Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe retinale pigment epitheliale cellen (RPE) uit pluripotente stamcellen te produceren. De methode gebruikt een combinatie van factoren die de groei en de kleine molecules om direct de differentiatie van stamcellen in onvolwassen RPE in veertien dagen en volwassen, functionele RPE na drie maanden.
Abstract
We beschrijven een robuuste methode om direct de differentiatie van pluripotente stamcellen in retinale pigment epitheliale cellen (RPE). Het doel van het verstrekken van een gedetailleerde en grondige protocol is duidelijk op elke stap en dit gemakkelijk beschikbaar maken voor onderzoekers in het veld. Dit protocol resultaten in een homogene laag van RPE met minimale of geen handmatige dissectie nodig. De methode die hier gepresenteerd is aangetoond dat het effectief zijn voor geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) en menselijke embryonale stamcellen. Daarnaast beschrijven we methoden voor cryopreservatie van tussenliggende celbanken waarmee langdurige opslag. RPE gegenereerd met behulp van dit protocol zou kunnen nuttig voor iPSC ziekte-in-a-schotel modeling of klinische toepassing zijn.
Introduction
De retinale pigment epitheel is een monolayer van gepigmenteerde cellen die cruciale ondersteuning bieden voor researchdieren. Retinale pigment epitheliale cellen (RPE) hebben talrijke functies in visie, inclusief lichte absorptie, voedingsstoffen en ion transport, retinoid fietsen, fotoreceptor buitenste segment fagocytose, en groei factor secretie1. Er zijn een verscheidenheid van retinale dystrophie die invloed hebben op de functie van RPE en leiden tot een verlies van visie, met inbegrip van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie en retinitis pigmentosa. Generatie RPE uit pluripotente stamcellen onderzoek te begrijpen deze oogziekten kan vergemakkelijken, en een onbeperkte bron van RPE kan voorzien in cel therapieën2. In feite, zijn meerdere klinische proeven gaande RPE afgeleid van pluripotente stamcellen3gebruikt.
Dit protocol differentiatie werd oorspronkelijk beschreven door Buchholz4 en was gebaseerd op de eerder gepubliceerde methode van Clegg5. De procedure bootst het normale in vivo developmental proces om directe ongedifferentieerde pluripotente stamcellen naar het lot van een RPE via manipulatie van de insuline-groeifactoren (IGF), fundamentele fibroblast groeifactor (FGF-2; FGF-basic), transformeren groeifactor bèta (TGF-β) en4,5van de trajecten van de WNT. Het protocol is aanzienlijk verbeterd door toevoeging van een agonist traject WNT laat in het protocol, dat leverde 97.77% ± 0,1% pre-melanosome proteïnen (PMEL) positieve cellen, en is aangepast aan de omstandigheden xeno-vrije6,7. De resulterende RPE hebben aangetoond dat RPE markeringen op de transcript en proteïne niveaus, bekende RPE groeifactoren met juiste polariteit afscheiden, en uitvoeren van fagocytose van fotoreceptor buitenste segmenten8express. Dit protocol is sneller en betrouwbaarder dan "spontane" protocollen van differentiatie, waarbij eenvoudige verwijdering van fundamentele fibroblast groeifactor8. Bovendien, RNA sequencing gegevens blijkt dat RPE verkregen met behulp van dit protocol zijn zeer gelijkaardig aan die verkregen met behulp van de gemeenschappelijkere spontane aanpak8. De 14-daagse methode genereert RPE die passen bij de "5 P's ' genoemd door Mazzoni9 (gepigmenteerde, gepolariseerde fagocytische, post mitotische, veelhoekige)9. Terwijl deze procedure heeft bewezen in verschillende laboratoria reproduceerbaar zijn, willen wij erkennen van verschillende methoden van de extra gestuurde differentiatie die zijn gepubliceerd in de afgelopen jaren10,11,12 , 13.
Protocol
1. bereiding van reagentia voor dag 0 tot en met dag 14 van het Protocol
- de volgende middellange onderdelen voor te bereiden:
- retinale differentiatie maken 100 mL medium (RDM) door toevoeging van 1 mL van 100 x N2 supplement, 2 mL 50 x B27 supplement, en 1 mL 100 x niet-essentiële aminozuur (NEAA) aan 96 mL Dulbecco ' s bewerkt essentiële medium/nutriënt mengsel F12 9 (DMEM/F12).
