Summary
Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).
Abstract
Para oferecer suporte a aplicação clínica da terapia humana adiposo-derivados mesenquimais células-tronco (haMSC) para osteoartrite do joelho (KOA), examinamos a eficácia da persistência de célula e biodistribuição de haMSCs em modelos animais. Demonstrámos um método para rotular a membrana da célula de haMSCs com corante lipofílico fluorescente. Posteriormente, injeção intra-articular das pilhas etiquetadas em ratos com KOA cirurgicamente induzida dinamicamente foi monitorada por um na vivo sistema de imagem. Utilizamos o lipofílico carbocyanines fez (DilC18 (5)), um análogo de Dil (dialkylcarbocyanines) far-red fluorescente, que utilizou um laser vermelho para evitar a excitação da autofluorescência verde natural dos tecidos circundantes. Além disso, os espectros de emissão avermelhado de permitiu a imagem do profundo-tecido de animais vivos e o processo de rotulagem não causaram nenhum efeitos citotóxicos ou dano funcional ao haMSCs. Esta abordagem tem demonstrada ser um método de controle eficiente para haMSCs em um modelo do rato KOA. A aplicação deste método também pode ser usada para determinar a rota ideal de administração e dosagem de MSCs provenientes de outras fontes em estudos pré-clínicos.
Introduction
Osteoartrose do joelho (KOA) é uma doença degenerativa resultante da perda de cartilagem articular e inflamação progressiva, que se tornou das principais doenças crônica em idosos ao redor do mundo1. No entanto, terapias atuais usando anti-inflamatórios, suplementos de físicos e procedimentos cirúrgicos somente podem proporcionar alívio temporário para sintomáticos dor2.
Adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) tornaram-se um remédio promissor regenerativo para osteoartrite do joelho, devido à sua diferenciação multipotent potencial para regeneração de cartilagem e imunomoduladores propriedades3, 4. Comparado com rotas farmacológicas para investigar os mecanismos de ação na vivo, acompanhamento ao vivo haMSCs em modelos animais de pequeno KOA é atualmente instrutivo para estabelecer a fundamentação e a viabilidade da terapia haMSC antes da aplicação clínica. Para testes pré-clínicos, meniscectomia medial (MM) desestabiliza a carga mecânica da articulação para induzir KOA em ratos, que fornece um modelo relativamente viável com reprodutibilidade consistente5. O aparecimento de KOA induzida por MM é anterior à transecção do ligamento cruzado anterior, sozinha ou combinada com meniscectomia medial parcial6. Portanto, as longo prazo interações entre haMSCs injetado com o microambiente patológica de KOA frequentemente são avaliadas em ratos induzidos por MM7,8.
Embora a eficácia terapêutica de haMSCs tem sido amplamente relatado, relevante o conhecimento sobre a persistência na vivo do haMSCs implantado através de injeção intra-articular de (IA) é escasso9,10. Assim, vários métodos de rotulagem celulares foram desenvolvidos, incluindo immunohistology11luciferase12, transfecção de13 proteína verde fluorescente, óxido de ferro, rotulagem por ressonância magnética (MRI)14 e numerosas células fluorescentes corantes8,15,16. Em comparação com análises de trabalho intensivo de histologia, na vivo não-invasivo imagem emprega dispositivos ópticos para detectar a distribuição em tempo real e a dinâmica das células rotuladas com sinais fluorescentes10,17. Para a imagem latente funcional de células vivas, cytocompatible fluorescente rotulagem é uma técnica de rastreamento sofisticado radioativo livre para revelar atividades celulares após transplante de células-tronco18. Além disso, multicoloridos fluorescentes corantes lipofílicos possuem vantagens sobre amino-hidrofílicos corantes ou proteínas fluorescentes, incluindo sua permeabilidade celular melhorada e reforçada fluorescência quântica rendimentos19.
Assim, os protocolos incluídos aqui utilizam um vermelho laser para excitar as células rotuladas com carbocyanines lipofílicos fez (DilC18(5)), que é um far-red fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analógico20. Os espectros avermelhado da excitação e emissão de evita a interferência de autofluorescent e permite que a imagem latente durante um longo período de tempo em animais vivos8tecidos profundos. Esse método de rastreamento de células na vivo rotulado com que é válido para monitoramento transplantadas células-tronco, tais como haMSCs, em modelos animais, que é essencial para compreender e melhorar a atual terapia regenerativa de células-tronco.
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Protocol
procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética e local institucional Animal conta com um esforço para minimizar o sofrimento dos animais. O seguinte protocolo foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) em Shanghai Ninth pessoas ’ s Hospital afiliado para Shanghai JiaoTong University School of Medicine com o protocolo número [2017] 063.
