Summary
Questo protocollo descrive un modo efficiente per monitorare la persistenza delle cellule e la biodistribuzione di adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) di fluorescenza da' etichettatura in un modello di osteoartrite (KOA) del ginocchio di ratto tramite iniezione intra-articolare (IA).
Abstract
Per supportare l'applicazione clinica della terapia umana adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali (haMSC) per l'osteoartrite del ginocchio (KOA), abbiamo esaminato l'efficacia di persistenza delle cellule e biodistribuzione di haMSCs nei modelli animali. Abbiamo dimostrato un metodo per assegnare un'etichetta della membrana cellulare di haMSCs con colorante fluorescente lipofilico. Successivamente, iniezione intra-articolare delle cellule con etichettate in ratti con KOA chirurgicamente indotta è stata monitorata in modo dinamico da un in vivo imaging system. Abbiamo impiegato il lipofilico carbocyanines fatto (DilC18 (5)), un analogo fluorescente da' di Dil (dialkylcarbocyanines), che utilizzato un laser rosso per evitare l'eccitazione del autofluorescence verde naturale dai tessuti circostanti. Inoltre, lo spettro di emissione rosso-spostato di permesso deep tissue imaging negli animali vivi e la procedura di etichettatura non causato nessun effetti citotossici o danno funzionale a haMSCs. Questo approccio ha dimostrato di essere un metodo di verifica efficiente per haMSCs in un modello di ratto KOA. L'applicazione di questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per determinare la via di somministrazione ottimale ed il dosaggio delle MSC da altre fonti in studi pre-clinici.
Introduction
Osteoartrite del ginocchio (KOA) è un disordine degenerante derivanti dalla perdita di cartilagine articolare e l'infiammazione progressiva, che è diventata una malattia cronica importante negli anziani intorno al mondo1. Tuttavia, le attuali terapie con farmaci anti-infiammatori, integratori fisici e procedure chirurgiche possono fornire solo un sollievo temporaneo per dolore sintomatico2.
Adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) sono diventati un rimedio rigenerativo promettente per l'osteoartrite del ginocchio, a causa della loro differenziazione multipotenti potenziale per la rigenerazione della cartilagine e immunomodulatori proprietà3, 4. Rispetto ai percorsi farmacologici per studiare i meccanismi di azione in vivo, tracking live haMSCs in modelli animali di piccole dimensioni KOA è attualmente istruttivo per stabilire la spiegazione razionale per e la fattibilità della terapia haMSC prima applicazione clinica. Per i test preclinici, meniscectomia mediale (MM) destabilizza il carico meccanico del giunto per indurre KOA in ratti, che fornisce un modello relativamente fattibile con riproducibilità costante5. L'insorgenza di KOA indotta da MM è antecedente il transection del legamento crociato anteriore da solo o combinato con parziale meniscectomia mediale6. Pertanto, le interazioni a lungo termine tra haMSCs iniettato con il microambiente patologico di KOA sono spesso valutate in ratti indotti da MM7,8.
Anche se l'efficacia terapeutica di haMSCs è stato ampiamente riferita, pertinenti conoscenze sulla persistenza in vivo di haMSCs impiantato tramite iniezione intra-articolare (IA) è scarsa9,10. Quindi, sono stati sviluppati vari metodi di etichettatura cellulare, tra cui immunohistology11, luciferasi12, trasfezione13 proteina fluorescente verde, ossido di ferro di etichettatura per imaging a risonanza magnetica (MRI)14 e numerose cellule fluorescenti coloranti8,15,16. Confrontato con analisi di istologia laborioso, in vivo imaging non-invasivo si avvale di dispositivi ottici per rilevare la distribuzione in tempo reale e dinamica delle cellule identificate con segnali fluorescenti10,17. Per l'imaging funzionale di cellule vive, citocompatibili Contrassegno fluorescente è una tecnica di sofisticato monitoraggio radioattivo senza rivelare attività cellulari dopo trapianto di cellule staminali18. Inoltre, multicolore tinture fluorescenti lipofili possiedono vantaggi rispetto ai coloranti idrofiliche ammino-reattivi o proteine fluorescenti, compresi i loro permeabilità cellulare migliorata e rafforzata fluorescenza quantistica rendimenti19.