- Maken 10 mL van de 1 M nicotinamide (NIC) door oplossen 1.221 g van NIC in 8 mL steriel water, vortexing, en het volume tot 10 mL met steriel water brengen. Steriel Filtreer de oplossing.
- De volgende factoren die de groei en de kleine molecules voorbereiden:
- reconstrueren recombinante muis bekertje, menselijke dickkopf WNT-remmer met signalering traject 1 (DKK-1), en IGF-1 tot 100 µg/mL elke in 0,1% bovien serumalbumine (BSA) in fosfaatgebufferde oplossing (PBS). Aliquot desgewenst en winkel bij-20 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
- Reconstrueren FGF-basic 10 µg/mL en recombinante menselijke/muis/rat Activin A tot 100 µg/mL elke in 0,1% BSA in PBS. Aliquot desgewenst en winkel bij-80 ° C gedurende maximaal 1 jaar.
- Reconstrueren SU 5402 (FGF specifieke receptor tyrosine kinase inhibitor) en CHIR99021 (glycogeen synthase kinase 3, GSK-3β, remmer) tot 10 mM in dimethylsulfoxide (DMSO). Aliquot en winkel bij-20 ° C gedurende maximaal 1 jaar of 6 maanden, respectievelijk.
- Verkrijgen van de volgende dag 0 en/of dag 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing (0.2 g EDTA per 1 liter van PBS), 1 X PBS- / - PBS (zonder calcium of magnesium, pH 7.4), 1 x trypsine-achtige dissociatie enzym (TDE), DPBS (Dulbecco ' s PBS), RPE ondersteuning van medium (RSM), en Y-27632 dihydrochloride (gebruik op 10 µM).
2. : 0 dag van pluripotente stamcel Passage voor differentiatie
- Grow stamcel kolonies in feeder-vrije, serumvrij voorwaarden tot ongeveer 80% samenkomst voordat passaging.
Opmerking: Zie bespreking voor meer informatie over het optimaliseren van deze stap. - Jas een 12-well plaat met extracellulaire matrix gebaseerde hydrogel (ECMH) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat opstijven gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 ° C.
- Aliquot de hoeveelheid RDM en PBS- / - nodig voor dag 0 en warm in een waterbad 37 ° c alvorens groeifactoren toe te voegen. Breng EDTA op kamertemperatuur.
- Toevoegen de groeifactoren die nodig zijn voor dag 0 tot de verwarmde RDM met 10 mM NIC, 50 ng/mL bekertje, 10 ng/mL DKK-1 en 10 ng/mL IGF-1. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 100 µL van NIC, 5 µl van bekertje, 1 µL van DKK-1 en 1 µL van IGF-1 tot 10 mL van RDM.
- Kiezen voor het verwijderen van alle gedifferentieerde kolonies op basis van morfologie van de cellen van de stam dat zal worden gepasseerd voor differentiatie. Gebruik een P10 Pipetteer tip handmatig verwijderen van de gedifferentieerde cellen.
Opmerking: Fibroblastic cellen tussen de kolonies, alsmede de ondoorzichtige cellen binnen kolonies geven aan gedifferentieerde cellen worden verwijderd. Zie de beschrijving voor meer informatie over gedifferentieerde cellen. - Passage van een enkel putje van een 6-well plaat in 4 putjes van de plaat van een 12-well (1:4).
Opmerking: Zie discussie voor meer informatie over het passaging van stamcellen in dit stadium.- Het medium van de cel van de stam van de cellen van de stam gecombineerd en was de putjes goed eenmaal met voorverwarmde PBS- / - 2 mL.
- Gecombineerd PBS- /- en spoel elke goed driemaal met 1 mL EDTA per putje van de plaat van een 6-well.
- Voorzichtig kantelen van de plaat en de EDTA gecombineerd. De plaat op geen enkele manier om te voorkomen dat voortijdig het opheffen van de cellen niet doen doorroeren.