1. estabelecimento de um modelo de osteoartrite do joelho de rato Surgically-Induced
- para este procedimento cirúrgico, uso 8-12 semanas velhos ratos machos Sprague Dawley (SD) com peso entre 250 e 300 g.
- Anestesiar os animais com 40 mg/kg de tiletamina e eficiente de 40 mg/kg através de injeção intramuscular.
- Colocar o animal na posição de lateral esquerda num palco aquecida. Raspe o joelho direito completamente com uma navalha. Desinfetar a área cirúrgica com solução de iodo-providone de 10%, seguida por 70% de etanol, repita mais duas vezes e depois pintar com solução de providone-iodo 10% e cobrir a área não-cirúrgico com um bloco cirúrgico.
- Usando um bisturi cirúrgico, faça uma incisão de 2 cm lateralmente ao longo do tendão patelar para expor o jointcapsules.
- Usar um bisturi cirúrgico para transecto o ligamento colateral medial. Refletem o menisco em direção ao fêmur.
- Gotejar solução de cloreto de sódio 0,9% estéril na superfície da cartilagem articular durante a operação para impedir a cartilagem desseque.
- Pegar o menisco medial com fórceps e cortam o menisco em seu ponto mais estreito do acessório da tíbia com um bisturi ( figura 1A). Evitar ferir a cartilagem.
- Fecha a cápsula da articulação com uma sutura absorvível 4-0.
- Monitorar os ratos cirúrgicos até que recupere a consciência.
- Injetar gentamicina 20 mg/kg para evitar a infecção e a buprenorfina de 0,05 mg/kg, através de uma rota intramuscular para aliviar a dor após a cirurgia.
- Manter os ratos em instalações animais sob um ciclo de luz/escuro de 12 h por 3-8 semanas para início KOA temperatura controlada. Os animais continuam a receber medicação para a dor, incluindo mas não limitado a buprenorfina (0,05 mg/kg, IM) e gentamicina (20 mg/kg, i.m.), se persistirem os sintomas de dor.
2. Histologia do rato KOA modelo de avaliação
- sacrificar os ratos com excessiva CO 2 inalação (adicionar uma taxa de preenchimento de cerca de 30% do volume por minuto com dióxido de carbono para o ar existente na câmara câmara tornar a inconsciência animal dentro de 2-3 min. fluxo de CO2 manter por um período mínimo de 1 min após a respiração cessa.) no indicado pontos de tempo (representante os resultados são apresentados em 8 semanas de indução KOA, variando de 3 a 8 semanas) após a cirurgia...
- dissecar a pele e os músculos em torno das articulações do joelho e cortar as articulações de joelho com um bisturi.
- Corrigir as articulações de joelho em paraformaldeído 4% (PFA) por 3 dias à temperatura ambiente. Depois, descalcificar as amostras em 20% de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para cerca de 4 semanas a 4 ° C e alterar o EDTA a cada 3 dias.
Atenção: Paraformaldehyde é tóxico, usar equipamento de protecção adequado (EPI), tais como luvas e óculos. - Desidratar as amostras usando um processador automático de tecidos. Definir o menu para iniciar um ciclo de descarga, da seguinte forma: 70% de etanol por 1h; Depois de 80% de etanol e 95% de etanol por 1h respectivamente; seguido por 2 ciclos de 100% de etanol por 1h; posteriormente, xileno duas vezes por 1h cada vez e parafina 3 vezes em 58 ° C, durante 1 h a cada vez.
Atenção: Xileno é tóxico, então use EPI apropriado, como luvas e óculos.
Nota: Opcionalmente, usar potes de Coplin para desidratação manual com a mesma afinação que o processador automático de tecidos. - Coloque a face medial da face comum intacta para baixo e incorporá-lo no bloco de parafina com tecido incorporado centro.
Nota: Opcionalmente, usar fórceps para incorporar as amostras para o bloco de parafina manualmente. - Começar a cortar 5 µm sagital seções da margem medial da articulação para intervalos de 30 µm com 2 seções seriais por micrótomo rotativo.
- Montar seções em lâminas de vidro e deparaffinize os slides em xilol. Entre as 2 seções seriais, manchar um slide com hematoxilina & eosina (H & E) coloração: 0,1% hematoxilina por 15 min, 1% de solução de ácido acético por 10 s e 0,5% eosina por 10 min. E manchar o outro slide com safranina O/Fast Green coloração: 0,1% hematoxilina por 15 min, 0,02% Fast Green por 3 min, 1% de solução de ácido acético por 10 s e 0.1% safranina O por 3 min.
