Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 Protein i kanal havkat, Ictalurus punctatus, embryoner til Gene Editing

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56275
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 4, 5, 5, 1
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

En enkel og effektiv mikroinjektion protokol til gen redigering i kanal havkat embryoner ved hjælp af CRISPR/Cas9 system er præsenteret. I denne protokol, guide RNA'er og Cas9 protein var microinjected i blommesækken af én-celle embryoner. Denne protokol er blevet valideret af udskære to kanal havkat immun-relaterede gener.

Abstract

Komplet genomet af kanal havkat, Ictalurus punctatus, er blevet sekventeret, fører til større muligheder for at studere kanal havkat genfunktion. Gen knockout er blevet brugt til at studere disse genet funktioner in vivo. De grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager/CRISPR forbundet protein 9 (CRISPR/Cas9) system er et kraftfuldt værktøj, der bruges til at redigere genomisk DNA-sekvenser for at ændre genfunktion. Mens den traditionelle tilgang har været at indføre CRISPR/Cas9 mRNA i enkelt celle embryoner gennem mikroinjektion, kan det være en langsom og ineffektiv proces i havkat. Her, er en detaljeret protokol for mikroinjektion af kanal havkat embryoner med CRISPR/Cas9 protein beskrevet. Kort, æg og sæd blev indsamlet og derefter kunstige befrugtning udføres. Befrugtede æg blev overført til en petriskål, som indeholder Holtfreters løsning. Injektionsvolumen blev kalibreret og så guide RNA'er/Cas9 rettet mod den vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige adapter molekyle (TICAM 1) genet og rhamnose bindende lektin (RBL) genet blev microinjected i blommesækken af én-celle embryoner. Gen knockout var vellykket indels blev bekræftet af DNA-sekventering. Forudsagte protein sekvens ændringer på grund af disse mutationer inkluderet frameshift og afkortet protein på grund af for tidligt stop kodon.

Introduction

Mikroinjektion er en fælles laboratorium teknik, der anvendes til at levere en lille mængde af et stof som DNA, RNA, protein og andre makromolekyler i celler eller embryoner gennem et glas kapillær1. Mikroinjektion udføres ved hjælp af specialudstyr setup herunder en microinjector, micromanipulator og et mikroskop2. Teknikken er blevet brugt af forskere genetisk ændre mange organismer gennem generation af transgenics, gen knockouts og genterapi, med formålet at forstå dynamikken i intracellulære komponenter3,4 , 5.

Kanal havkat (Ictalurus punctatus) er den mest populære havkat arter i akvakultur og rekreativt fiskeri i USA. Der er et stigende behov for at studere funktionel genomforskning i kanal havkat, og sekventering af komplet genomet af kanal havkat øger nytten af de seneste fremskridt i genom fotoredigering værktøjer6,7. Forstå genfunktioner ville ikke kun berige den forskning, der foregår på havkat, men også føre til mere effektiv genetisk forbedring programmer til at forbedre havkat industrien. Når kritiske gener for en given egenskab af interesse er identificeret, kan de bruges til genetisk forbedring havkat produktionen gennem genom-redigering til at generere gavnlige alleler, udvalg for disse alleler, undertrykke de skadelige alleler, overførsel de gavnlige alleler gennem transgenese, eller en kombination af disse muligheder. Kombinerer de bedste gener for forskellige kommercielt gavnlige egenskaber fra forskellige arter i én fisk ville væsentligt forbedre produktivitet og rentabilitet af fisk produktion operationer8.

Gen knockout er en direkte metode til at studere genet funktioner in vivo. Mutationer i DNA-niveau vil blive arvet af kommende generationer, som vil lette undersøgelsen af deres effekter i forskellige generationer. Forskellige genom redigeringsværktøjer er blevet udviklet herunder zink finger nukleaser (ZFNs), transskription activator-lignende effektor nukleaser (TALENs) og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager/CRISPR-forbundet protein 9 (CRISPR/Cas9 ) system9,10,11,12.