Così, i protocolli inclusi qui utilizzano un rosso laser per eccitare le cellule identificate con lipofilico carbocyanines fatto (DilC18(5)), che è un da' fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analogico20. Gli spettri rosso-spostato di eccitazione e di emissione di evita interferenze autofluorescent e permette deep tissue imaging per un lungo periodo di tempo in animali vivi8. Questo metodo di rilevamento delle cellule in vivo etichettato con fatto è valido per il monitoraggio cellule staminali trapiantate, come haMSCs, in modelli animali, che è essenziale per capire e migliorare l'attuale terapia rigenerativa con cellule staminali.
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Protocol
procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di etica e locali istituzionali Animal Care con uno sforzo per ridurre al minimo la sofferenza animale. Il seguente protocollo è stato approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) a Shanghai Ninth People ’ s ospedale affiliato a Shanghai JiaoTong University School of Medicine con il protocollo numero [2017] 063.
1. istituzione di un modello di osteoartrite del ginocchio del ratto Surgically-Induced
- per questa procedura chirurgica, uso 8-12 settimana vecchi ratti Sprague Dawley (deviazione standard) con un peso corporeo tra 250 e 300 g.
- Anestetizzare gli animali con 40 mg/kg tiletamina e zolazepam 40mg/kg tramite iniezione intramuscolare.
- Metti l'animale in posizione laterale sinistra su un piatto riscaldato. Shave accuratamente il ginocchio destro con un rasoio. Disinfettare l'area chirurgica con soluzione di providone-iodio 10% seguita da etanolo al 70%, ripetere altre due volte e poi dipingere con soluzione di 10% providone-iodio e coprire l'area non chirurgica con un tampone chirurgico.
- Usando un bisturi chirurgico, praticare un'incisione di 2 cm lateralmente lungo il tendine rotuleo per esporre il jointcapsules.
- Utilizzare un bisturi chirurgico per recidere il legamento collaterale mediale. Riflettere il menisco verso il femore.
- Gocciolare soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% sulla superficie della cartilagine articolare durante il funzionamento per evitare che la cartilagine dall'asciugarsi.
- Afferrare il menisco mediale con il forcipe e tagliare attraverso il menisco al suo punto più stretto dal pignoramento tibial con un bisturi ( Figura 1A). Evitare di ferire la cartilagine.
- Chiudere la capsula articolare con un suturare assorbibile 4-0.
- Monitorare i ratti chirurgici fino a quando non riacquistano coscienza.
- Iniettare 20 mg/kg di gentamicina per prevenire l'infezione e buprenorfina 0,05 mg/kg attraverso un itinerario intramuscolare per alleviare il dolore dopo l'intervento chirurgico.
- Mantenere i ratti in una struttura animale temperatura controllata sotto un ciclo di luce/buio di 12 h per 3-8 settimane all'insorgenza KOA. Gli animali continuano a ricevere il farmaco di dolore, compreso ma non limitato a buprenorfina (0,05 mg/kg, i.m.) e gentamicina (20 mg/kg, i.m.), se persistono i sintomi di dolore.
2. Valutazione di istologia del ratto KOA modello
- sacrificare i ratti con eccessiva CO 2 inalazione (Aggiungi un tasso di riempimento di circa il 30% del volume camera al minuto con l'anidride carbonica dell'aria esistente nella camera per rendere l'incoscienza animale entro 2-3 min flusso di CO2 di mantenere per un minimo di 1 min dopo respirazione cessa.) al indicato punti temporali (rappresentante risultati sono mostrati a 8 settimane di induzione di KOA che vanno da 3 a 8 settimane) dopo la chirurgia.
- sezionare la pelle e i muscoli intorno alle articolazioni di ginocchio e tagliare i giunti del ginocchio con un bisturi.
- Fissare i giunti di ginocchio in paraformaldeide al 4% (PFA) per 3 giorni a temperatura ambiente. In seguito, decalcificare i campioni in 20% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per circa 4 settimane a 4 ° C e cambiare l'EDTA ogni 3 giorni.