- Na de derde wash, voeg 1 mL EDTA en Incubeer bij kamertemperatuur in de kap voor 3-5 min. De plaat niet storen tijdens deze incubatie.
- Gecombineerd de EDTA en voeg 1 mL RDM per putje dat zal worden ontpit met 0,5 mL van extra medium. Bijvoorbeeld, wassen 1 goed van een 6-well plaat met 4.5 mL van RDM plaat op 4 putjes van de plaat van een 12-well.
- Gebruiken een cel schraper voorzichtig los van de cellen. Verzamelen van alle cellen in een conische buis en triturate van de cellen in RDM door pipetteren op en neer 5 keer. Grote bosjes van cellen van elkaar gescheiden, maar doen niet triturate aan één celsuspensie. De cellen in de pipet gelijkmatig te verdelen. Voer deze stap snel om te voorkomen dat ingrepen aan de plaat.
- Zaad van cellen op de ECM-gecoate 12-Wells-platen (1 mL celsuspensie per putje).
- Tilt de plaat heen en weer om te verdelen de cellen gelijkmatig over de putten. Voorzichtig plaats in een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 tot de volgende middellange verandering.
- Opmerking het exacte tijdstip. Verandering medium op hetzelfde tijdstip elke dag.
3. Dag 1 tot en met 14: toevoeging van groeifactoren
- dag 1: het medium op alle putjes (1 mL per putje) wijzigen met behulp van RDM met de samenstelling van de groeifactor voor dag 0 (zie stap 2.4).
- Dag 2: het wijzigen van het medium gebruik RDM (1 mL per putje) met 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-basic 10 ng/mL bekertje, 10 ng/mL DKK-1 en 10 ng/mL IGF-1. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 100 µL van NIC, 5 µL van FGF-basic 1 µL van bekertje, 1 µL van DKK1 en 1 µL van IGF1 tot 10 mL van RDM.
- Dag 4: het medium gebruik van RDM (1 mL per putje) wijzigen met 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1 en 10 ng/mL IGF-1. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 10 µL van activin A, 1 µL van DKK1 en 1 µL van IGF-1 tot 10 mL van RDM.
Opmerking: Constateren dat cellen confluente in dit stadium. - Dag 6: het medium gebruik van RDM (1 mL per putje) wijzigen met 100 ng/mL activin A en 10 µM SU 5402. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 10 µL van activin A en 10 µL van SU RDM 5402 tot en met 10 mL.
- Dagen 8, 10 en 12: het medium gebruik van RDM (1 mL per putje) wijzigen met 100 ng/mL activin A, 10 µM SU 5402 en 3 µM CHIR99021. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, meng 10 µL van activin A, 10 µL van SU 5402 en 3 µL van CHIR99021 10 mL RDM.
4. Dag van verrijking van Passage 0 van RPE
- jas een 6-well plaat met groeifactor verminderd ECMH volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat opstijven gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 ° C.
- Aliquot de hoeveelheid DPBS nodig en RDM 1 mL per putje van verrijkings- en warm in een waterbad 37 ° C. Bring de onderzoekingen naar kamertemperatuur en warm nodig volume van RSM, antimicrobiële reagens en Y-27632 tot 37 ° C.
- Toevoegen antimicrobiële reagens en Y-27632 verkrijgen van 0,5 x en 10 µM composities respectievelijk aan RSM. Gebruik van dit medium voor de eerste 4-7 dagen om bijlage.
- Aspirate verbruikte medium uit alle wells en voeg 1 mL per putje van voorverwarmde RDM (geen groeifactoren vereist).
- Handmatig met behulp van een Microscoop ontleden, ontleden en schraap weg alle niet-RPE cellen met behulp van een P10 Pipetteer tip.
Opmerking: Zie de sectie van de representatieve resultaten voor voorbeelden. - Na dissectie, gecombineerd RDM en alle celopmaak puin. Wassen tweemaal met voorverwarmde DPBS per putje 1 mL.
- Voeg 0,5 mL per putje van de plaat van een 12-well onderzoekingen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten gebruik een cel schraper om voorzichtig de cellen van de plaat. Een P1000 Pipetteer kunt zachtjes triturate de cel/TDE opschorting door pipetteren omhoog en omlaag 3 - 4 keer te maken van een uniforme schorsing.
