Summary
ويقدم بروتوكول microinjection بسيطة وفعالة لتحرير الجينات في أجنة سمك السلور قناة باستخدام نظام كريسبر/Cas9. في هذا البروتوكول، دليل الكشف وكانت ميكروينجيكتيد Cas9 البروتين في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول بانقطاع قناة سمك السلور اثنين من الجينات المتصلة بجهاز المناعة.
Abstract
تم تسلسل الجينوم الكامل من سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus،، مما يؤدي إلى المزيد من الفرص لدراسة وظيفة الجينات سلور قناة. وقد استخدمت الجينات بالضربة القاضية لدراسة هذه وظائف الجينات في فيفو. بانتظام مجمع إينتيرسباسيد في البروتين قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر المرتبطة 9 (كريسبر/Cas9) نظام أداة قوية تستخدم لتحرير الجينوم تسلسل الحمض النووي لتغيير وظيفة الجينات. بينما كان النهج التقليدي لإدخال مرناً كريسبر/Cas9 في الأجنة خلية مفردة من خلال microinjection، وهذا يمكن أن يكون عملية بطيئة وغير فعالة في سمك السلور. ويرد هنا، بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة مع البروتين كريسبر/Cas9. بإيجاز، كانت البيض والحيوانات المنوية إخصاب المجمعة ومصطنعة ثم يقوم. ونقل البويضات المخصبة إلى طبق بتري يحتوي على الحل هولتفريتير. معايرة حجم الحقن وثم دليل استهداف الكشف/Cas9 تم ميكروينجيكتيد عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المحتوية على المجال محول جزيء (تيكام 1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. خروج المغلوب الجينات كانت ناجحة حيث تم تأكيد إينديلس بتسلسل الحمض النووي. شملت فراميشيفت التعديلات تسلسل البروتين المتوقعة بسبب هذه الطفرات واقتطاع البروتين بسبب codons توقف سابق لأوانه.
Introduction
Microinjection أسلوب مختبرية شائعة المستخدمة لتسليم كمية صغيرة من مادة مثل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين، والجزيئات الكبيرة الأخرى في الخلايا أو الأجنة من خلال زجاج شعرية1. Microinjection تتم باستخدام إعداد المعدات الخاصة بما في ذلك من ميكروينجيكتور، ميكرومانيبولاتور، و مجهر2. وقد استخدمت التقنية باحثون وراثيا تعديل العديد من الكائنات الحية من خلال توليد الوراثي والجينات بالضربة القاضية، والعلاج الجيني، بهدف فهم ديناميات المكونات داخل الخلايا3،4 , 5.
سمك السلور قناة (Ictalurus punctatus) من أنواع سمك السلور الأكثر شعبية في تربية الأحياء المائية وأنشطة الصيد الترفيهي في الولايات المتحدة. هناك حاجة متزايدة لدراسة الجينوم الوظيفي في سمك السلور القناة، وتسلسل الجينوم الكامل لسمك السلور قناة يعزز فائدة التقدم الذي أحرز مؤخرا في أدوات التحرير الجينوم6،7. فهم وظيفة الجينات ليس من شأنه أن يثري البحوث التي تجري على سمك السلور، بل قد يؤدي أيضا إلى زيادة فعالية برامج التحسين الوراثي لتعزيز صناعة سمك السلور. حالما يتم تحديد الجينات الحاسمة لسمة معينة للفائدة، يمكن استخدامها لتحسين وراثيا إنتاج سمك السلور عن طريق تحرير الجينوم لتوليد الآليلات مفيدة، التحديد لهذه الآليلات، قمع الآليلات الضارة، نقل الآليلات مفيدة من خلال ترانسجينيسيس أو بعض تركيبة من هذه الخيارات. الجمع بين الجينات أفضل لمختلف الصفات المفيدة تجارياً من مختلف الأنواع في الأسماك أحد أن يحسن الإنتاجية والربحية ل عمليات إنتاج الأسماك8كثيرا.
خروج المغلوب الجينات أسلوب مباشر لدراسة وظائف الجينات في فيفو. سوف وراثة الطفرات على مستوى الحمض النووي من قبل الأجيال القادمة التي سوف تسهل دراسة آثارها في مختلف الأجيال. الجينوم مختلف أدوات التحرير تم المتقدمة بما في ذلك الزنك الإصبع نوكليسيس (زفنس)، النسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس)، وتجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر-المرتبطة البروتين 9 (كريسبر/Cas9 ) نظام9،10،،من1112.
نظام كريسبر/Cas9 هو أداة قوية وفعالة التي تم استخدامها لتحرير الجينوم تسلسل الحمض النووي بما في ذلك خروج المغلوب الجينات في الأسماك إلى الجيش الملكي النيبالي تسترشد خاصة بالموقع الحمض النووي انشقاق5،13. يتألف النظام من دليل رنا (جرنة)، الذي يحدد تسلسل المستهدفة في الجينوم وإنزيم اندونوكليسي الحمض النووي، Cas9. يمكن تصميم نظام كريسبر/Cas9 لاستهداف أي تسلسل في الجينوم مع العديد من المزايا زفنس وتالينس: (1) انخفاض التكاليف الهندسية (2) أسهل ملزمة محددة (3) أكثر من دليل الحمض النووي الريبي لتسلسل المستهدفة، وتخفيض الطفرات خارج الهدف (4) يمكن استهداف سلاسل متعددة مع جرنة مختلفة في نفس الوقت (5) معدل الطفرات عالية في الجينات التي يمكن أن لا تكون المتحولة بواسطة تالينس، وتحسين الخط (6) انتقال معدل الطفرات ليصل إلى 6-fold عند زفنس وتالينس14، بالمقارنة 15،16،،من1718.
هو الأسلوب البديل الرئيسي ل microinjection انهانسر، التي تطبق فيها النبضات الكهربائية للأجنة أو الخلايا لزيادة نفاذية الغشاء وامتصاص الجزيئات البيولوجية19،20. عدة من الأسماك المحورة وراثيا تم إنشاؤها باستخدام انهانسر مثل الميداكا (Oryzias latipes)، الزرد (دانيو rerio)، سلمون شينوك (Oncorhynchus تشاويتشا)، وسمك السلور القناة، الشبوط (Sparus صربا)، و المشتركة الكارب (Cyprinus carpio)21،،من2223،24،،من2526.
