع تيليتاميني 40 مغ/كغ وزولازيبام 40 مغ/كغ عن طريق الحقن العضلي. ضع
- الحيوان في وضع جانبي الأيسر في مرحلة ساخنة. يحلق في الركبة اليمنى تماما مع الشفرة. تطهير منطقة الجراحي مع الحل بروفيدوني-اليود 10% تليها الإيثانول 70% وكرر مرتين أخريين وثم الطلاء باستخدام 10% محلول اليود بروفيدوني وتغطي المنطقة غير الجراحية مع لوحة جراحية.
- باستخدام مشرط جراحة، جعل شق 2 سم أفقياً على طول وتر الرضفة للكشف جوينتكابسوليس-
- استخدام مشرط جراحة إلى قطاع في الرباط الآنسي الجانبية. تعكس غضروف نحو عظم الفخذ.
- بالتنقيط الحل كلوريد الصوديوم 0.9% العقيمة على سطح الغضروف المفصلي أثناء العملية لمنع جفاف الغضروف.
- انتزاع غضروف الآنسي مع الملقط وقطع طريق غضروف في أضيق نقطة من المرفق قصبي مع مشرط ( الشكل 1A). تجنب إصابة الغضروف.
- إغلاق الكبسولة المشتركة مع خياطة امتصاص 4-0-
- مراقبة الفئران الجراحية حتى أنهم يستعيد وعيه.
- حقن الجنتاميسين 20 مغ/كغ لمنع العدوى والبوبرينورفين 0.05 مغ/كغ عن طريق عن طريق العضل لتخفيف الألم بعد الجراحة-
- الحفاظ على الفئران في منشأة حيوان للتحكم في درجة الحرارة تحت دورة ضوء/الظلام ح 12 3-8 أسابيع لظهور كوا. الحيوانات لا تزال تلقي علاج الألم، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر البوبرينورفين (0.05 مغ/كغ، الدردشة) والجنتاميسين (20 مغ/كغ، الدردشة)، إذا استمرت الأعراض الألم.
2. نموذج كوا على تقييم علم الأنسجة من الفئران
- التضحية الفئران مع استنشاق 2 CO المفرط (إضافة بمعدل حوالي 30% حجم الدائرة في الدقيقة مع ثاني أكسيد الكربون في الهواء الموجودة في الدائرة تعبئة لجعل اللاوعي الحيوان ضمن 2-3 دقيقة تدفق CO2 الحفاظ على الحد الأدنى من 1 دقيقة بعد التنفس يتوقف.) في الإشارة إلى النقاط الزمنية (الممثل وترد النتائج في 8 أسابيع تحريض كوا تتراوح من 3 إلى 8 أسابيع) بعد الجراحة.
- تشريح الجلد والعضلات حول المفاصل الركبة وقطع مفاصل الركبة مع مشرط. فيكس
- مفاصل الركبة في بارافورمالدهيد 4% (PFA) لمدة 3 أيام في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، ديكالسيفي العينات في 20% حمض الإيثيلين (يدتا) لمدة حوالي 4 أسابيع في 4 درجات مئوية، وتغيير يدتا كل 3 أيام-
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية)، مثل القفازات والنظارات الطبية- - يذوي العينات باستخدام معالج أنسجة تلقائي. تعيين القائمة لبدء دورة تدفق على النحو التالي: 70% إيثانول ح 1؛ ثم الإيثانول 80% والإيثانول 95% ح 1 على التوالي؛ تليها 2 دورات من الإيثانول 100% ح 1؛ وفي وقت لاحق، في كل مرة زيلين نفط مرتين ح 1 والبارافين 3 مرات في 58 درجة مئوية ح 1 في كل مرة.
تنبيه: زيلين نفط السامة، حتى ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، مثل القفازات والنظارات الطبية-
ملاحظة: يمكنك بشكل اختياري استخدام "الجرار كوبلين" للجفاف اليدوي مع إنشاء نفس المعالج التلقائي الأنسجة. - وضع الجانب الآنسي لمواجهة مشتركة سليمة لأسفل، وتضمين ذلك في كتلة البارافين مع الأنسجة المضمنة داخل المركز.