- Verdun de cel/TDE schorsing 1:10 in voorverwarmde RSM, zonder Y-27632. Centrifugeer celsuspensie bij 173 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Het medium van de cel pellet gecombineerd en resuspendeer de cellen in de RSM met 10 µM Y-27632 (1 mL per verrijkt Nou).
- Stam de cellen met behulp van een nylon mesh cel zeef met 40 µm poriën. Tellen van het aantal cellen in een opgegeven volume met behulp van een hemocytometer en bereken de concentratie van cellen in de gespannen oplossing.
- Zaad cellen op de groeifactor verminderd ECM-gecoate platen op 1 x 10 5 cellen/cm 2 in 4 mL RSM met 10 µM Y-27632.
- De RSM vervangen door 10 µM Y-27632 48 h na de cel zaaien en blijven ter vervanging van media elke 3-4 dagen (bijvoorbeeld op maandag en donderdag). Vervang de 10 µM niet na 4-7 dagen Y-27632.
- De cellen om te rijpen voor 28 tot 35 dagen bij 37 ° C en 5% CO 2 toestaan. Blijven ter vervanging van de RSM-elke 3-4 dagen (bijvoorbeeld op maandag en donderdag).
5. Rijping: Passage 1 en 2 van RPE
Opmerking: volumes zijn geïndiceerd voor 1 goed van een 6-well-plate of een kolf T75, zoals aangegeven door haakjes.
- Tussen de dagen 28 tot en met 35 van passage 0, jas een 6-well plaat (T75 kolf) met ECMH volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Aliquot de hoeveelheid DPBS en RSM nodig en warm in een waterbad 37 ° C. brengen TDE tot kamertemperatuur.
- Aspirate doorgebracht medium uit putten en wassen elke goed tweemaal met 2 mL (10 mL) voorverwarmde DPBS.
Opmerking: Gebruik geen 10 µM Y-27632. - Gecombineerd DPBS en voeg 1 mL (5 mL) onderzoekingen. Plaats in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 5 min. Na incubatie weergave cellen op een omgekeerde Microscoop te bevestigen de cellen zijn verdragsluitende en loskoppelen.
- Met behulp van een gepaste afmetingen cel schraper, zachtjes de cellen verwijderen vanaf de onderkant van het goed of de maatkolf.
- Een P1000 tip (10 mL serologische Pipetteer) kunt zachtjes triturate de cel/TDE schorsing op en neer 3 - 4 keer te maken van een uniforme schorsing.
- Verdund cel schorsing 1:10 in RSM. Reserveren van 2 mL (5 mL) van RSM spoel van de well/kolf en toevoegen aan de verdunde celsuspensie.
Opmerking: Laat niet enzym belichtingstijd maximaal 25 min. - Centrifugeren van de celsuspensie bij 173 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Het medium van de cel pellet gecombineerd en resuspendeer de cellen in 1 mL (5 mL) van RSM
- Stam de cellen met behulp van een nylon mesh cel zeef met 40 µm poriën. Tellen van het aantal cellen in een opgegeven volume met behulp van een hemocytometer en bereken de concentratie van cellen in de gespannen oplossing.
- Zaad van cellen op de ECMH-gecoate platen op 1 x 10 5 cellen/cm 2 in 4 mL (15 mL) van RSM.
- Kunnen de cellen om te rijpen voor 30 dagen. Blijven veranderen de RSM elke 3-4 dagen.
- Herhaal de bovenstaande procedure (stap 5.2-5.11) op dag 30 tot de passage van de cellen van passage 1 tot 2.
6. Creëren van een Intermediate cel Bank: cryopreservatie van Passage 2 dag 3-5 RPE
Opmerking: Cryopreserve van cellen, terwijl ze subconfluent (~ 50%) en geen pigment hebben herwonnen.
- Op basis van het aantal cellen, het berekenen van het volume van cryopreservatie medium met 10% DMSO moest resuspendeer de cellen bij een concentratie van 3 x 10 6 cellen/mL.