وقد استخدمت انهانسر توفير البروتين بلازميد الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، و Cas9 لخروج المغلوب الجينات. في خلايا الثدييات، Cas9/جرنة بلازميد الحمض النووي، مرناً Cas9/جرنة، ومجمعات البروتين/جرنة Cas9 تم تسليمها باستخدام انهانسر وكانت المعدلات الطفرات أعلى باستخدام مجمعات البروتين/جرنة Cas9 لمعظم شروط اختبار انهانسر27. حبليات أسسيديان (سيونا إينتيستيناليس)، كانت تالينس الإعراب عن نيات اليكتروبوراتيد في البيض المخصب للحث على خروج المغلوب من جينات متعددة28. وكانت زفنس الإعراب عن نيات بلازميد اليكتروبوراتيد لضرب الهرمون في سمك السلور القناة29. ومع ذلك، بمجرد إدخال في الخلية، سوف تحتاج ثوابت بلازميد نسخها للجيش الملكي النيبالي وترجم إلى البروتينات الوظيفية قبل أن يمكن توجيهها بتسلسل الحمض النووي المطلوب، والمرجح أن تأخير وقت الطفرات microinjection من الجيش الملكي النيبالي بالمقارنة مع/ البروتين. كما يتم وضع جنين، يزيد الطفرات تأخر mosaicism المؤسسين حقن. وباﻹضافة إلى ذلك، التعبير المعدلة وراثيا غير المحتمل أن يحقق مستوى التعبير الممكنة مع microinjection، خفض كفاءة الطفرات.
كوسيلة لإدخال أدوات التحرير الجينوم في الخلايا، microinjection مزايا عديدة على مدى انهانسر. ويمكن إدخال الجينوم تحرير جزيئات موثوق في الخلايا أو الأجنة من خلال microinjection30. هناك حاجة أقل مواد الحقن. فمن السهل لتحديد كميات المواد التي تحقن. تحقيق طفرة أعلى يمكن أن تكون معدلات مع mosaicism منخفضة في الأسماك مؤسس الذي من شأنه أن يحسن نقل الخط من الطفرات و1. أقل مؤسس الأسماك تحتاج إلى تحليل لإنتاج الجيل الأول، نظراً لارتفاع معدل التحور. في انهانسر، المزيد من الأسماك مؤسس بحاجة إلى تحليل مما يزيد من التكاليف. ومع ذلك، بقاء الأجنة سلور قناة ميكروينجيكتيد أقل من اليكتروبوراتيد منها، على الرغم من أن هذا يمكن التغلب عليها عن طريق حقن الأجنة أكثر31،32. في القناة سمك السلور وبقاء الأجنة ميكروينجيكتيد صفار البيض تراوحت من 16 إلى 55%، اعتماداً على الجينات المستهدفة وجرعة البروتين جرنة/Cas932.
من الناحية الفنية تطالب microinjection العادية أجنة سمك السلور ومضيعة للوقت، ومع ذلك، بروتوكول microinjection بروتين كريسبر/Cas9 سريعة وفعالة ويرد لاجنة سمك السلور قناة. يتطلب هذا البروتوكول أقل من الوقت والخبرة منذ حل البروتين كريسبر/Cas9 يحقن صفار البيض من إحدى خلايا الأجنة. يمكن حقن مئات بويضات المخصبة في ح 1 (تقريبا الوقت اللازم لانقسام الخلية الأولى تحدث). للتحقق من البروتوكول، خرج اثنين من الجينات المتعلقة بقابلية المرض في قناة سمك السلور وعدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على محول جزيء (TICAM1) الجين والجين يكتين (ربل) ملزمة rhamnose. 1 تيكام تشارك في مسار الإشارات بدأها عدد القتلى مثل مستقبلات (TLR) 3. 1 تيكام كان هائلا في سمك السلور القناة، upregulated عقب التحدي البكتيرية مع إيكتالوري ادواردسيلا، بينما كان دوونريجولاتيد في سمك السلور الزرقاء، الأنواع المقاومة إيكتالوري هاء-33. ربل تلعب دوراً هاما في الإصابة المبكرة مع كولومناري فلافوباكتيريوم، المسبّب للمرض كولومناريس، حيث الحادة وسجلت upregulation قوية في سلالة كولومناريس عرضه قناة قرموط بالمقارنة مع 34من سلالة كولومناريس المقاوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت هذه التجربة في وحدة بحوث الوراثة السمكية، هاء دبليو شل مركز بحوث مصائد الأسماك، وجامعة أوبورن، بن. بموافقة جميع البروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذه التجربة برعاية الحيوان المؤسسية جامعة أوبورن واستخدام اللجنة (الاتحاد الأفريقي-IACUC) قبل الشروع التجربة. يمكن الاطلاع على قائمة بالمعدات واللوازم التي استخدمت في هذه التجربة في "الجدول المواد". فيما يلي خطوات وإجراءات إعداد و microinjection أجنة سمك السلور القناة خلية واحدة كما هو موضح في الشكل 1.
1-الحضنة اختيار الأسهم والتفريخ
- اختر سمك السلور قناة صحية الأسهم الحضنة من سلالة أو الخط الوراثي للفائدة. قناة سمك السلور الذكور والإناث يجب أن يحمل الخصائص الجنسية الثانوية جيدة.
- حدد الذكور التي لها رأس عضلي واسع الذي أوسع من بقية أجسادهم مع الحليمة الأعضاء التناسلية نمواً جيدا. الألوان الداكنة وتندب الجروح من المعارك الإقليمية أيضا علامات الاستعداد الجنسي. حدد الإناث التي لها رؤساء التي أضيق من بقية أجسادهم، ويكون البطن لينة، ملموس، جيدا مقربة. للتأكد من دقتها وتجنب مؤكدا أن الأسماك أثناء المناولة الأولى، وقف تغذية الإناث 2-3 أيام قبل دراسة عن استعدادها لوضع البيض.
- أداء الأسماك معالجة بسرعة، ولكن بعناية. للحد من التعامل مع الإجهاد، القيام بجميع الإجراءات التي تتطلب التعامل مع الإناث أثناء الضغط على الأسماك في تفريخ أكياس (مش حجم 32 مم).
- قبل حقن الهرمون للحث على التبويض، قياس وزن الجسم للإناث.
- شنق في أكياس التفريخ مع الإناث داخل في تدفق من خلال الدبابات مع تدفق المياه المستمر وتهوية كافية.
- تحميل أسيبتيكالي، إيمبلانتير له إبرة ز 14 مع 85 ميكروغرام/كغ من الإفراج عن هرمون التناظرية (لهرها) زرع الهرمون. شطف الحقن (العضلات الظهرية) مع المحلول الملحي المعقم 0.9% قبل الحقن. إدراج في إيمبلانتير بزاوية 45 درجة، والإفراج عن عملية الزرع. سحب بإبرة ومرر الحقن مع كرة القطن سابقا غارقة في الإيثانول 70%.
- مكان حقيبة التناسل في خزان القابضة حيث أن الأسماك هي مغمورة تماما في الماء 15-20 سم تحت سطح الماء. تهوية كافية (أعلاه 5 جزء في المليون حله الأكسجين) ونوعية المياه الجيدة مهمان إباضة بيض ذات جودة عالية.