ملاحظة: بشكل اختياري، استخدام الملقط لتضمين هذه العينات إلى كتلة البارافين يدوياً. - البدء بخفض 5 ميكرومتر المقاطع السهمي من الهامش الآنسي المشترك لفترات ميكرومتر 30 مع مقاطع المسلسل 2 مبضع الروتاري. تحميل المقاطع على الشرائح الزجاجية
- وديبارافينيزي الشرائح في زيلين نفط. بين الفروع التسلسلي 2، وصمة عار شريحة واحدة مع الهيماتوكسيلين & ويوزين (ح & ه) تلطيخ: 0.1% توضع لمدة 15 دقيقة، 1% "حل حامض الخليك" 10 s و 0.5 في المائة ثم لمدة 10 دقائق. ووصمة عار شريحة أخرى مع "الأخضر" س/الصوم Safranin تلطيخ: 0.1% توضع لمدة 15 دقيقة، 0.02% الأخضر سريع لمدة دقيقة 3، 1% "حمض الخليك الحل" 10 s و 0.1% Safranin O للحد الأدنى 3
تنبيه: زيلين نفط السامة، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، مثل القفازات، ونظارات. - نقاط الملون الشرائح باستخدام "نظام تقييم التشريح المرضى هشاشة العظام بحث المجتمع الدولي" (أوارسي) في الفئران 6-
3. وضع العلامات "البشرية الخلايا الجذعية الوسيطة" مع "صبغة الفلورسنت ولم"
- "ولم تعد" الحل وسم الخلية في 100 ٪ الإيثانول بتركيز 1 مم. حماية الحل وسم الخلية من الضوء وتخزينه في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 شهور-
- تنمو هامسكس مع إجراءات ثقافة الخلية القياسية في دولبيكو ' s تعديل النسر ' s المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 1% البنسلين وستربتوميسين و 10% العجل الجنين المصل (FCS) في طبق بتري 10 سم.
- فصل هامسكس مع التربسين 0.25% 2 مل مع التقاء السابقة إلى حوالي 80% يدتا 1 مم-
- تحييد التربسين مع 4 مل الثقافة المتوسطة وتدور الخلايا في 800 x ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- تعليق الخلايا في كثافة 1 × 10 6 خلايا/مل في المتوسطة ثقافة خالية من المصل 5 مل.
- تسمية الخلايا بإضافة 50 ميليلتر هل الحل وسم الخلية في 5 مل خالية من المصل المتوسطة الثقافة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 50
- تدور الخلايا المسماة في 800 x ز للحد الأدنى 3
- تغسل الخلايا اثنين مرات أكثر مع 5 مل الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS) في ز 800 x لكل 3 دقائق.
- التحقق من هامسكس المسمى باستخدام مجهر فلوري مع تعيين عامل تصفية Cy5.
- عد الخلايا مع تلطيخ تريبان الأزرق والحصول على 2.5 × 10 6 خلايا قابلة للاستمرار في برنامج تلفزيوني ميليلتر 100 لحقن.
4. في فيفو الفلورسنت التصوير إلى المسار هامسكس
- ثمانية أسابيع بعد الجراحة (الخطوة 1)، تخدير الفئران كوا بالحقن العضلي تيليتاميني 25 ملغ/كغ وزولازيبام 25 ملغ/كغ-
- يحلق الركبة اليمنى تماما مع الشفرة لفضح المنطقة المشتركة. تطهير المنطقة المشتركة مع الإيثانول 70%-
- باستخدام إبرة حقنه ز 26، ضخ 2.5 × 10 6 المسمى خلايا معلقة في برنامج تلفزيوني ميليلتر 100 في وسط منطقة المثلث تشكل إلى جانب أربطة الرضفة واللقمة فخذي الآنسي (اللقمة ظنبوبي الآنسي الآنسي الشكل 1B).
- فتح برامج التصوير وتهيئة في فيفو الإضاءة الحيوية نظام التصوير-
- موقف الفئران في تارة موقف في المرحلة الوسطى من نظام التصوير وإغلاق باب الغرفة.
- التحقق من " نيون " خانة الاختيار وحدد عامل تصفية الفلورسنت مجموعات من 640 نانومتر للإثارة، و 680 نانومتر للانبعاثات ( الشكل 2A).
- تحديد مجال الرؤية "مجموعة دال" binning بكسل للمتوسطة (8)، الوقت و/إيقاف 2 والتعرض للسيارات. الاحتفاظ الأمثل زمن التعرض متسقة للحصول على نتائج قابلة للمقارنة عبر الدراسة بأكملها ( الشكل 2A).