- Volg de stappen 5.2 tot en met 5.8. Resuspendeer de pellet cel in het cryopreservatie medium met 10% DMSO tot 3 x 10 6 cellen/mL en 1 mL van de celsuspensie overbrengen in cryogene flesjes van 1,2 mL.
- Plaats cryogene flesjes in een bevriezing container ontworpen bij-1 ° C/min afkoelen en plaats bij-80 ° C's nachts. Overbrengen in vloeibare stikstof voor langetermijnopslag.
Opmerking: Deze cellen worden passage 3 bij het ontdooien. Cultuur van de cellen voor 30 meer dagen voor karakterisering. Zaad passage 3 RPE op 1.5 x 10 5 per cm 2 bij het ontdooien. 2 , 4 , 6 , 7
Representative Results
Deze methode resulteert in de productie van een homogene, gepigmenteerde en cuboidal enkelgelaagde van RPE. De tijdlijn in Figuur 1 komt overeen met de foto's afgebeeld in Figuur 2. Zoals blijkt uit figuur 2A, zijn de stamcel kolonies zorgvuldig verpakt met gedefinieerde randen en geen fibroblastic cellen tussen de kolonies of ondoorzichtig cellen binnen kolonies. Figuur 2B biedt een weergave van onrijpe RPE die zijn subconfluent. Als de cellen nog confluente in dit stadium, uitbreiden niet zij prognoses die essentieel voor de differentiatie-proces zijn. Cellen die ernstig subconfluent zijn zal niet kunnen tot stand brengen van een enkelgelaagde en strakke kruispunten, karakteristiek van epitheel vormen. Details over hoe te optimaliseren deze samenloop worden beschreven in de sectie discussie. Figuur 2C toont de morfologie van de twee meest voorkomende vormen van niet-RPE die zich tijdens dit proces differentiatie voordoen kunnen: neurale of fibroblastic vlekken. Het is belangrijk op te merken dat deze neurale patches vooral ondoorzichtige op een ontleden Microscoop, verschijnen overwegende dat de gedefinieerde, fibroblastic-achtige patches bijna doorschijnend op een ontleden Microscoop worden. Het kan het nuttig zijn om deze gebieden op een plaat van weefselkweek Markeer met een pen ethanol-proof lab gemakkelijker om ze te identificeren op zowel een samengestelde lichte Microscoop en ontleden Microscoop. Cijfers 2D-F weergeven de kenmerkende lichte randen, geplaveide morfologie en pigmentatie die duiden op een gezonde, volwassen cultuur van RPE Figuur 3 is een hogere vergroting beeld te tonen van de verschillende weergave van volwassen RPE afgebeeld door fase contrast en heldere veld microscopie. Bij passage zijn 3-daags 30, de cellen klaar voor de karakterisering die is beschreven in eerdere publicaties, met inbegrip van RNA expressie, eiwit expressie groeifactor secretie en fagocytose2,4,6 ,7. Deze karakterisaties tonen dat de cellen die zijn vertegenwoordigd in deze beelden niet alleen gepigmenteerde cuboidal, maar ook fagocytische, post mitotische en gepolariseerde zijn.
Figuur 1:. Tijdlijn voor de toevoeging van factoren die de groei en rijping van RPE. Groeifactoren zijn toegevoegd aan 12-Wells-platen van dag 0-14. Rijpen RPE worden gekweekt in 6-Wells-platen of T75 kolven vanaf dag van verrijking tot 30 dagen na dooi (doorgang 3-daags 30). Pijlen geven aan enzymatische cel passaging. (A-E) hieronder de tijdlijnen komen overeen met de afbeeldingen in Figuur 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger morfologie en samenvloeiing van rijping RPE. Geïnduceerde pluripotente stamcellen onmiddellijk vóór de passaging voor differentiatie (A). Onrijpe RPE cellen subconfluent op dag 2 (B) en vóór verrijking van de pick te verwijderen op dag 14; niet-RPE patches (aangegeven door witte pijlen) weergegeven als patches of ondoorzichtig "linten" (C). RPE bij passage 0, 1 en 3 op dag 30 (D, E, en F). Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: oudere RPE bij passage 3: dag 30 Cuboidal morfologie afgebeeld in fase contrast (A) en pigmentatie afgebeeld in helder-veld (B). Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit protocol wordt beschreven hoe de epitheliale cellen van de retinale pigment uit pluripotente stamcellen te produceren. De methode is geoptimaliseerd door het gebruik van beide menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen van een feeder-vrije, serumvrij cultuur-methode. Sinds de eerste isolatie van menselijke embryonale stamcellen in 1998 en de afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) in 2007, een veelheid van cultuur van de cel van de stam methoden zijn ontwikkeld14,15,16, 17. Deze methoden moet voldoende zijn voor de productie van stamcellen kolonies die vatbaar voor deze differentiatie zijn. Er zijn geen bekende beperkingen aan de toepasbaarheid van deze methode goed afgeleide en onderhouden pluripotente stamcellen.