- التنبؤ بوقت الإباضة بناء على درجة حرارة الماء باستخدام العلاقة درجة ساعة (ح)35. وقت استجابة درجة-ح = الوقت بين الحقن بالهرمونات والتبويض (ح) * المياه درجة الحرارة (درجة مئوية). على سبيل المثال، وقت استجابة درجة-ح 900-1000، أنثى من المتوقع أن تفرخ في ح 36-40 من وقت حقن الهرمونات عند 25 درجة مئوية. عادة، يتم الاختيار الأولى للبيض في حوالي 36 ساعة بعد الحقن بالهرمونات، ومن ثم في الفاصل الزمني ح 4.
- للتحقق من وجود الإباضة، بلطف رفع حقيبة التناسل فوق سطح الماء بينما كنت تبحث عن البيض المرفقة داخل حقيبة التناسل. رؤية البيض على الأقل 10 يشير إلى هذا ذكر البيض وعلى استعداد لتجريد اليد.
2. إعداد الحيوانات المنوية
ملاحظة: الحيوانات المنوية يمكن إعداد قليلة ح قبل وقت الإباضة المتوقع.
- Euthanize الذكور بضربه الرأس دون تخدير، طرقي منذ التخدير قد يكون له تأثير سلبي على عدد الحيوانات المنوية الحركة.
- جمع الخصيتين في مقلاة صغيرة وزنها وإزالة أي أنسجة وغسلها مع 50 مل من المحلول الملحي 0.9% لإزالة الدم، إذا لزم الأمر. الخصيتين متطورة بيضاء مع كثير من الإسقاطات فيليفورم ( الشكل 2).
- تحديد وزن الخصيتين.
- إعداد الحل الحيوانات المنوية لاخصاب البويضة، نقل الخصيتين إلى مركز سم 1002 100 ميكرون باستخدام الملقط. أمثال مش مع الخصيتين داخل، سحق الخصيتين وتصفية الحيوانات المنوية في أنبوب جمع 50 مل. يمكن أن يتم ذلك عن طريق تطبيق الضغط على الخصيتين داخل الشبكة ضد حافة أنبوب جمع عن طريق الإبهام. استخدم المحلول الملحي 0.9% لغسل الحيوانات المنوية من الشبكة في أنبوب جمع. يمكن إضافة المحلول الملحي حتى 10 مل/ز الخصيتين.
- تحديد تركيز الحيوانات المنوية، وتحقق من حركية والجدوى.
ملاحظة: يمكن تحديد تركيز قبل عد الخلايا المنوية بحجم مخفف معروفة في ميلت استخدام هيموسيتوميتير. وبدلاً من ذلك، يمكن تقدير كثافة الحيوانات المنوية بتقييم الكثافة البصرية ميلت باستخدام جهاز المطياف الضوئي. في هذا الأسلوب، يتم مقارنة الامتصاص في الطول الموجي نانومتر 505 إلى تخطيط عنصر تحكم الذي تم إعداده مسبقاً لامتصاص تركيزات مختلفة من الحيوانات المنوية36. يمكن التحقق من عدد الحيوانات المنوية الحركة تحت المجهر كالوقت من التنشيط للحيوانات المنوية حتى وقف الحيوانات المنوية الحركة (وتسمى المدة حركية)37. يمكن تحديد صلاحية الحيوانات المنوية بواسطة تلطيخ الحيوانات المنوية مع الأصباغ انتقائية مثل تريبان الأزرق، الذي سيكون وصمة عار الخلايا المنوية غير قابل للحياة فقط، بينما تبقى الحيوانات المنوية سليمة أونستينيد. ومع ذلك، هذا ليس ضروريا إذا الخصيتين متطورة لهذه الإجراءات microinjection،. - تخزين الحيوانات المنوية في المحلول الملحي 0.9% من الخطوة 2، 5 في 4 درجات مئوية، واستخدم خلال 24 ساعة بعد التحضير.
3-البيض جمع والتسميد
- تطبيق طبقة رقيقة جداً من تقصير ليبلغ قطرها 20 سم نظيفة جافة التفريخ عموم الخضر.
- وضع الأنثى في حل مخدر تحتوي على 100 جزء من المليون من فلورو أوكتان المشبع الميثان تريكيني مخزنة مع بيكربونات الصوديوم (يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للحل النهائي 7.0) حتى يتم تخديره كلياً38من الأسماك.
تنبيه: قد تكون مزعجة إذا استنشق، بلعها أو امتصاصه عن طريق الجلد تريكيني الميثان المشبعة بالفلور أوكتين. - بعناية إزالة الأسماك من حقيبة التناسل وتراجع أنه ملحي 0.9% يغسل الحل مخدر. جاف السمك تماما باستخدام منشفة نظيفة، تجنب إزالة طبقة المخاط على سطح جسم الأسماك.
- تطبيق تقصير الخضر على المنطقة المحيطة التنفيس، بما في ذلك زعانف الحوض، لمنع مرفقات البيض خلال تجريد اليد.
- قطاع اليد البيض في عموم التفريخ مدهون بتطبيق ضغط لطيف على المبيض. البيض جيدة ينبغي أن تتدفق بحرية ويكون أصفر اللون الذهبي، ويكون الحد الأدنى أو لا كتل أو تجلط الدم (الشكل 2). تجنب الاتصال بين البيض والماء قبل الإخصاب، كما أن المياه يمكن أن تحفز الإغلاق micropyle.
- لتسميد البيض ل microinjection، نقل البيض 200-300 إلى وعاء التفريخ مدهون. يمكن استخدام التسميات معمل بلاستيك مدهون كملعقة لنقل البيض إلى عموم التفريخ مدهون. أضف 1 – 2 مل حل الحيوانات المنوية (من الخطوة 2، 5) البيض وتخلط برفق. يجب أن تكون نسبة الحيوانات المنوية للبويضة تقريبا 11,000 الحيوانات المنوية/البيض.
- إضافة المياه العذبة للبيض لتنشيط الحيوانات المنوية والبيض. إضافة ما يكفي من الماء لتغطية البيض قليلاً. بلطف دوامة البيض للاخصاب س. 30 ينبغي أن يحدث في 1-2 دقيقة. من المهم أن تخصب البيض التي يتم ترتيبها في طبقة واحدة. بيض سمك السلور التمسك ببعضها البعض مما يجعل من الصعب على ميكروينجيكت طبقات متعددة من الأجنة.
- إضافة المزيد من المياه العذبة إلى البيض المخصب والسماح للبيض تتصلب لمدة 10 – 15 دقيقة.
- تغطية عموم التفريخ التي تحتوي على البيض المخصبة المتبقية بمنشفة مبللة لمنع تجفيف وتخصب خلال بضع ساعات. التسميد يمكن القيام به بطريقة متعاقبة، على سبيل المثال المخصبة، دفعة واحدة من 200-300 البيض يمكن أن يكون كل 30-60 دقيقة لضمان إمدادات مستمرة من الأجنة في مرحلة خلية واحدة ل microinjection والتحكم غير حقن الأجنة. تجنب الاتصال بين منشفة رطبة والبيض البيض يجوز التمسك بمنشفة رطبة مما يجعل من الصعب إزالتها. في هذا البروتوكول، كفاءة ميكروينجيكتيد البيض المخصبة داخل ح 2 – 3 بعد تجريد وكان نجاح مماثل كالبيض المخصبة فورا بعد تجريد.