Attenzione: Paraformaldeide è tossico, indossare adeguati dispositivi di protezione personale (PPE), come guanti e occhiali da vista. - Disidratare i campioni utilizzando un processatore automatico. Impostare il menu per avviare un ciclo di risciacquo come segue: etanolo al 70% per 1 h; quindi 80% etanolo ed etanolo al 95% per 1 h rispettivamente; seguita da 2 cicli di etanolo al 100% per 1 h; Successivamente, xilene due volte per 1 h ogni volta e ogni volta di paraffina 3 volte a 58 ° C per 1 h.
Attenzione: Xilene è tossico, quindi indossate PPE appropriato, come guanti e occhiali da vista.
Nota: Facoltativamente, utilizzare vasi di Coplin per disidratazione manuale con la stessa impostazione come il processatore automatico. - Posare la funzione mediale della faccia comune intatta e incorporarlo nel blocco paraffina con tessuto incastonato nel centro.
Nota: Facoltativamente, utilizzare pinze per incorporare i campioni il blocco di paraffina manualmente. - Iniziare a tagliare 5 sezioni sagittali µm dal margine mediale del giunto per intervalli di 30 µm con 2 sezioni seriali di microtomo rotativo.
- Montare profili sulle lastre di vetro e deparaffinizzare le diapositive in xilene. Tra le 2 sezioni seriali, macchiare una diapositiva con ematossilina & eosina (H & E) colorazione: 0,1% ematossilina per 15 min, 1% soluzione di acido acetico per 10 s e 0,5% eosina per 10 min. E macchia l'altra diapositiva con safranina O/Fast Green colorazione: 0,1% ematossilina per 15 min, 0,02% Fast Green per 3 min., 1% soluzione di acido acetico per 10 s e 0,1% O di safranina per 3 min.
Attenzione: Xilene è tossico, indossare i dpi appropriati, come guanti, occhiali da vista. - Punteggio ottenuto i vetrini colorati utilizzando il sistema di valutazione istopatologia di osteoartrite Research Society International (OARSI) in ratti 6.
3. Etichettatura di cellule staminali mesenchimali umane con la tintura fluorescente, ha fatto
- preparare fatto d'etichettatura delle cellule soluzione in etanolo al 100% ad una concentrazione di 1 mM. Proteggere la soluzione d'etichettatura delle cellule dalla luce e conservare a temperatura ambiente per 6 mesi.
- Crescere haMSCs con procedure di cultura cella standard in Dulbecco ' s modificato Eagle ' medium s (DMEM) completato con siero di vitello fetale penicillina e streptomicina e 10% 1% (FCS) in una capsula Petri 10cm.
- Staccare haMSCs con tripsina 0,25% 2ml con confluenza prima circa l'80% di 1 mM EDTA.
- Neutralizzare la tripsina con 4 mL di terreno di coltura e girare le cellule a 800 x g per 3 min a temperatura ambiente.
- Sospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 6 cellule/mL nel mezzo di coltura privo di siero 5ml.
- Etichetta le cellule aggiungendo 50 µ l fatto soluzione d'etichettatura delle cellule nel mezzo di coltura privo di siero da 5 mL a 37 ° C per 50 min.
- Girare le cellule con etichettate a 800 x g per 3 min.
- Lavare le cellule due volte con 5 mL Tampone fosfato (PBS) a 800 x g per 3 minuti ciascuno,.
- Verifica la haMSCs etichettati utilizzando un microscopio a fluorescenza con un set di filtri Cy5.
- Contare le celle con la macchiatura blu di trypan e ottenere 2.5 x 10 6 cellule vitali in 100 µ l PBS iniettabile.
4. In Vivo Fluorescente Imaging per pista haMSCs
- otto settimane dopo l'intervento chirurgico (passaggio 1), anestetizzare i ratti KOA mediante iniezione intramuscolare di 25 mg/kg tiletamina e zolazepam 25 mg/kg.
- Radere accuratamente il ginocchio destro con un rasoio per esporre l'area del giunto. Disinfettare la zona comune con etanolo al 70%.
- Utilizzando un ago di siringa 26 G, iniettare 2,5 x 10 6 etichettati cellule sospese in 100 µ l PBS al centro della zona del triangolo formato dal lato mediale del legamento patellar, il condilo femorale mediale e del condilo tibiale mediale ( Figura 1B).