Cuidado: O xileno é tóxico, vestir os EPI adequado, tais como luvas, óculos. - Marcar as lâminas coradas utilizando o sistema de avaliação de histopatologia osteoartrite Research Society International (OARSI) em ratos 6.
3. Rotulagem de células-tronco mesenquimais humanas com o corante fluorescente fez
- preparar fez célula-rotulagem solução em etanol 100% na concentração de 1 mM. Proteger a solução de criação de etiquetas de célula de luz e armazená-lo em temperatura ambiente por mais 6 meses.
- Crescer haMSCs com procedimentos de cultura de pilha padrão em Dulbecco ' s modificado águia ' s suplementado (DMEM) com 1% penicilina e estreptomicina e 10% fetal soro de vitelo (FCS) em um prato de petri de 10 cm.
- Desanexar haMSCs com tripsina 0,25% de 2 mL com confluência de prévia para cerca de 80% de EDTA 1 mM.
- Neutralizar tripsina com 4 mL de meio de cultura e girar as células a 800 x g, durante 3 min à temperatura ambiente.
- Suspender as células em uma densidade de 1 x 10 6 células/mL em 5 mL de meio de cultura de soro livre.
- Rotular as células pela adição de 50 µ l fez solução de criação de etiquetas de célula em meio de cultura 5 mL soro livre a 37 ° C, durante 50 min.
- Girar as pilhas etiquetadas a 800 x g, durante 3 min.
- Lavar as células duas mais vezes com 5 mL fosfato tampão soro fisiológico (PBS) a x 800 g por 3 min cada.
- Olha o rotulado haMSCs usando um microscópio fluorescente com um conjunto de filtro de Cy5.
- Contar as células com coloração azul trypan e obter 2,5 x 10 6 células viáveis em 100 µ l PBS para injeção.
4. Na Vivo Fluorescente de Imaging para faixa haMSCs
- oito semanas após a cirurgia (etapa 1), anestesiar os ratos KOA pela injeção intramuscular de 25 mg/kg de tiletamina e eficiente de 25 mg/kg.
- Raspar o joelho direito cuidadosamente com uma lâmina de barbear para expor a área comum. Desinfetar a área conjunta com etanol a 70%.
- Usando uma agulha de seringa 26g, injetar 2,5 x 10 6 rotulado células suspendidas em 100 µ l PBS, no centro da área do triângulo formado pelo lado medial do ligamento patelar, o côndilo femoral medial e o côndilo medial da tíbia ( figura 1B).
- Abrir o software de imagem e inicializar a bioluminescência na vivo, sistema de imagem.
- Posição ratos em supino a posição na fase central do sistema de imagem e fechar a porta da câmara.
- Verificar o " fluorescente " caixa de seleção e selecione filtro fluorescente conjuntos de 640 nm para a excitação e 680 nm para emissão ( Figura 2A).
- Selecionar campo de visão de conjunto D. pixel binning para médio (8), F/Stop para exposição e 2 hora de auto. Manter o ideal tempo de exposição consistente para obter resultados comparáveis em todo o estudo inteiro ( Figura 2A).
- Retire o animal do palco e monitor para a recuperação da anestesia.
Nota: Animal lugar sobre uma almofada de aquecimento coberto com 2-3 camadas de toalha. - Escolher as unidades de eficiência radiante para a medição de fluorescência ( Figura 2B). Selecione as regiões de interesse (ROI) para análise e quantificar os sinais fluorescentes de cada imagem ( Figura 2).
- Repita o procedimento da imagem latente na vivo para cada rato sequencialmente estudar haMSCs retenção longitudinal na articulação.
Nota: Sugerimos que os animais de imagem ' sinais fluorescentes pelo sistema de imagens in vivo, uma vez a cada dois dias para a primeira semana após a injeção e uma vez por semana até que o sinal não pode ser detectado.
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Representative Results
A fim de induzir modelo KOA, MM realizou-se na articulação do joelho direito de ratos SD (Figura 3). Oito semanas após a cirurgia, ratos foram sacrificados e as seções série de articulações de joelho foram avaliadas com as duas H & E e safranina O/Fast Green coloração (Figura 4). Para H & E coloração, a superfície da cartilagem articular exibiu fronteiras mais ásperos nos joelhos cirurgia do que a articulação normal sem cirurgia. Para verde de safranina-O/Fast coloração, nós observado diminuição proteoglycan (coloração vermelha) e aumentou fibrilado colágeno (coloração verde) na cirurgia conjunta em comparação com o normal, que indicou a progressão dos fenótipos KOA degenerativas induzida pela cirurgia. Para assemelhar-se a progressão de KOA humana, ratos foram sacrificados em 3 semanas, 6 semanas e 8 semanas após MM para avaliar patogênese e determinar o tempo de intervenções terapêuticas.