- إزالة الحيوان من المرحلة ورصد للتعافي من التخدير.
ملاحظة: مكان الحيوان على منصة تدفئة مغطاة بطبقات 2-3 من توويلينج- - اختيار الوحدات متألق الكفاءة لقياس الفلورية ( الشكل 2). تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) لتحليل وقياس الإشارات الفلورسنت من كل صورة ( الشكل 2).
- كرر الإجراء في فيفو التصوير لكل فأر تسلسلياً لدراسة الاحتفاظ هامسكس طولية في المشترك-
ملاحظة: نقترح تصوير الحيوانات ' نيون إشارات المجراة في نظام التصوير مرة كل يومين في الأسبوع الأول بعد الحقن ومرة كل أسبوع حتى لا يتم الكشف عن الإشارة-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل حمل نموذج كوا، أنجز ملم في الركبة اليمنى من الفئران SD (الشكل 3). ثمانية أسابيع بعد الجراحة، وضحى بها الفئران وجرى تقييم مقاطع المسلسل من مفاصل الركبة مع كلا ح & ه والأخضر س/الصوم Safranin تلطيخ (الشكل 4). ح & ه تلطيخ، سطح الغضروف المفصلي أظهرت حدود أخشن في الركبتين جراحة من المشترك العادي دون جراحة. لتلطيخ الأخضر Safranin-س/سريع، لوحظ انخفاض بروتيوغليكان (صبغة حمراء) وزيادة فيبريلاتيد الكولاجين (صبغة خضراء) في مجال الجراحة المشتركة مقارنة مع واحد عادي، مما يدل على تطور الأمراض التنكسية كوا تعمل الناجمة عن عملية جراحية. تشبه تطور البشرية كوا، ضحى الفئران في 3 أسابيع, 6 أسابيع، و 8 أسابيع بعد مم لتقييم الآلية المرضية وتحديد الوقت للتدخلات العلاجية.
المسمى هامسكس كانت تصور في نموذج فأر كوا قبل أداة بصرية في فيفو نظام التصوير. المسمى ح 1 بعد وضع العلامات، هامسكس أظهرت جولة الأشكال في المختبر. كفاءة التوسيم بلغت حوالي 95%. بعد 24 ساعة، مثقف هل هامسكس المسمى معارضها الأشكال المغزل طويلة، مما يشير إلى هل عدم تغيير قدرة الانضمام هامسكس في المختبر (الشكل 5). ثمانية أسابيع بعد الجراحة، 2.5 × 106 المسمى ولم هامسكس تم حقن المفاصل مع كوا. وهنا، المسمى هامسكس وقد لوحظت في المشترك المحلي من اليوم 0 (8 أسابيع بعد الجراحة) حتى اليوم 70 وظيفة حقن (18 أسبوعا بعد الجراحة) باستخدام في فيفو التصوير النظام (الشكل 6).
رقم 1: الحقل الجراحي التخطيطي لمنطقة الجراحة وحقن ملم لتوصيل الخلية. (أ) يصور هذا الرسم التخطيطي في مجال الجراحة، الذي هو أبرز باللون الأزرق. (ب) يشير هذا الرسم التخطيطي إلى الحقن داخل منطقة حلق أحمر. تعريفات اختصار كما يلي: مم، غضروف الآنسي؛ MCL، الرباط الآنسي الجانبية؛ LM، غضروف الأفقي؛ LCL، أربطة جانبية الأفقي؛ رر، أربطة الرضفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: لقطات برامج التصوير المجراة في الشاشة- (أ) يتم تمييز الإعدادات مفتاح معلمات للحصول على الصور الفلورسنت مع مربعات حمراء. (ب) يتم اختيار الكفاءة إشعاعاً كوحدة لقياس الأسفار. (ج) يتم تحليقا "في لوحة أداة"، المناطق ذات الاهتمام (ROI) لقياسات الكفاءة الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إجراءات كوا المستحثة جراحيا. (أ) التعرض لمساحة مشتركة الركبة. (ب) البنية الداخلية للركبة، مع سهم أسود يشير إلى غضروف الآنسي. (ج) غضروف تشريح الآنسي. (د) يتم إغلاق مساحة مشتركة والجلد.