- Aprire il software di imaging e inizializzare la bioluminescenza in vivo imaging system.
- Posizione ratti nella posizione supina posizione nella fase centrale del sistema di imaging e chiudere la porta della camera.
- Verifica la " fluorescente " casella di controllo e seleziona Filtro fluorescente imposta di 640 nm per l'eccitazione e 680 nm per emissione ( Figura 2A).
- Selezionare campo di vista a D. impostare Pixelbinning su medio (8), F/Stop per esposizione e 2 ora di auto. Mantenere l'ottimale tempo di esposizione coerenza per ottenere risultati comparabili tra l'intero studio ( Figura 2A).
- Rimuovere l'animale dal palco e monitor per il recupero dall'anestesia.
Nota: Animale posto su un rilievo di riscaldamento coperto con 2-3 strati di spugna. - Scegliete le unità di efficienza radiante per la misura della fluorescenza ( Figura 2B). Selezionare le regioni di interesse (ROI) per l'analisi e quantificare i segnali fluorescenti da ogni immagine ( Figura 2).
- Ripetere la procedura di imaging in vivo per ogni ratto in sequenza studiare haMSCs ritenzione longitudinale nel giunto.
Nota: Consigliamo di imaging gli animali ' segnali fluorescenti da sistema di imaging in vivo una volta ogni due giorni per la prima settimana dopo l'iniezione e una volta ogni settimana fino a quando il segnale non può essere rilevato.
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Representative Results
Al fine di indurre modello KOA, MM è stato effettuato nel giunto di ginocchio destro di ratti SD (Figura 3). Otto settimane dopo la chirurgia, i ratti sono stati sacrificati e le sezioni di serie di giunti di ginocchio sono state valutate con entrambi H & E e Safranina O/Fast Green macchiatura (Figura 4). Per H & E colorazione, la superficie della cartilagine articolare ha esibito confini più ruvide al ginocchio chirurgia piuttosto l'articolazione normale senza chirurgia. Per colorazione verde di Safranina-O/veloce, abbiamo osservato in diminuzione proteoglycan (colorazione rossa) e collagene fibrillato (colorazione verde), nell'ambulatorio congiunto rispetto a quella normale, che ha indicato la progressione degenerativa fenotipi KOA è aumentato indotta da chirurgia. Per assomigliare la progressione di KOA umana, i ratti sono stati sacrificati alle 3 settimane, 6 settimane e 8 settimane dopo MM a patogenesi di valutare e determinare il tempo degli interventi terapeutici.
Etichettato haMSCs è stata visualizzata nel modello del ratto KOA da un ottico in vivo imaging system. 1 h dopo l'etichettatura, con l'etichetta haMSCs esposto rotondo forme in vitro. L'etichettatura di efficienza raggiunto circa il 95%. Dopo 24 h, coltivate ha etichettato haMSCs esposto forme lungo mandrino, che indica di fatto non cambia la capacità di aderenza del haMSCs in vitro (Figura 5). Otto settimane dopo la chirurgia, 2.5 x 106 ha fatto-con l'etichetta haMSCs sono state iniettate nei giunti con KOA. Qui, etichettato haMSCs sono stati osservati nel locale giunto dal giorno 0 (8 settimane dopo l'intervento chirurgico) fino al giorno 70 post ad iniezione (18 settimane dopo l'intervento chirurgico) utilizzando un in vivo imaging system (Figura 6).
Figura 1: campo chirurgico schematico per l'area di chirurgia e iniezione di MM per il recapito cellulare. (A) questo diagramma schematico raffigura l'area chirurgica, che è evidenziata dal colore blu. (B) questo diagramma schematico indica il sito di iniezione all'interno dell'area di un cerchio rosso. Acronimo di definizioni è i seguenti: MM, menisco mediale; MCL, legamento collaterale mediale; LM, menisco laterale; LCL, legamento collaterale laterale; PL, legamento patellar. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: le schermate del software di imaging in vivo. (A) le impostazioni chiave dei parametri per acquisizione immagini fluorescenti sono evidenziate con quadrati rossi. (B) l'efficienza radiante viene scelto come unità per la misura della fluorescenza. (C) nella tavolozza, regioni di interesse (ROI) vengono cerchiate per misure di efficienza di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: le procedure di KOA chirurgicamente indotta. (A) l'esposizione dello spazio articolare del ginocchio. (B) la struttura interna dell'articolazione, con una freccia nera che indica il menisco mediale del ginocchio. (C) il menisco mediale dissecato. (D) la spazio articolare e la pelle sono chiusi.