4-إبرة سحب وتحميل
- سحب زجاج البورسليكات OD 1.0 مم الشعرية في الإبر 2 (الشكل 3). تخزين الإبر في علبة ورق بقطعة من الأسفنج وبذلت فيه شقوق عديدة. تجنب كسر الإبرة، ينبغي أن يكون قطر الأسفنج أصغر من طول الساق الإبرة.
- فتح طرف إبرة عن طريق كسر قطعة صغيرة من المنطقة أنحف الإبرة استخدام كائن حادة. وبدلاً من ذلك، افتح الإبرة معسر قبالة المنطقة أنحف من التلميح بالملقط تحت المجهر.
- تحضير حل الحقن بخلط gRNA(s) مع البروتين Cas9. ويمكن أيضا حقن أنواع أخرى من الحمض النووي الريبي أو البروتين مع نفس الإجراء. في هذا البروتوكول، وصممت للهدف اثنين من الجينات ذات الصلة المناعي قناة سمك السلور، عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المحتوية على المجال محول جزيء (TICAM1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات جرناس والمعدة وفقا لشاه وآخرون. باستخدام الدقة العالية [تق] [بولمرس]32،39. كانت أهداف المجينية جرناس 5 ' GGA GGT جا الائتلاف CGT CGA GGA 3' للجينات تيكام 1 (الشكل 4) و GGA ضريبة تحويل العملة TGA غيغاطن GGA جا دايمنشن ز 3 '5' لتسلسل إكسون 1 من الجينات ربل مع بروتوسباسير عزر المتاخمة (بام) مسطر (الشكل 6).
- أهداف دليل الحمض النووي الريبي الانفجار ضد الجينوم سلور قناة تسلسل وتحديد تلك مع لا مواقع خارج الهدف المحتمل.
- إضافة الفينول الأحمر إلى لون خلط البروتين جرنة/Cas9 إلى ثلث الحجم الإجمالي.
- ضبط تركيز النهائي لمزيج البروتين جرنا/Cas9 مع نوكلياسي المياه مجاناً بحيث يتم حقن كل جنين مع 50 nL تحتوي على حوالي 2.5 نانوغرام جرنا و 7.5 نغ Cas9 البروتين. احتضان المخلوط لمدة 10 دقيقة على الجليد قبل الاستخدام.
- مع ميكرولوادير، تحميل 5 – 10 ميليلتر من خليط جرنا/Cas9 إبرة حقن بإدراج ميكرولوادير الجذعية إبرة وطرد المخلوط ببطء أثناء تراجعه نصيحة ميكرولوادير (الشكل 3). تجنب تصيد فقاعات الهواء داخل.
- إرفاق الإبرة لصاحب ميكروبيبيتي وضمان اتصال ضيق ثم إرفاق الحائز ميكرومانيبولاتور. ضمان حرية حركة مستقرة. تطبيق الضغط على microinjection بفتح اسطوانة النيتروجين وضبط منظم الضغط.
ملاحظة: حجم الحقن يمكن أن تتأثر الضغط، وقطر فتحه الإبرة، ومدة الحقن. لتحديد حجم لحقن, حقن قطره الزيوت المعدنية على هيموسيتوميتير. إذا لزم الأمر، يمكن تعديلها الضغط، ومدة الحقن، والإبر القطر لزيادة أو إنقاص حجم الحقن. حقن عدة مرات في الزيوت المعدنية لضمان حجم متسقة.
5-microinjection أجنة سمك السلور
- تطبيق طبقة رقيقة جداً من الخضروات تقصير إلى طبق بتري نظيفة 100 مم.
- استخدام تسمية معمل بلاستيك مدهون، نقل البيض 50 – 100 من عموم الإخصاب إلى طبق بتري وغطاء لهم مع الحل هولتفريتير (جدول المواد). قم بمحاذاة البيض ضد بعضها البعض في طبقة واحدة. وينبغي عقد هذه المحاذاة البيض في مكان أثناء عملية microinjection.
- ضع طبق بيتري مع البيض في مرحلة المجهر وأنه عقد مع جهة واحدة. أقل الإبرة باليد الأخرى (الشكل 3) حتى أنه يثقب المشيمة وصفار البيض في حركة واحدة سلسة. ينبغي أن يكون غيض الإبرة أقرب ما يكون إلى بلاستوديسك قبل تسليم مواد الحقن.
- خفض دواسة لتسليم مواد الحقن إلى الصفار. إذا لم يكن بلاستوديسك واضحة للعيان، ثم يمكن أن تنتشر بحقن المواد في مواقع مختلفة في صفار البيض. للقيام بذلك، يتم إدخال الإبرة في نهاية بكثير من صفار البيض، ثم تتم كئيبة على دواسة وسحب الإبرة في نفس الوقت لنشر مواد الحقن من خلال مجالات مختلفة من صفار البيض. ما يصل إلى 50 نانوليتيرس يمكن يكون حقن صفار البيض لسمك السلور قناة الأجنة، ومع ذلك، كمية البروتين جرنا/Cas9 بحاجة إلى أن يكون الأمثل لكل الجينات لتحقيق أفضل النتائج للطفرة الجنين ومعدل البقاء على قيد الحياة32.
- سحب الإبرة بشكل سلس حتى لا يؤدي إلى الأضرار البيض. تحريك الطبق بيتري لحقن البيض آخر بنفس الإجراء. تجنب حركة طبق بتري أثناء عملية الحقن كهذه قد تلحق الضرر البيض أو كسر الإبرة. إزالة البيض التي تمزق أو تلف بسبب microinjection. الحقن يمكن أن تبدأ في 15-20 دقيقة بعد الإخصاب ويستمر طالما الأجنة لا تزال في مرحلة خلية واحدة (حتى حوالي 60-90 دقيقة بعد الإخصاب).
- مكان حقن الأجنة مرة أخرى في الحل في هولتفريتير مع 10 أجزاء من المليون من الدوكسي وتهوية لطيف مستمر لمدة 6-7 أيام حتى الفقس40. تغيير الحل يوميا وإزالة أجنة ميتة.
6. الكشف عن الطفرة
- عشوائياً، جمع عدة أجنة حقن في ح 72 وظيفة الإخصاب، وإزالة الصفار واستخراج الحمض النووي. وتشمل 3-5 غير حقن الأجنة كعنصر تحكم.
ملاحظة: يمكن استخراج الحمض النووي من الأجنة بعد إزالة قشرة البيض والمواد صفار البيض باستخدام الهضم بروتيناز ك و هطول الأمطار الإيثانول32. - تضخيم قطعة الحمض النووي الجينوم أهداف جرنة من كل الجينات، حيث من المتوقع أن تحدث، باستخدام دقة العالية من [تق] [بولمرس]32الطفرات المرافقة. تيكام 1، كبسولة تفجير 5 'جكتجكتجاتجتكتجاتاتج 3' (إلى الأمام) و 5 'جتككتككاكاكتككتجاج 3' (عكس) استخدمت لتضخيم 750 bp بينما بالنسبة ربل، كبسولة تفجير تكاتاتتككتجتاكتكاجتا 5 '3' (إلى الأمام) و 5 'أجاجاتاجتكاكاكاتكاتات 3' (عكس) كانت تستخدم ل تضخيم قطعة bp 375 من الجينات ربل.