CRISPR/Cas9-system er en kraftfulde, effektive værktøj, der er blevet brugt til at redigere genomisk DNA-sekvenser, herunder gen knockout i fisk gennem RNA-styrede lokationsspecifikke DNA kavalergang5,13. Systemet består af en guide-RNA (gRNA), som bestemmer den målrettede sekvens i genomet og et DNA endonuclease enzym, Cas9. CRISPR/Cas9-systemet kan være designet til at målrette en sekvens i genomet med flere fordele over ZFNs og TALENs: (1) lavere omkostninger (2) lettere engineering (3) mere specifik binding af guide RNA til target sekvens, og reduceret off target mutationer (4) flere sekvenser kan målrettes med forskellige gRNA på samme tid (5) høj mutagenese sats i gener, der ikke kunne være muteret af TALENs og (6) forbedret kønscelleoverførsel overførselshastighed på mutationer for op til 6-fold i forhold til ZFNs og TALENs14, 15,16,17,18.

Den vigtigste alternative metode for mikroinjektion er elektroporation, som elektriske impulser anvendes til embryoner eller celler at øge membran permeabilitet og optagelsen af biologiske molekyler19,20. Flere transgene fisk blev genereret ved hjælp af elektroporation medaka (Oryzias latipes), zebrafisk (Danio rerio), chinook laks (Oncorhynchus tshawytscha), kanal havkat, havrude (Sparus sarba), og fælles karper (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Elektroporation er blevet brugt til at levere plasmid DNA, RNA og Cas9 protein for gen knockout. I pattedyrceller, Cas9/gRNA plasmid DNA, Cas9 mRNA/gRNA og Cas9 protein/gRNA komplekser blev leveret ved hjælp af elektroporation og mutagenese satser var højest ved hjælp af Cas9 protein/gRNA komplekser for de fleste elektroporation betingelser testet27. TALENs udtrykker konstruktioner var i ascidian chordate (Ciona intestinalis), electroporated i befrugtede æg til at fremkalde knockout af flere gener28. ZFNs udtrykker plasmid konstruktioner var electroporated til at udskære luteiniserende hormon i kanal havkat29. Dog når indført ind i cellen, plasmid konstruktioner skal være transskriberes til RNA og oversat til funktionelle proteiner, før de kan målrette den ønskede DNA-sekvens, som sandsynligvis ville udsætte tidspunktet for mutagenese sammenlignet med mikroinjektion af RNA / protein. Som udvikling af et foster, øger forsinket mutagenese mosaicisme af injicerede grundlæggerne. Derudover er transgene udtryk usandsynligt at nå niveauet udtryk muligt med mikroinjektion, sænke mutagenese effektivitet.

Som et middel til at indføre genom redigeringsværktøjer i celler, har mikroinjektion flere fordele over elektroporation. Genom-redigering molekyler kan indføres pålideligt i celler eller embryoner gennem mikroinjektion30. Mindre injektion materiale er nødvendig. Det er nemt at bestemme mængder af materiale sprøjtes. Højere mutation satser med lav mosaicisme i grundlægger fisk kan være opnået, hvilket ville forbedre kønscelleoverførsel transmission af mutationer til F1. Færre grundlægger fisk skal analyseres for at producere den første generation, på grund af den højere Mutationshastighed. I elektroporation skal flere grundlægger fisk analyseres som vil øge omkostningerne. Overlevelse af kanal havkat microinjected embryoner er imidlertid lavere end electroporated dem, selv om dette kan løses ved at indsprøjte flere embryoner31,32. I kanal havkat, overlevelse af æggeblomme-microinjected embryoner varierede fra 16 til 55%, afhængigt af de gener, der er målrettet og dosering af gRNA/Cas9 protein32.

Regelmæssig mikroinjektion af havkat embryoner teknisk krævende og tidskrævende, men en hurtig og effektiv CRISPR/Cas9 protein mikroinjektion protokol er præsenteret for kanal havkat embryoner. Denne protokol kræver mindre tid og ekspertise, da CRISPR/Cas9 protein opløsning indsprøjtes i blommesækken af én celle embryoner. Hundredvis af befrugtede æg kan injiceres i 1 h (ca den nødvendige tid til den første celledeling at forekomme). For at godkende protokollen, blev to sygdom modtagelighed-relaterede gener slået ud i kanalen havkat, adapter vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige molekyle (TICAM1) genet og rhamnose bindende lektin (RBL) genet. TICAM 1 er involveret i signalvejen initieret af toll-lignende receptor (TLR) 3. I kanal havkat var TICAM 1 dramatisk upregulated efter bakterielle udfordring med Edwardsiella ictaluri, mens det var downregulated i blå havkat, en art resistent E. ictaluri33. RBL spiller en vigtig rolle i tidlig infektion med Flavobacterium columnare, det agens af columnaris sygdom, hvor akut og robust Opregulering blev indspillet i en columnaris-følsomme kanal havkat stamme i forhold til en columnaris-resistent stamme34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dette eksperiment blev udført på fisk genetik Research Unit, E. W. Shell fiskeri Research Center, Auburn Universitet, AL. Alle eksperimentelle protokoller, der bruges i dette eksperiment blev godkendt af Auburn University institutionelle Animal Care og brug Udvalget (AU-IACUC) før eksperimentet blev indledt. En liste over det udstyr og forsyninger, der anvendes i dette eksperiment kan findes i tabellen materialer. Følgende er de trin og procedurer for udarbejdelse og mikroinjektion af kanal havkat én-celle embryoner som illustreret i figur 1.