Figura 4: rappresentante immagini istologiche delle articolazioni di ginocchio e analisi statistiche per Punteggio OARSI di KOA. (A) otto settimane dopo l'intervento MM in ratti, sezioni di serie di giunti di ginocchio sono state valutate con H & E e Safranina O/veloce verde colorazione. H & E la macchiatura ha mostrato lo spessore della cartilagine del ginocchio chirurgia è stata ridotta. Safranina O/Fast Green ha mostrato la macchiatura diminuito proteoglycan (colorazione rossa) e aumentato fibrillato collagene (colorazione verde) nel ginocchio chirurgia rispetto al ginocchio normale. Barra della scala = 500 µm. (B) analisi statistiche per Punteggio di osteoartrite in giunti normali e KOA giunti (n = 3). I dati sono espressi come mean±SEM. * indica p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: morfologia del fatto-con l'etichetta haMSCs. Campo luminoso, immagini fluorescenti e unite di haMSCs a 1 h dopo l'etichettatura sono indicate nel pannello superiore. Campo luminoso, fluorescentand Unite immagini di haMSCs at24 h dopo etichettatura sono mostrati nel pannello inferiore. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: In vivo imaging del fatto-con l'etichetta haMSCs. Dopo l'iniezione di 2.5 x 106 ha fatto-con l'etichetta haMSCs, appaiono immagini rappresentative dei ratti KOA. Ha fatto haMSCs coniugati sono stati rilevati fino a 9 settimane localmente nelle giunture dei ratti KOA. Questa figura è stato riprodotto dalla pubblicazione di Li M. et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Norme di sicurezza e studi di biodistribuzione di terapia della cellula formativa sono urgentemente necessari prima che possiamo portare il trattamento rigenerativo delle cellule staminali per KOA dalla panchina al capezzale. Tuttavia, l'ambiente patologico della malattia svolge un ruolo importante nella persistenza e biodistribuzione di trapiantati haMSCs10. Recentemente, il nostro gruppo ha dimostrato che iniezione intrarticolare di haMSCs più persistenti in un ambiente di KOA patologico quanto fatto iniezioni sotto condizioni normali8. È possibile che il microambiente infiammatorio e degenerativo può reclutare cellule staminali mesenchimali per la riparazione e successivamente favoriscono la ritenzione di haMSCs iniettato1,21. Inoltre, i profili di sicurezza e l'efficacia di haMSCs possono essere influenzati dai tempi di consegna di cella per quanto riguarda la gravità di KOA, affinché Ottimizzazione della progressione di KOA in animali da laboratorio fornirà dati importanti per il supporto di studi clinici. Con l'obiettivo di assomigliare da lieve a moderata gravità dell'umano KOA, ratti indotti da MM sono permesso di sviluppare KOA che vanno da 3 a 8 settimane. In questo studio, il cambiamento morfologico della cartilagine è stato valutato istopatologiche segnando 8 settimane dopo la chirurgia, che offre un modello relativamente fattibile con un grado moderato di KOA per studiare l'efficacia e la sicurezza di haMSCs8. Abbiamo dimostrato qui un metodo semplice e fattibile per etichetta haMSCs con tintura di membrana lipofilico fluorescente da' per valutazione efficacia pre-clinica a lungo termine.
Gli svantaggi di questa tecnica sono che il tessuto imaged dovrebbe essere vicino alla pelle e una notevole quantità di coniugati haMSCs sono necessari per l'acquisizione di segnale sufficiente a causa delle rese modeste quantistica da ha fatto. Sebbene consenta un sistema ottico in vivo imaging non-invasivo studi longitudinali di haMSCs biodistribuzione in KOA modelli, tendenze nel numero delle cellule e di posizione possa essere individuate solo in generale. L'analisi di destino delle cellule staminali, in particolare di proliferazione e differenziazione, saranno affrontato anche utilizzando mapping di destino e formazione immagine di microscopia ad alta risoluzione.