- استخدام تفاعل PCR التالية: تصل إلى 20 ميليلتر بكر الصف المياه؛ مزيج 1 x عالي الدقة العازلة رد فعل إنزيم بوليميراز مع مجكل2، دنتب 0.2 مم، 0.4 ميكرون لكل من التمهيدي إلى الأمام وعكس نفس المجموعة، 100-300 نانوغرام الحمض النووي ووحدات 1.25 من مزيج إنزيم بوليميراز عالية الدقة. تنفيذ شروط ركوب PCR: تمسخ الأولى في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ دورات 35 من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، الصلب في 60 درجة مئوية مقابل 55 s تيكام، و 40 s ربل، ملحق في 72 درجة مئوية لدقيقة 1/كيلو بايت؛ والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- الكشف عن الأجنة متحولة باستخدام أسلوب الكشف عن الطفرات مثل تسلسل المنقي PCR المنتجات، مساح الطفرة الكشف والرزن، هيتيرودوبليكس التنقل المقايسة، فقدان إنزيم تقييد الاعتراف بالموقع، أو أي أسلوب الكشف عن الطفرات الأخرى مناسباً من أجل الهدف. في هذا البروتوكول، والكشف عن الأجنة متحولة باستخدام مقايسة الكشف عن الطفرات مساح 1 تيكام وفقدان إنزيم التقييد SapI قطع الموقع، فضلا عن تسلسل من منتجات بكر المنقي للجينات ربل.
- تحديد الآليلات متحولة، استنساخ متجهات تسلسل من مستعمرات فردية ومنتجات PCR. جاء الآليلات متحولة المعروضة في الشكل 4 ، و الرقم 6 من حقن الأجنة. منتجات PCR من ستة ميكروينجيكتيد وتم تجميع التحكم 3 أجنة لكل الجينات في أنبوبين منفصلين، أحدهما للأجنة ميكروينجيكتيد وأخرى لمراقبة الأجنة، سرعة المستنسخة وناقلات 86 1 تيكام ومتجهات 48 للجينات ربل متسلسلة، بما في ذلك 8 تسلسل ردود فعل من الأجنة غير حقن مراقبة 3 لكل الجينات.
- لتحديد مختلف الآليلات متحولة، مقارنة في التسلسل من الأجنة متحولة إلى تسلسل نوع البرية باستخدام أي أداة المحاذاة تسلسل الحمض النووي مثل الانفجار أو تي-البن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإثبات فعالية البروتوكول microinjection، كانت ميكروينجيكتيد جرناس مصممة لاستهداف قناة سمك السلور مستقبلات عدد القتلى/انترلوكين 1 التي تحتوي على المجال محول جزيء (TICAM1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات.
تيكام 1
تسلسل الحمض النووي من ناقلات من مستعمرات فردية من منتجات PCR المجمعة، المستنسخة كشف الطفرات إينديل التي يسببها في الجينات تيكام 1. وكان معدل الطفرات 79% في الأفراد 24 تم تحليلها. وترد أمثلة للطفرات في الشكل 4 و الشكل 5. آثار إينديل الطفرات في الجينات TICAM1 الترميز تسلسل من سمك السلور قناة على البروتين تنبأ موضحة طول وتسلسل مقارنة بتسلسل نوع البرية في الجدول 1. طفرات الحذف أدى إلى إزالة عدد قليل إلى العديد من الأحماض الأمينية من البروتين المتنبأ بها، مما يؤدي إلى تغيير الإطار القراءة النهائية وقبل الأوان إنهاء الترجمة (الجدول 1).
في معظم الحالات، تم اقتطاع أكثر من 80% تسلسل البروتين المتوقعة نظراً كودون وقف سابق لأوانه. وفي هذه الحالات، تراوح طول ببتيد توقع 91 106 من مخلفات الأحماض الأمينية (نوع البرية 1 تيكام على 520 من الأحماض الأمينية المخلفات). ومن المتوقع الطفرات مع البروتين الغاية مبتوراً لإنتاج بروتين غير وظيفية. في حالة 87 bp الحذف الطفرة (الجدول 2و الشكل 4)، أزيلت 29 من الأحماض الأمينية من البروتين دون تغيير الإطار القراءة. عواقب مثل هذه الطفرات الفنية تحتاج إلى تقييم تجريبيا.
ربل
تسلسل الحمض النووي من ناقلات من مستعمرات فردية من منتجات PCR المجمعة، المستنسخة أكدت وجود الطفرات إينديل (الشكل 6). وكان معدل الطفرات 88% في 40 فردا تم تحليلها. الحذف تراوحت بين 5 bp إلى 183 شركة بريتيش بتروليوم، بينما يصل إلى 20 أدرجت شركة بريتيش بتروليوم. من المثير للاهتمام، تماما إزالة العناصر المحذوفة bp 183 إنترون 1، bp إكسون 2 و 19 من إنترون 2. نظرياً، ينبغي أن يؤثر هذا الربط من الجينات ربل منذ تم تحور مواقع لصق.
الطفرات إينديل آثار متغير على تسلسل البروتين المتوقعة عند مقارنتها بتسلسل البروتين نوع البرية (مخلفات الأحماض الأمينية 308) (الجدول 2). أكثر من 70% إينديلس أسفرت عن بروتين مبتوراً متوقع هو 10% أو أقل من طول نوع البرية البروتين. وكان ببتيد المتوقعة في بعض إينديلس (الطفرة رقم 4 و 5 و 6)، الأحماض الأمينية أقل من 10. أسفرت حالتان فقط (رقم 2 و 3) الحذف من 2 و 4 من الأحماض الأمينية في البروتين توقع دون تغيير الإطار القراءة التي قد أو قد لا تؤثر على وظيفة البروتين.
كانت الناجم عن الطفرات الاليلي ثنائية مع اثنين آخرين جرناس (الأسود et al., غير منشورة) حيث كانت تحور كلا الكروموسومات في بعض الأجنة ولم يتم اكتشاف لا نوع البرية الآليلات. بالتفريد جل من منتجات PCR، كان هذه الأجنة واحد فقط من الفرقة التي كانت أقصر من الفرقة البرية نوع (أكثر من 200 شركة بريتيش بتروليوم الحذف). تسلسل الحمض النووي من منتجات PCR المستنسخة أكدت وجود واحد فقط متحولة اليل في جميع ناقلات متسلسلة من جنين واحد (الطفرة بياليليك متماثل) بينما هما الآليلات المسخ حدث في الأجنة الأخرى (بياليليك متخالف الطفرة). في بعض الأجنة الأخرى التي كانت الفسيفساء للطفرة، تم اكتشاف المسخ (تصل إلى 4 الآليلات) ونوع البرية الآليلات بتسلسل الحمض النووي من منتجات PCR المستنسخة.