1. gruble Stock udvælgelse og gydning

  1. Vælg sunde kanal havkat yngel fra den stamme eller genetiske linje af interesse. Kanal havkat hanner og hunner skal udstille gode sekundære kønskarakterer.
  2. Vælg hanner, der har et bredt muskuløs hoved, der er bredere end resten af deres kroppe med veludviklede genital papilla. Mørk farve, ardannelse og sår fra territoriale kampe er også tegn på seksuel parathed. Vælg hunner, der har hoveder, der er smallere end resten af deres kroppe, og har bløde, håndgribelig, godt afrundet maven. For nøjagtighed og at undgå at stresse fiskene under første behandling, stoppe fodringen hunnerne 2-3 dage før undersøge deres parathed for gydning.
  3. Udføre fisk håndtering hurtigt, men forsigtigt. For at reducere håndtering stress, udføre alle procedurer, der kræver håndtering hunner mens du holder fisk hos gydende tasker (32 mm størrelse mesh).
  4. Lige før hormon injektion til at fremkalde ægløsning, måle kropsvægt af hunnerne.
  5. Hænge de gydende poser med hunner inde i et flow gennem tank med løbende vandflow og tilstrækkelig udluftning.
  6. Aseptisk, indlæse den implantator, der har en 14 G kanyle med 85 µg/kg af luteiniserende hormon releasing hormon analog (LHRHa) implantat. Skyl injektionsstedet (ryggens muskulatur) med 0,9% steril saltvandsopløsning før injektionen. Indsætte implantator i en 45° vinkel og frigive implantatet. Trække tilbage nål og stryg injektionsstedet med en bomuld bolden tidligere gennemblødt i 70% ethanol.
  7. Sted de gydende taske i holdingtank så at fisken er helt nedsænket i vand 15-20 cm under vandoverfladen. Tilstrækkelig udluftning (over 5 ppm opløst ilt) og en god vandkvalitet er vigtige for ægløsning af høj kvalitet æg.
  8. Forudsige ægløsning tid baseret på vandtemperaturen ved hjælp af grad-time (h) forholdet35. Grad-h responstid = tidspunkt mellem hormon injektion og ægløsning (h) * vand temperatur (° C). For eksempel, for en grad-h responstid på 900-1.000, forventes en kvinde at gyde på 36-40 h fra hormon injektion tid ved 25 ° C. Normalt, er den første kontrol for æg gjort på omkring 36 timer efter hormon injektion og derefter på 4 h interval.
  9. For at tjekke for ægløsning, forsigtigt løfte gydende posen over vandoverfladen, mens du er på udkig efter de æg, der er knyttet inde i gydende posen. At se mindst 10 æg angiver denne kvinde er ægløsende og klar til hånd stripping.

2. sæd forberedelse

Bemærk: Sæd kan være forberedt et par h før forventet ægløsning.