الشكل 4: صور النسيجي الممثل مفاصل الركبة والتحليل الإحصائي لدرجة أوارسي من كوا. (أ) ثمانية أسابيع بعد الجراحة ملم في الفئران، وجرى تقييم مقاطع المسلسل من مفاصل الركبة مع ح & ه والأخضر س/الصوم Safranin تلطيخ. ح & ه تلطيخ أظهرت انخفض سمك الغضروف في الركبة جراحة. Safranin "الأخضر" س/سريع تلطيخ أظهرت انخفضت بروتيوغليكان (صبغة حمراء) وزيادة الكولاجين فيبريلاتيد (صبغة خضراء) في الركبة الجراحة مقارنة مع الركبة طبيعية. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) التحليل الإحصائي لدرجة هشاشة العظام في المفاصل العادي والمفاصل كوا (n = 3). البيانات يتم التعبير عنها ك mean±SEM. * يشير إلى ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: مورفولوجية ولم-المسمى هامسكس- حقل مشرقة، تظهر الصور الفلورية والمدمجة هامسكس في ح 1 بعد وضع العلامات في أعلى اللوحة. حقل مشرق، فلوريسسينتاند دمج الصور من هامسكس at24 ح بعد وضع العلامات وتظهر في اللوحة السفلية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: في فيفو تصوير للمسمى ولم هامسكس- بعد حقن 2.5 × 106 المسمى هامسكس، تظهر الصور التمثيلية للفئران كوا. هل تم اكتشاف المسمى هامسكس ليصل إلى 9 أسابيع محلياً في مفاصل كوا الفئران. وهذا الرقم وقد استنسخ من نشر م لي وآخرون8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معايير السلامة والدراسات بيوديستريبوشن للعلاج بالخلايا الجذعية هناك حاجة ماسة قبل أن يمكن أن نأتي علاج الخلايا الجذعية التجدد كوا من على مقاعد البدلاء للسرير. ومع ذلك، البيئة المرضية للمرض دوراً هاما في استمرار وبيوديستريبوشن من هامسكس زرع10. في الآونة الأخيرة، أثبتت مجموعتنا أن الحقن داخل المفصل من هامسكس استمرت أطول في بيئة كوا مرضية من فعل الحقن تحت الظروف العادية8. فمن الممكن أن المكروية الالتهابات والأمراض التنكسية قد تجند الخلايا الجذعية الوسيطة لإصلاح ولاحقا يفضلون الاحتفاظ بحقن هامسكس1،21. وعلاوة على ذلك، لمحات سلامة وفعالية من هامسكس قد يتأثر بتوقيت إنجاز خلية فيما يتعلق بشدة كوا، حيث أن الاستغلال الأمثل لتطور كوا في الحيوانات المختبرية سيوفر بيانات قيمة لدعم التجارب السريرية. بهدف تشبه خفيفة إلى معتدلة شدة كوا البشرية، والفئران التي تسببها مم يسمح لتطوير كوا تتراوح من 3 إلى 8 أسابيع. في هذه الدراسة، تم تقييم التغيير المورفولوجي الغضروف قبل نسيجية التهديف 8 أسابيع بعد الجراحة، والذي يقدم نموذجا عمليا نسبيا بدرجة معتدلة من كوا للتحقيق في مدى فعالية وسلامة هامسكس8. وقد دللنا هنا طريقة بسيطة ومجدية لتسمية هامسكس مع صبغ الغشاء محبتين الفلورسنت استعملنا لتقييم نجاعة ما قبل السريرية الطويلة الأجل.
عيوب هذا الأسلوب هي أن الأنسجة المصورة وينبغي أن يكون بالقرب من الجلد، وكمية كبيرة من هامسكس المسمى مطلوبة من أجل اقتناء إشارة كافية بسبب محصول كمية متواضعة من هل. على الرغم من تمكن في فيفو تصوير نظام بصري الدراسات الطولية غير الغازية من هامسكس بيوديستريبوشن في كوا النماذج والاتجاهات في عدد الخلايا ويمكن فقط تمييز الموقع بشكل عام. تحليل مصير الخلايا الجذعية، في انتشار الخلايا خاصة والتمايز، ستعالج أيضا الاستفادة من مصير رسم الخرائط والتصوير المجهري عالية الدقة.