الشكل 1 : ملخص إجراءات microinjection سلور قناة واحدة-الخلية (Ictalurus punctatus) الأجنة مع البروتين جرنة/Cas9 لضرب عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على محول جزيء (TICAM1) الجينات ورهامنوسي ربط الجين يكتين (ربل)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الخصيتين وبيض سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus . (أ) الخصيتين متطورة من الذكور سمك السلور القناة بيضاء مع كثير من الإسقاطات فيليفورم. (ب) هي جيدة من البيض من الإناث سلور قناة الذهبي-أصفر اللون مع الحد الأدنى أو لا تجلط الدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : ميكرونيدلي سحب، تحميل و microinjection من سمك السلور القناة خلية واحدة، Ictalurus punctatus ، الأجنة. (أ) إبرة سحب مع ساحبة إبرة عمودي. هيكل إبرة وقطر تتأثر بالحرارة من خيوط السخان وقوة اللولبي. (ب) ميكرونيدلي التحميل مع مزيج كريسبر/Cas9 استخدام تلميح ميكرولوادير. (ج) ترتيب أجنة سمك السلور القناة في طبق بتري 100 ملم التي تحتوي على الحل هولتفريتير. يتم تخفيض ميكرونيدلي حتى تلامس ويثقب البيضة. (د) تكبير قسم من لوحة ج عرض عملية اختراق البويضة. مذكرة نصيحة إبرة يدفع غشاء المشيمة إلى الداخل ولكن قد اخترقت ليس بعد. وقد أجنة حقن مواد الحقن حمراء داخل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : كريسبر/Cas9 الناجم عن الطفرات في عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على محول جزيء (TICAM1) الجينات الترميز تسلسل من سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus . تسلسل الأزرق يمثل الحافز بروتوسباسير المتاخمة (بام) بينما التسلسل الأخضر الذي يمثل هدفا جرنة. من المتوقع أن يحدث في موقع المثلثات الحمراء 2 ضعف حبلا كسر الناجمة عن البروتين Cas9. يتم تعيين الطفرات الأرقام من 1 إلى 8. ويمثل خط متقطع الذي يناظر كل اندفاعه النوكليوتيدات تم حذفه من طفرات الحذف. تسلسل الحمراء هي عمليات الإدراج بينما الأرجواني يمثل طفرة الاستبدال. وتمثل كسور 78 عدد الآليلات تحور في تسلسل ردود الفعل (مثلاً، 3/78 يعني أن اليل اكتشفت في 3 تسلسل ردود فعل من إجمالي 78 ردود) 78. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : إينديل الطفرات في سلور قناة، Ictalurus punctatus ، عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على محول جزيء (TICAM1) الجينات الترميز تسلسل الناجمة عن microinjection جرنة/Cas9 البروتين في سمك السلور قناة واحدة-خلية الأجنة كما يتضح من تسلسل الحمض النووي تشروماتوجرام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : كريسبر/Cas9 الناجم عن الطفرات في rhamnose ملزمة يكتين (ربل) الجينات من سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus . تسلسل اكسونيك أحرف كبيرة بينما إينترونيك تسلسل أحرف صغيرة. تسلسل الأزرق يمثل الحافز بروتوسباسير المتاخمة (بام) بينما التسلسل الأخضر الذي يمثل هدفا جرنة. فاصل حبلا مزدوج الناجم عن Cas9 البروتين كان من المتوقع أن يحدث في موقع المثلثات الحمراء 2. يتم تعيين الطفرات الأرقام من 1 إلى 9. ويمثل خط متقطع الذي يناظر كل اندفاعه النوكليوتيدات تم حذفه من طفرات الحذف. تسلسل الحمراء هي عمليات الإدراج. الكسور تمثل 40 عدد الآليلات تحور في تسلسل ردود أفعال مثل 2/40 40 يعني أن اليل اكتشفت في 2 تسلسل ردود فعل من إجمالي 40 من ردود الفعل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الطفرة | الإدراج | الحذف | صافي التغيير (Δ) | طول البروتين (الأحماض الأمينية) | تغيير فراميشيفت | كودون التوقف قبل الأوان | تسلسل البروتين المتوقعة | |||
| WT | 0 | 0 | 0 | 520 | لا | لا | مايتيلفديكبتيلكفنرنتففنسبليرسيسج سرستينيسجيهتايكليمجاسلقبرريستيفك فقكيبكردسيبسلرستستسكسيسليسفست أتتننسنكيسربلبلكتبيسردجقنهيكبس بلفدهكبفيسفتكسيكسدبتبلقيراقليكفكف رقيبدخدتسيفتبكسبنيسجليكتفلسيبسج جكفجاقبفستسكبيستقيفجخدسفستيكق أسقييدمفياففيلهايدسيافرلكسرليسيس ستيجاتفسيدفافبجقستفرسفيداينسايفمل لتبنفنثلنيتنادسالمنسيكفخنتفيبل لبرانجلترنقمبفيلرتكنبلفيتردردتفيكم أكفلدلرنيقرقكسموتيقلفكقريكققو لقيكريكدفيقيسبرفريليقيققلكمققق هلقبياققتنشقجفبجربقسجبمبفرسبس بمبسيسجنموبقلبسنيهيقناكسيميجنستم تفججفدسجديدنف (بنك الجينات: NP_001187154.1 |
|||
| 1 | 0 | 5 | -5 | 104 | نعم | نعم | مايتيلفديكبتيلكفنرنتففنسبليرسيسج سرستينيسجيهتايكليمجاسلقبرريستيفك فقكيبكردسيبسلرستففقلقبرنقريهس هنق |
|||
| 2 | 5 | 40 | -35 | 94 | نعم | نعم | مايتيلفديكبتيلكفنرنتففنسبليرسيس جسرستينيسجيهتايكليمجاسلقبرريستيف كفقكيبكردسيبسلرستسنكشنق |
|||
| 3 | 0 | 87 | -87 | 491 | لا | نعم | مايتيلفديكبتيلكفنرنتففنسبليرسيسج سرستينيسجيهتايكليمجاسلقبرريستيفك فقكيبكردسيبسلرستسكتبيسردجقنهي أكبسبلفدكبفيسفتكسيكسدبتبلقيراق ليكفكفرقيبدخدتسيفتبكسبنيسجليكتفل سيبسججكفجاقبفستسكبياستقيفجخدسف ستيكقاسقييدمفياففيلهايدسيافرلكس رليسيستيجاتفسيدفافبجقستفرسفيدايينسا يفمللتبنفنثلنيتنادسالمنسيكفخن تفيبلبرانجلترنقمبفيلرتكنبلفيتردردت فيكماكفلدلرنيقرقكسموتيقلفكقريك ققولقيكريكدفيقيسبرفريليقيققلكمق ققهلقبياققتنشقجفبجربقسجبمبفرسب سبمبسيسجنموبقلبسنيهيقناكسيميجنست متفججفدسجديدنف |
|||
| 4 | 3 | 131 | -128 | 95 | نعم | نعم | مايتيلفديكبتيلكفنرنتففنسبليرسيسج سرستينيسجيهتايكليمجاسلقبرريستيفك فقكيبكردسيبسلرستسرافكسبج |
|||
| 5 | 1 | 0 | 1 | 106 | نعم | نعم | مايتيلفديكبتيلكفنرنتففنسبليرسيسج سرستينيسجيهتايكليمجاسلقبرريستيفك فقكيبكردسيبسلرستسيففقلقبرنقريه شنك |
|||
| 6 | 1 | 0 | 1 | 106 | نعم | نعم | مايتيلفديكبتيلكفنرنتففنسبليرسيسج سرستينيسجيهتايكليمجاسلقبرريستيفك فقكيبكردسيبسلرستستففقلقبرنقريه شنك |
|||
| 7 | 14 | 0 | 14 | 100 | نعم | نعم | مايتيلفديكبتيلكفنرنتففنسبليرسيسج سرستينيسجيهتايكليمجاسلقبرريستيفك فقكيبكردسيبسلرستسرستببرابتا |
|||
| 8 | 35 | 9 | 26 | 91 | نعم | نعم | مايتيلفديكبتيلكفنرنتففنسبليرسيسج سرستينيسجيهتايكليمجاسلقبرريستيفك فقكيبكردسيبسلرستستقف |
|||
الجدول 1: توقع آثار إينديل الطفرات في عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على محول جزيء (TICAM1) الجين الترميز تسلسل من قناة سمك السلور، Ictalurus punctatus، على طول البروتين (الأحماض الأمينية) وتسلسل المقارنة للحياة البرية اكتب تسلسل (WT).