Attualmente, un'ampia varietà di tecniche di etichettatura sono disponibili per in vivo delle cellule staminali rilevamento, tra cui etichette radioattive, nanoparticelle e trasduzione virale di geni reporter22,23,24. Tuttavia, etichettatura radioattivi nonché trasduzione virale delle cellule staminali può interferire con le proprietà genetiche delle cellule, che successivamente possono incidere sulle staminali cella proliferazione e sopravvivenza in vivo16. Inoltre, l'analisi di cellule staminali usando MRI dall'assorbimento delle nanoparticelle come agente a contratto richiede una migliore risoluzione spaziale attraverso un campo magnetico forte, che può destare preoccupazioni circa la sensibilità di questa tecnica25. Cella fluorescente tinture, come PKH26, CM-DiI e CFSE presentano vari gradi di citotossicità e offrono una durata relativamente limitata (fino a 4 settimane) di etichettatura tessuto adiposo derivate cellule15. Al contrario, ha fatto mostre debole fluorescenza in soluzioni acquose. Una volta incorporato con una membrana lipidica, diffonde uniformemente all'interno della membrana cellulare e fluorescenza da' express stabile19. Cellule vitali di etichette e non influenzare la loro proliferazione e funzione18. Ancora più importante, i coloranti non trasferire da etichettati cellule alle cellule senza etichetta a meno che non vi è un'interazione diretta membrana tra quelli di cellule26. Da' eccitazione e spettri di emissione di impedisce l'interferenza di autofluorescent dai tessuti circostanti e fornisce immagini di deep tissue in animali vivi. Queste caratteristiche consentono fatto etichettare come una tecnica di monitoraggio a lungo termine ideale per studiare il destino del haMSCs impiantato intrarticolare. Di conseguenza, abbiamo dimostrato un affidabile metodologia per il monitoraggio ha etichettato haMSCs in un periodo di 63 giorni in un modello di ratto8.
All'interno del protocollo per il monitoraggio di fatto-con l'etichetta haMSCs in un modello del ratto KOA, i passaggi critici per ottenere risultati affidabili e fattibile sono per assicurarsi che: 1) il menisco verso il femore è completamente tagliato attraverso in ogni modello di ratto per inizio coerenza di KOA, 2) non c'è un rapporto ottimizzato di 10 μL tingere contro 106 haMSC celle per un 50 min macchiatura, 3) la soglia di rilevazione in vivo per haMSCs fatto-labeled è tra 104 e 105 celle, mentre sopra 106 celle è consigliato in questo protocollo.
Una volta acquistato padronanza di questa tecnica, l'applicazione di questo metodo potrebbe essere utilizzato per determinare il percorso ottimale o dosaggio per la somministrazione di cellule staminali mesenchimali in studi pre-clinici. Questo protocollo può essere facilmente adattato per la valutazione pre-clinica a lungo termine di biodistribuzione in vivo di cellule staminali mesenchimali (MSCs) da altre fonti, compreso il sangue del midollo osseo e cordone ombelicale. Alla luce di prospettiva per il destino delle cellule staminali in modelli animali di KOA, immunohistology studio di haMSCs xenogenici, quali Ki67 per proliferazione8 e collagene II per cartilagine articolare differenziazione27, possa essere combinato con questo tecnica.
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Disclosures
Li Meng, Hao Ming e Wen Wang sono dipendenti attuali e stock options possessori di cellulare biomedicina gruppo (Nasdaq: CBMG). Gli altri autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da Shanghai finanziamento dell'innovazione (1402H 294300) sponsorizzato dalla scienza e dalla tecnologia Commissione di Shanghai comune (CN) al Dr. Wen Wang. Vorremmo ringraziare il Dr. Guangdong Zhou (nazionale Tissue Engineering Center di Cina) per la sua assistenza tecnica e consulenza scientifica per questo manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il signor Huitang Xia (ospedale del popolo di Shanghai nona) per il suo aiuto nel benessere degli animali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin,, et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