De meest kritische stappen zijn de passaging van stamcellen op dag 0 van differentiatie (stap 2.5) en de mogelijke noodzaak voor handmatige dissectie op dag 14 van het proces (stap 4.5). Bij het uitkiezen van gedifferentieerde cellen uit de koloniën van de cel van de stam verwijderen, verwijzen naar de afbeeldingen in Kent18. Zoals aangegeven, geven de fibroblastic cellen tussen de kolonies en de ondoorzichtige cellen binnen kolonies gedifferentieerde cellen die worden verwijderd moeten voordat u begint met dit protocol18. Alleen niet-gedifferentieerde, opeengepakte kolonies met gedefinieerde randen moeten worden gepasseerd voor differentiatie.
Het aantal zaadjes per putje (stap v2.6.7) de cellen van de stam wordt bemoeilijkt door het feit dat de stamcellen kan niet worden triturated in een enkele celsuspensie bij passage en kan niet nauwkeurig worden geteld met behulp van een hemocytometer. De onderlinge aanpassing van 80% confluente stamcellen is geïndiceerd voor passaging 1 goed van een 6-well plaat in 4 putjes van de plaat van een 12-well. Verschillen tussen stamcellijnen, zoals groei, kunnen invloed hebben op hoe snel de onrijpe RPE bereiken samenvloeiing tussen dagen 0 tot en met 4. De stamcellen zullen produceren RPE ongeacht de precieze samenvloeiing, maar de opbrengst van de cel will be negatively impacted als de cellen ook schaars in dit stadium zijn. De onrijpe cellen RPE moet ongeveer 40-50% heuvels op dag 1 en bijna 100% heuvels van dag 4. Als de cellen niet een confluente enkelgelaagde overdag 4 of 6 produceren, kan het protocol moet worden herhaald op een hogere seeding dichtheid op dag 0. Bijvoorbeeld, als 1 goed van een 6-well plaat was gepasseerd aan 4 putjes van de plaat van een 12-well op dag 0 en de onrijpe RPE zijn niet 100% heuvels op dag 4, verminderen het zaaien op een 1:3 of 1:2 passage op dag 0 of toestaan dat de stamcellen tot meer confluente vóór passaging. Het is essentieel om een consistente seeding dichtheid bij het vergelijken van meerdere cellijnen.
De stap van de handleiding dissectie op dag 14 is alleen nodig wanneer de niet-RPE cellen in cultuur (figuur 2C) aanwezig zijn. Sinds de toevoeging van CHIR99021 aan het protocol vereisen vele pluripotente stamcellijnen weinig tot geen handmatige dissectie. Sommige preparaten hebben een hogere incidentie van neurale patches en het is cruciaal voor het verwijderen van die cellen. Als de RPE niet rendabel bij passage 0 doorgang 3 zijn, is het mogelijk om te herhalen van het protocol van de differentiatie voldoende tijd om alle niet-RPE cellen verwijderen. Dit gebeurt niet vaak, maar hier wordt vermeld om op te merken dat de stap van de dissectie op dag 14 wanneer nodig kan worden geoptimaliseerd.