  1. Aflive mænd af en percussive slag i hovedet uden bedøvelse, da anæstesi kan have en negativ effekt på sperm motilitet.
  2. Indsamle testiklerne i et lille vejer pan, fjerne alle væv og vaske dem med 50 mL af 0,9% saltvand til at fjerne blod, hvis nødvendigt. Veludviklet testiklerne er hvid med mange villiform fremskrivninger ( figur 2).
  3. Bestemme vægten af testiklerne.
  4. For at forberede sperm løsningen æg befrugtes, overføre testiklerne til midten af en 100 cm2 100 µm mesh med pincet. Fold mesh med testiklerne indeni, knuse testiklerne og filtrere sæden ind i en 50 mL collection tube. Dette kan gøres ved at anvende pres på testiklerne inde trådnet mod kanten af collection tube via tommelfingeren. Bruge 0,9% saltvand løsning for at vaske sperm fra trådnet i collection tube. Saltvandsopløsning kan tilføjes op til 10 mL/g af testiklerne.
  5. Bestemme koncentrationen af sædceller, check motilitet og levedygtighed.
    Bemærk: Koncentrationen kan bestemmes ved at tælle sædceller i en kendt fortyndet volumen af milt ved hjælp af en hemocytometer. Alternativt, sperm tæthed kan estimeres ved at vurdere Ekstinktionen af milt bruger et spektrofotometer. I denne metode, er optagelsen på 505 nm bølgelængde i forhold til en kontrol diagram, der tidligere er udarbejdet for absorption af forskellige koncentrationer af sperm36. Sædkvalitet kan kontrolleres under mikroskopet som tiden fra aktivering af sædceller indtil ophør af sperm bevægelse (kaldet motilitet varighed)37. Levedygtigheden af sædceller kan bestemmes ved farvning sperm med selektiv farvestoffer såsom trypan blå, som vil plette kun ikke-levedygtige sædceller, mens levedygtige sædceller vil forblive unstained. For disse mikroinjektion procedurer er dette imidlertid ikke nødvendige, hvis testiklerne er veludviklet.
  6. Gemme sæd i 0,9% saltvand fra trin 2,5 ved 4 ° C og brug inden for 24 timer efter tilberedning.

3. indsamling og befrugtning af æg

  1. Anvende et meget tyndt lag af vegetabilsk afkortning til en 20 cm diameter rene og tørre gydning pan.
  2. Anbring kvindelige i den bedøvende indeholdende 100 ppm af buffer tricaine metan sulfonat med natriumbicarbonat (pH-værdien af endelig løsning bør være 7.0) indtil fisken er helt bedøvede38.
    Forsigtig: Tricaine metan sulfonat kan være irriterende hvis indåndes, indtages eller optages gennem huden.
  3. Omhyggeligt, fjerne fisk fra de gydende taske og dyppe den i 0,9% saltvand til at vaske den bedøvende løsning. Tør fisken helt ved hjælp af et rent håndklæde, undgå fjernelse af mukuslagets på fisk kroppens overflade.
  4. Anvende vegetabilsk afkortning til området omkring aftræk, herunder bugfinnerne, for at undgå udlæg i æggene under hånd stripping.
  5. Hånd strip æggene i smurt gydende gryden ved at anvende blide tryk på æggestokkene. God æg skal flyde frit, være gylden gul i farven og har minimal eller ingen klumper eller blodpropper (figur 2). Undgå kontakt mellem æg og vand før befrugtningen, da vandet kan stimulere micropyle lukning.
  6. Til at befrugte æggene for mikroinjektion, overføre 200 – 300 æg til en smurt gydende pan. Smurt plastic plante etiketter kan bruges som en ske til at overføre æggene til de smurt gydende pan. Tilsæt 1-2 mL af sæd (fra trin 2,5) til æg og bland forsigtigt. Forholdet mellem sæd til æg bør være ca 11.000 sæd/æg.
  7. Tilføje ferskvand til æg at aktivere sperm og æg. Tilsæt vand nok til lidt dækning af æggene. Forsigtigt swirl æggene for 30 s. fertilisering skal forekomme i 1-2 min. Det er vigtigt at befrugte æg, der er arrangeret i et enkelt lag. Malle æg overholde hinanden gør det vanskeligt at microinject flere lag af embryoner.
  8. Der tilsættes mere ferskvand til de befrugtede æg og æg til at hærde for 10-15 min.
  9. Dække de gydende pan indeholdende de resterende ubefrugtede æg med en våd køkkenrulle til at forhindre udtørring og befrugte over et par timer. Befrugtningen kan ske i en forskudt måde, for eksempel, et parti af 200 – 300 æg kan være befrugtet hver 30-60 min for at sikre en kontinuerlig forsyning af embryoner på én celle stadium for mikroinjektion og kontrol ikke injiceres embryoner. Undgå kontakt mellem de våde håndklæde og æg, som æggene kan overholde de våde håndklæde gør det svært at fjerne dem. I denne protokol, æg befrugtet inden for 2-3 h efter stripning var effektivt microinjected og havde lignende succes som æg befrugtet umiddelbart efter stripning.