Rotulado haMSCs foi visualizado no modelo do rato de KOA por uma ótica na vivo sistema de imagem. 1 h depois da rotulagem, rotulado haMSCs exibiu redondo formas em vitro. A etiquetagem de eficiência atingiu cerca de 95%. Após 24 h, culto fez rotulado haMSCs exibiu formas de eixo longo, indicando que não altera a capacidade de aderência do haMSCs em vitro (Figura 5). Oito semanas após a cirurgia, 2.5 x 106 fez-rotulado haMSCs foram injetadas articulações com KOA. Aqui, rotulado haMSCs foram observados na articulação local do dia 0 (8 semanas após a cirurgia) até injeção de pós dia 70 (18 semanas após a cirurgia) usando um na vivo de imagem de sistema (Figura 6).
Figura 1: esquemático campo cirúrgico para a área de cirurgia e injeção de MM para entrega celular. (A) este diagrama esquemático retrata a área cirúrgica, o que é realçada pela cor azul. (B) este diagrama esquemático indica o local de injeção dentro da área de um círculo vermelho. Definições do acrônimo são como segue: MM, o menisco medial; MCL, ligamento colateral medial; LM, menisco lateral; LCL, ligamento colateral lateral; PL, ligamento patelar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: tela tiros de software de imagens in vivo. (A) configurações de chave de parâmetros para aquisição de imagens fluorescentes são realçadas com quadrados vermelhos. (B) eficiência radiante é escolhida como a unidade de medição de fluorescência. (C) na paleta de ferramentas, regiões de interesse (ROI) estão circuladas para medições de eficiência de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: os procedimentos de KOA cirurgicamente induzida. (A) exposição do espaço articular do joelho. (B) a estrutura interna da articulação, com uma seta preta indicando o menisco medial do joelho. (C) o menisco medial dissecado. (D) o espaço articular e pele estão fechadas.
Figura 4: fotos histológicas representativas das articulações do joelho e análise estatística para Pontuação OARSI de KOA. (A) oito semanas pós cirurgia MM em ratos, seriais seções de articulações de joelho foram avaliadas com H & E e safranina O/Fast Green coloração. H & E coloração mostrou a espessura da cartilagem no joelho cirurgia foi reduzida. Safranina O/Fast Green coloração mostrou diminuição proteoglycan (coloração vermelha) e aumentou fibrilado colágeno (coloração verde) no joelho cirurgia em comparação com o joelho normal. Barra de escala = 500 µm. (B) análise estatística para Pontuação de artrose nas articulações normais e articulações KOA (n = 3). Os dados são expressos como mean±SEM. * indica p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: morfologia de haMSCs fez-etiquetadas. Campo claro, imagens fluorescentes e mescladas de haMSCs a 1 h depois da rotulagem são mostradas no painel superior. Campo claro, fluorescentand fundiu-se imagens de haMSCs at24 h depois de rotulagem são mostradas no painel inferior. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: In vivo por imagens do fez-rotulado haMSCs. Após a injeção de 2.5 x 106 fez-rotulados haMSCs, são mostradas imagens representativas de ratos KOA. Foi rotulados haMSCs foram detectados por até 9 semanas localmente nas articulações dos ratos KOA. Esta figura foi reproduzida a partir da publicação de Li M et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Normas de segurança e estudos de biodistribuição de terapia com células estaminais são urgentemente necessários antes de trazermos o tratamento de células-tronco regenerativa para KOA do banco ao lado do cama. No entanto, o ambiente patológico de doença desempenha um papel importante na persistência e biodistribuição de transplantado haMSCs10. Recentemente, nosso grupo demonstrou que injeção intra-articular de haMSCs mais persistentes em um ambiente de KOA patológico do que injeções sob condições normais de8. É possível que o microambiente inflamatório e degenerativo pode recrutar células-tronco mesenquimais para reparação e posteriormente favorecem a retenção de injetado haMSCs1,21. Além disso, os perfis de segurança e eficácia de haMSCs podem ser influenciados pelo tempo de entrega de celular sobre a severidade da KOA, para que a otimização da progressão de KOA em animais de laboratório fornecerá dados valiosos para ensaios clínicos de apoio. Com o objectivo de assemelhando-se a leve a moderada severidade de KOA humana, ratos induzidos por MM podem desenvolver KOA variando de 3 a 8 semanas. Neste estudo, a alteração morfológica da cartilagem foi avaliada por histopatológicas marcando 8 semanas após a cirurgia, que oferece um modelo relativamente viável com um grau moderado de KOA para investigar a eficácia e segurança de haMSCs8. Demonstramos aqui um método simples e viável para rótulo haMSCs com tintura de far-red membrana lipofílico fluorescente para avaliação de eficácia pré-clínica a longo prazo.