حاليا، تتوفر مجموعة واسعة من تقنيات الوسم في فيفو تتبع الخلايا الجذعية، بما في ذلك التسميات المشعة والجسيمات النانوية وتوصيل الفيروسية لمراسل الجينات22،23،24. ومع ذلك، وضع العلامات المشعة فضلا عن توصيل فيروسي للخلايا الجذعية قد تتداخل مع الخصائص الوراثية للخلايا، مما قد يؤثر في وقت لاحق الجذعية خلية الانتشار والبقاء على قيد الحياة في فيفو16. وعلاوة على ذلك، تتبع الخلايا الجذعية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي بالاقبال على جسيمات نانوية كعامل العقد يتطلب تحسين الاستبانة المكانية عبر حقل مغناطيسي قوي، مما قد يثير شواغل بشأن حساسية هذا الأسلوب25. خلية الفلورية الأصباغ، PKH26، دي سم وكفسي يحمل سيتوتوكسيسيتي بدرجات متفاوتة، وتوفر مدة محدودة نسبيا (تصل إلى 4 أسابيع) لتصنيف الأنسجة الدهنية المستمدة من الخلايا15. وفي المقابل، يسلك fluorescence ضعيفة في المحاليل. عندما تدمج مع غشاء دهن، ينشر صورة موحدة داخل غشاء الخلية والأسفار استعملنا التعبير عن مستقرة19. لم تسميات خلايا قابلة للحياة وتؤثر على انتشار هذه الأسلحة وتعمل18. الأهم من ذلك، الأصباغ لا نقل من الخلايا المسماة بالخلايا غير مسمى ما لم يكن هناك تفاعل مباشر غشاء بين تلك الخلايا26. استعملنا الإثارة وأطياف الانبعاث من يمنع التدخل أوتوفلوريسسينت من الأنسجة المحيطة بها ويقدم تصوير الأنسجة العميقة في الحيوانات الحية. تمكنك هذه الميزات من فعل وسم كأسلوب تعقب طويلة الأجل مثالية لدراسة مصير هامسكس مزروع داخل واستقﻻلهم. لذلك، وقد أثبتنا موثوقة منهجية لرصد هل المسمى هامسكس على مدى فترة من 63 يوما في نموذج الفئران8.
ضمن بروتوكول هامسكس المسمى ولم تتبع في نموذج فأر كوا، خطوات حاسمة للحصول على نتائج موثوقة ومجدية التأكد من أن: 1) غضروف نحو عظم الفخذ تماما قطع طريق في كل نموذج الفئران ليتمشى بداية كوا، 2) هناك صبغ نسبة 10 ميكروليتر أمثل ضد خلايا هامسك6 10 50 دقيقة تلطيخ، 3) عتبة الكشف في فيفو للمسمى ولم هامسكس ما بين 104 و 105 الخلايا، بينما يوصي بأعلاه 106 خلايا في هذا البروتوكول.
عندما يتقن هذه التقنية، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لتحديد الطريق الأمثل أو الجرعة لإدارة MSCs في الدراسات ما قبل السريرية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لتقييم ما قبل السريرية الطويلة الأجل في فيفو بيوديستريبوشن الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) من مصادر أخرى، بما في ذلك الدم نخاع العظام والحبل السري. ضوء المحتملين لمصير الخلايا الجذعية في نماذج حيوانية كوا، دراسة إيمونوهيستولوجي هامسكس إكسينوجينيك، مثل Ki67 لانتشار8 والكولاجين الثاني ل التمايز غضروف مفصلي27، يمكن أن يقترن هذا تقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لي مينغ وهاو مينغ وانغ ون هي الموظفين الحاليين وأصحاب الأسهم الخيار الخلوية الطب الأحيائي مجموعة (ناسداك: كبمج). أن تعلن مؤلفين آخرين لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة الحالية "شانغهاي تمويل الابتكار" (1402 ه 294300) برعاية العلوم والتكنولوجيا اللجنة من شانغهاي بلدية (CN) للدكتور وانغ ون. ونود أن نشكر "الدكتور قوانغدونغ تشو" (الوطنية الأنسجة الهندسة مركز الصين) لتقديم المساعدة التقنية والمشورة العلمية لهذه المخطوطة. كما نود أن نشكر السيد هويتانج شيا (مستشفى شانغهاي التاسعة الشعبية) لمساعدته في رعاية الحيوان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin,, et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