| الطفرة | الإدراج | الحذف | صافي التغيير (Δ) | طول البروتين (الأحماض الأمينية) | تغيير فراميشيفت | كودون التوقف قبل الأوان | تسلسل البروتين المتوقعة | |||
| WT | 0 | 0 | 0 | 308 | لا | لا | ملفلكلسلفتلييسابجلمفسجينميتسيسدفقر لتسيتجليكفكستفيجرتنسيتكنتنربفسيفتفت نكالريتيادركنجلكيسيلكتدلجنبدبكفج تيكينتيدسينغرففيسيقجيستلدكجسدسي إيينانيجرجنسرتكسنجيلسقتقنتنسيابنتل سيفامكجكتكتفيسنتيفندبكفجتفكيلت فسييكترييفتسيستاتلنكجاهريكييسانيجرت دستكسجرباسقتسنكنسيتبدالنكيارسي اقسسيفباتنفففسدبكفجتيكيلتيفيسكف (بنك الجينات: AHJ14694.1) 53 |
|||
| 1 | 0 | 5 | -5 | 29 | نعم | نعم | ملفلكبلهلنيفسولنجفورييديلق | |||
| 2 | 0 | 6 | -6 | 306 | لا | لا | ملفلسلفتلييسابجلمفسجينميتسيسدفقرلت سيتجليكفكستفيجرتنسيتكنتنربفسيفتفتن كالريتيادركنجلكيسيلكتدلجنبدبكفج تيكينتيدسينغرففيسيقجيستلدكجسدسي ايينانيجرجنسرتكسنجيلسقتقنتنسيابنت لسيفامكجكتكتفيسنتيفندبكفجتفكيل تفسييكترييفتسيستاتلنكجاهريكييسانيجر تدستكسجرباسقتسنكنسيتبدالنكيارك يقسسيفباتنفففسدبكفجتيكيلتيفيسكف |
|||
| 3 | 0 | 12 | -12 | 304 | لا | لا | ميلسلفتلييسابجلمفسجينميتسيسدفقرلتسي تجليكفكستفيجرتنسيتكنتنربفسيفتفتنكا لريتيادركنجلكيسيلكتدلجنبدبكفجتيك يينتيدسينغرففيسيقجيستلدكجسدسييينا نيجرجنسرتكسنجيلسقتقنتنسيابنتلسيفا أمكجكتكتفيسنتيفندبكفجتفكيلتفسيي كتريفتسيستاتلنكجاهريكييسانيجرتدست تكسجرباسقتسنكنسيتبدالنكيارسيقس سسيفباتنفففسدبكفجتيكيلتيفيسكف |
|||
| 4 | 0 | 16 | -16 | 6 | نعم | نعم | مملفلن | |||
| 5 | 0 | 183 | -183 | 8 | لا | نعم | ملفلكري (بافتراض عدم تعديل الربط) | |||
| 6 | 1 | 183 | -182 | 5 | نعم | نعم | ملفل (بافتراض عدم تعديل الربط) | |||
| 7 | 1 | 0 | 1 | 31 | نعم | نعم | ملفلكتقبلهلنيفسولنجفورييديلق | |||
| 8 | 1 | 0 | 1 | 31 | نعم | نعم | ملفلكسقبلهلنيفسولنجفورييديلق | |||
| 9 | 20 | 0 | 20 | 18 | نعم | نعم | ملفلكاسشيسساسب | |||
الجدول 2: آثار الطفرات إينديل في rhamnose ملزمة الجينات يكتين (RBL) لقناة سمك السلور، Ictalurus punctatus، وتوقع طول البروتين (الأحماض الأمينية) والتسلسل بالمقارنة مع تسلسل نوع البرية (WT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقدم بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة لتحقيق الضربة القاضية الجينات. الحقن بالبروتين كريسبر/Cas9 في صفار البيض هي أبسط بكثير ويوفر الوقت ولا تتطلب تدريبا مكثفا بالمقارنة مع ميكروينجيكتينج بلاستوديسك الجنين خلية واحدة، وهي تقنية شائعة لمعظم نقل الجينات والجينات التحرير مع الأسماك 30 , 42-البروتوكول الحالي أثبتت نجاحها في حمل إينديلس في قناة سمك السلور الجينات 1 تيكام وربل. هذه إجراءات موثوق بها وفعالة إرساء الأساس لتوليد الجينات مستقبلا بالضربة القاضية في قناة سمك السلور. يمكن تعديل البروتوكول لاستهداف جينات أخرى في الجينوم سلور قناة باستخدام نظام كريسبر/Cas9، أو لتكييف تكنولوجيات الجينات الأخرى لسمك السلور، مثل ترانسجينيسيس tol2 بوساطة. كما أنها تستحق التقييم في أنواع سمك السلور أخرى مثل سمك السلور الزرقاء (فوركاتوس أولاً)، أكثر حساسية للتعامل مع بيض سمك السلور القناة، فيما يبدو، في مهمة تجارياً وبيضها. ومع ذلك، إذا الأخرى جرناس أو المواد النشطة بيولوجيا مثل الحمض النووي أو مرناً بالحقن، قد تحتاج البروتوكول الأمثل لتحديد أفضل الظروف.