As desvantagens desta técnica são que o tecido da imagem deve ser perto da pele e uma quantidade substancial de rotulados haMSCs são necessários para a aquisição do sinal suficiente devido o rendimento quântico modesto de fez. Embora na vivo de imagem sistema óptico permite estudos longitudinais não-invasivo de haMSCs modelos de biodistribuição em KOA, tendências na cela número e localização só pode ser discernida em geral. A análise do destino de células-tronco, em particular células proliferação e diferenciação, será abordada, também utilizando microscopia de alta resolução de imagem e mapeamento de destino.
Atualmente, uma grande variedade de técnicas de rotulagem estão disponíveis para na vivo rastreamento de células-tronco, incluindo rótulos radioactivos, nanopartículas e transdução viral da repórter genes22,23,24. No entanto, etiquetar radioativo bem como transdução viral de células-tronco pode interferir com as propriedades genéticas das células, que posteriormente podem afetar a haste celular proliferação e sobrevivência na vivo16. Além disso, rastreamento de células-tronco usando MRI pela utilização de nanopartículas como agente de contrato exige melhor resolução espacial através de um forte campo magnético, que podem levantar preocupações sobre a sensibilidade desta técnica25. Celular fluorescente corantes, tais como PKH26, CM-DiI e CFSE apresentam graus variados de citotoxicidade e oferecem uma duração relativamente limitada (até 4 semanas) de tecido adiposo de rotulagem derivado de células15. Em contrapartida, exibe fluorescência fraca em soluções aquosas. Uma vez incorporado com uma membrana lipídica, difunde uniformemente dentro da membrana celular e expressam estável fluorescência far-red19. Células viáveis de rótulos e não afetam sua proliferação e função18. Mais importante, os corantes não transferência de pilhas etiquetadas para células sem rótulo a menos que haja uma interação direta da membrana entre essas células26. A excitação far-red e espectros de emissão de Evite uma interferência de autofluorescent tecidos circundantes e fornece a imagem do profundo-tecido de animais vivos. Estas características permitem fez rotular como uma técnica de acompanhamento a longo prazo ideal para estudar o destino do haMSCs implantado intra-articularly. Portanto, temos demonstrado uma confiável metodologia para monitorar fez rotulados haMSCs durante um período de 63 dias em um modelo do rato8.
O protocolo para rastreamento de haMSCs fez-etiquetadas em um modelo do rato KOA, os passos críticos para obter resultados fiáveis e viáveis são para certifique-se que: 1) o menisco em direção ao fêmur é cortar completamente em cada modelo de rato para início consistente de KOA, 2) é uma relação otimizada de 10 μL tingir contra 106 células de haMSC para um 50min coloração, 3) o limite de deteção na vivo para haMSCs fez-etiquetado é entre 104 e 105 células, enquanto acima de 106 células é recomendado neste protocolo.
Uma vez que esta técnica é dominada, a aplicação deste método poderia ser usada para determinar a rota ideal ou dosagem para administração de MSCs em estudos pré-clínicos. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para a avaliação pré-clínica a longo prazo de biodistribuição no vivo de células-tronco mesenquimais (MSCs) de outras fontes, incluindo sangue de medula óssea e cordão umbilical. Tendo em conta o potencial para destino de células-tronco em modelos animais de KOA, immunohistology estudo de xenogénica haMSCs, tais como Ki67 para proliferação8 e colágeno II para diferenciação de cartilagem articular27, pode ser combinado com isso técnica.
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Disclosures
Li Meng, Hao Ming e Wen Wang são empregados atuais e detentores de outorga de opção de celular grupo de Biomedicina (Nasdaq: CBMG). Os outros autores não declaram nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
O atual estudo foi suportado por Xangai inovação financiamento (1402H 294300) patrocinado pela ciência e tecnologia Comissão de Xangai município (CN) para o Dr. Wen Wang. Gostaríamos de agradecer Dr. Zhou de Guangdong (nacional tecido engenharia centro da China) pela sua assistência técnica e aconselhamento científico para este manuscrito. Também gostaríamos de agradecer o Sr. Huitang Xia (Hospital de Xangai nona das pessoas) por sua ajuda no bem-estar dos animal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
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