Er zijn een verscheidenheid van RPE differentiatie protocollen die in kosten, alsmede kweekmethoden, efficiëntie, kwantificering variëren en functionele beoordeling, de laatste geweest grondig herzien2. Wij verkiezen de 14-daagse methode gedetailleerde hier vanwege haar werkzaamheid, het aanpassingsvermogen en de toepasbaarheid op een breed scala van cel lijnen4,7,8. De cryopreservatie stap in dit protocol biedt ook een groot voordeel bij het creëren van een tussenliggende cel bank voor toekomstig gebruik, het vermijden van veel-op-veel variabiliteit in experimenten. Beginnend met slechts 4 putjes van de plaat van een 12-well, is het mogelijk om uit te breiden tot 6-Wells-platen bij passage 0 en T75 kolven bij passage 1 en 2. Bij passage 2 dag 3-5, wanneer de cellen nog steeds subconfluent zijn en niet pigment herwonnen hebben, is het mogelijk cryopreserve van tientallen miljoenen cellen en vervolgens ontdooien de volwassen RPE, aangewezen passage 3-daags 30, om te controleren van RNA expressie, eiwit expressie, groeifactor fagocytose secretie, enz. Ook hebben we de protocollen uit te breiden RPE voor maximaal 13 passages 19opgericht.
Vooruitblikkend, zal deze methode bijvoorbeeld gebruiken voor iPSC modelleren van oogbeschadigingen en/of ziekte en RPE generatie voor cellulaire therapie. Met betrekking tot de iPSC ziekte modelleren, is dit protocol momenteel gebruikt in het lab voor de productie van RPE uit CRISPR-gecorrigeerde lijnen met niet-gecorrigeerde besturingselementen uit de dezelfde patiënt. Dit protocol is verder aangepast aan synthetische substraten en xeno-vrij voorwaarden die handig zijn voor het naleven van de goede fabricagepraktijken die nodig is voor een cellulaire therapie.
Disclosures
Dr. Clegg is een mede-oprichter van regeneratieve Patch Technologies LLC.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het initiatief van de slinger voor de visie, het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (CIRM; subsidies DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 en TG2-01151), The Vermont Gemeenschap Foundation, het Breaux Foundation, en de Stichting bestrijding van blindheid Wynn-Gund translationeel onderzoek versnelling programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet | Baker | model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 | 6' Baker laminar flow biosafety cabinet |
| Dissection Hood | Labconco | Model 3970405 | laminar flow bench top |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ 1500 | heated stage |
| air-jacketed CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | 37 oC and 5% CO2 |
| inverted phase contrast microscope | Olympus | IX53 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factors and Reagents | |||
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Recombinant mouse noggin | R&D systems | 1967-NG-025 | |
| Recombinant human DKK-1 | R&D systems | 5439-DK-010 | |
| Recombinant IGF-1 | R&D systems | 291-G1-200 | |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| SU5402 FGF inhibitor | Santa Cruz Biotechnology | sc-204308 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Substrates | |||
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free | Corning | 356237 | extracellular matrix-based hydrogel (ECMH) |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free | Corning | 354277 | growth factor reduced ECMH |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| 1X Versene (EDTA) | Gibco | 15040066 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| 1X PBS (no calcium, no magnesium) | Gibco | 10010023 | |
| TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) | Gibco | 12563011 | |
| X-VIVO 10 (RPE supporting medium) | Lonza | BW04-743Q | |
| Y-27632 | Tocris | 12-541-0 (1254) | |
| CryoStor CS10 | BioLife Solutions | 210102 | cryopreservation medium |
| 1.2 mL Cryogenic Vial | Corning | 430487 | |
| Mr. Frosty (freezing container) | Nalgene | 5100-0001 | freezing container |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-2 | antimicrobial reagent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Equipment | |||
| Pipet-aid | Drummond | 4-000-101 | |
| 12-well culture plate | Corning | CLS3516 | Used during differentiation. |
| T75 flask | Corning | 430641 | Used during RPE maturation. |
| 6-well culture plate | Corning | CLS3513 | Used during RPE maturation. |
| cell scraper | Corning | 08-771-1A | Used during passages. |
| cell strainer | Falcon | 352340 | Used during passages before cell count. |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).
- Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).
- Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration. Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).
- Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate. Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).
- Leach, L. L., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).
- Choudhary, P., et al. Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage. Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Lane, A., et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), New York, N.Y. 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).
- Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
- Croze, R. H., et al. ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium. Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).