في البروتوكولات ل microinjection أجنة الأسماك، إجراءات microinjection يمكن تقسيمها إلى فئتين رئيسيتين: حقن الخلايا الجنينية وحقن في صفار البيض. في الميداكا، تم حقن مورفولينوس في السيتوبلازم من خلية واحدة الأجنة لدراسة مختلف العمليات الإنمائية في فيفو41. في سمك السلور القناة، كانت ميكروينجيكتيد كريسبر/Cas9 مرناً استهداف الجين جنره إلى بلاستوديسك من الأجنة خلية واحدة30. في الثلاث – سبينيد ستيكليباك (موتر جاستيروستيوس)، كانت ميكروينجيكتيد بلاستوميريس لتوليد الوراثي والجينات بالضربة القاضية42. من ناحية أخرى، كانت الأجنة الزرد خلية واحدة صفار-حقن مورفولينوس للتلاعب بالبروتين "القلب للزجاج" (هيج)، التي ثبت أنها فعالة43. هذه 2 أنواع النهج لها مزاياها وعيوبها، لكن إذا كلاهما يثبت أن لها نفس فعالية لنفس الأنواع، microinjection صفار الأجنة خلية واحدة سيكون المفضل لعدة أسباب.
Microinjection صفار البيض أقل الغازية للأجنة، نظراً لعدم اختراق الإبر microinjection الخلايا الجنينية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن حقن أجنة كثيرة في فترة قصيرة في حين الأجنة لا تزال في مرحلة الخلية الأولى. ليست هناك حاجة محاذاة الأجنة في موقف معين. هذا كما أن توفير الوقت وتقليل الإجهاد معالجة الأجنة. في تفريخ الأسماك موسميا، هناك وقت التفريخ محدودة في جميع الإجراءات التي تحتاج إلى القيام به لتحقيق النجاح بالضربة القاضية. في سمك السلور القناة، يستمر موسم التفريخ لحوالي 2 أشهر44. ولذلك، سيتيح وضع بروتوكول microinjection السريع والفعال microinjection العديد من الأجنة لاستهداف العديد من الجينات في هذه الفترة الزمنية القصيرة. لحسن الحظ، يمكن ولدت قناة سمك السلور مصطنع لتوريد عدد كبير ما فيه الكفاية للأجنة ل microinjection للتغلب على ارتفاع معدل الوفيات بسبب إجراءات microinjection45. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التحكم في وقت الإخصاب التأكد من الأجنة في مرحلة واحدة-الخلية عند الحاجة.
Microinjection كريسبر/Cas9 التي يسببها إينديلس في أنواع الأسماك المختلفة بما في ذلك الزرد، سمك السلمون الأطلسي (Salmo سالار L.)، البلطي النيلي (Oreochromis niloticus)، وسمك السلور القناة، killifish المحيط الأطلسي (هيتيروكليتوس فوندولوس) 46، والمشترك الكارب5،30،،من4647،48،،من4950. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم نظام كريسبر/Cas9 لتعطيل الجينات في سمك الشبوط Labeo rohita عن طريق الإدراج مثلى اقترانها بوساطة أجنبية الحمض الخلوي الصبغي في الجينات المستهدفة51. في هذا البروتوكول، كانت الناجم عن نجاح إينديلس في تسلسل الترميز مع آثار مأساوية على تسلسل البروتين المتوقعة، بما في ذلك الطفرات فراميشيفت أدى إلى كودون وقف سابق لأوانه. آثار هذه الطفرات المظهرية لا تزال بحاجة إلى التحقيق فيها. مرناس مقتطعة من الأرجح المتدهورة عن طريق مرناً هراء بوساطة تسوس (القذائف) المسار، مما أدى إلى الحد من أو تثبيط للتعبير، وإذا أعرب، البروتينات مبتوراً سيكون على الأرجح لا يعمل52،53 .
وفي تجربتنا مع الجين ربل، نوعين من الطفرات (رقم 5 و 6) أدت إلى حذف 183 bp تماما إزالة نصف إكسون 1، إنترون 1، إكسون 2 وجزء من إنترون 2. من الناحية النظرية، قد يغير هذا النوع من الطفرات الربط قبل ربل-مرناً. الطفرات في مواقع لصق تحول دون قدرة سبليسيوسومي على الاعتراف إكسون54.
وفي الختام، وضع بروتوكول كفاءة موثوقة للجينات المستهدفة التحرير في القناة سمك السلور أمر حاسم لدراسة الجينوم الوظيفي، لا سيما بعد أن تم إثراء الموارد الجينية مع تسلسل الأخيرة من سمك السلور قناة الجينوم. الإجراءات المذكورة هنا بسيطة، والسريع ولكن كفاءة ويثبت نجاح تحقيق خروج المغلوب الجينات. واستهدف اثنين من الجينات، 1 تيكام وربل، لإثبات كفاءة استخدام microinjection كريسبر/Cas9 بالضربة القاضية. اعتماداً على ما يتم حقنها، يمكن تعديل البروتوكول لتشمل سائر المواد النشيطة بيولوجيا. فإنه يمكن تعديل أيضا ميكروينجيكت أسماك السلور أو الأنواع الأخرى التي لديها مماثلة بيضة بنية وتكوين. هذا البروتوكول وضع الأسس للجينات بالضربة القاضية في قناة سمك السلور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن أي تعارض في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث بجائزة NIFA وزارة الزراعة عام 2015-67015-23488 لمخروط روجر. يشكر المؤلفون الدكتور رونالد فيلبس عن وصف لمعايير اختيار الأسهم الحضنة في شريط الفيديو. الأسود أحمد وكريم خليل يود أن يشكر مكتب التربية والثقافة المصرية في واشنطن العاصمة لتمويل أبحاث الدكتوراه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reproboost implant | Center of Marine Biotechnology | Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, sterile filtered |
| Stereo microscope | Olympus | 213709 | For visualizing the eggs during microinjection |
| Microinjector | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MPPI-3 | For the delivery of the injection material into the embryos |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MM33 | For holding and controlling the movement of the injection needle. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | For loading injection solution into microinjection needles. |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 720 | For pulling microinjection needles |
| Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes. |
| Expand High FidelityPLUS PCR System | Roche Diagnostics, USA | For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation | |
| Borosilicate glass capillaries | Fisher Scientific | 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles. | |
| Petri dish | VWR | 25384-302 | For holding the embryos during the microinjection. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. | |
| Holtfreter`s solution | Home Made | 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. | |
| Doxycycline hyclate USP (monohydrate) | Letco Medical | 690904 | Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections. |
References
- Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
- Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
- Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
- Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
- Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
- Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
- Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
- Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
- Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
- Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
- Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
- Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
- Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
- Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
- Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
- Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
- Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
- Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
- Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
- Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
- Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
- Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
- Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
- Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
- Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
- Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
- Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
- Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
- Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
- Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
- Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
- Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
- Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
- Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
- Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).