4. nål trække og lastning

  1. Trække en 1.0 mm OD borsilikatglas kapillær ind 2 nåle (figur 3). Gemme nåle i et papir kasse med et stykke af svamp flere snit er foretaget. For at undgå at bryde nålen, bør diameteren af svampen være mindre end længden af nålen stilken.
  2. Åbn nål tip ved at bryde et lille stykke af den nål tyndeste region ved hjælp af en skarp genstand. Alternativt kan du åbne nålen ved at knibe ud den tyndeste region i spidsen med pincet under mikroskop.
  3. Forberede injektion løsning ved at blande gRNA(s) med Cas9 protein. Andre typer af RNA og protein kan også injiceres med samme procedure. I denne protokol, var gRNAs designet til mål to af kanal havkat immun relaterede gener, vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige adapter molekyle (TICAM1) genet og rhamnose bindende lektin (RBL) genet og tilberedt efter Shah mfl. med brug af et high fidelity Taq-polymerase32,39. Genomisk målene for gRNAs var 5' GGA GGT GAA GCA KBRT CGA GGA 3' til TICAM 1-genet (figur 4) og 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' for exon 1 af RBL gen med protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens understreget (figur 6).
    1. BLAST guide RNA mål mod kanal havkat genomet sekvens og vælg dem med ingen potentielle off-målwebsteder.
    2. Tilføje phenol rød farve gRNA/Cas9 protein blandes til en tredjedel af den samlede mængde.
    3. Justere den endelige koncentration af gRNA/Cas9 protein mix med nukleasen gratis vand, så hvert embryon sprøjtes med 50 nL indeholdende ca 2,5 ng gRNA og 7,5 ng Cas9 protein. Inkuber blandingen i 10 min. på køl før brug.
  4. Med en microloader, læg 5-10 µL af gRNA/Cas9 blanding i injektion nålen ved at indsætte microloader i nål stilken og udvise blandingen langsomt mens tilbagetrækningskraften microloader tip (figur 3). Undgå diffusering luftbobler inde.
  5. Tillægger mikropipette indehaveren nålen og sikre en stram forbindelse, og derefter vedhæfte indehaveren til micromanipulator. Sikre gratis stabil bevægelse. Anvende pres for mikroinjektion af åbne nitrogen cylinder og justering af trykregulator.
    Bemærk: Mængden af injektion kan blive påvirket af pres, diameter af nålen blænde, og varigheden af injektion. For at bestemme lydstyrken til indsprøjtes, tilføre en dråbe af mineralsk olie placeret på en hemocytometer. Hvis det er nødvendigt, kan tryk, varigheden af injektion, og nål diameter justeres for at forøge eller formindske mængden af injektion. Indsprøjtes flere gange i mineralolie at sikre konsekvent volumen.

5. mikroinjektion af havkat embryoner

  1. Anvende et meget tyndt lag af vegetabilsk afkortning til en 100 mm clean petriskål.
  2. Brug et smurt plastic plante etiket, overføre 50 – 100 æg fra befrugtning pan til petriskålen og dække dem med Holtfreters løsning (materialer tabel). Juster æg mod hinanden i et enkelt lag. Denne tilpasning bør holde æggene på plads under mikroinjektion proces.
  3. Placer petriskål med æg på scenen i mikroskop og holde den med den ene hånd. Sænk nålen med anden hånden (figur 3), indtil det gennemborer chorion og æggeblomme i en enkelt jævn bevægelse. Spidsen af nålen skal være så tæt som muligt på blastodisc før levering injektion materiale.
    1. Tryk pedalen for at levere injektion materiale i æggeblomme. Hvis blastodisc ikke er klart synlig, kan derefter injektion materiale fordeles til forskellige steder i æggeblomme. For at gøre det, nålen er sat til den fjerneste ende af blommesækken, så deprimerende pedalen og fratagelse af nålen er gjort samtidigt for at sprede injektion materiale gennem forskellige områder af blommesækken. Op til 50 nanoliters kan injiceres i blommesækken af kanal havkat embryoner, men, mængden af protein, gRNA/Cas9 skal optimeres for hvert gen at opnå de bedste resultater for mutation satsen og embryo overlevelse32.
  4. Trækker nålen glat for ikke at beskadige ægget. Flytte petriskål at injicere en anden æg med samme procedure. Undgå bevægelser af petriskålen under indsprøjtningssystem processen, da dette kan beskadige ægget eller bryde nålen. Fjerne æg, der er bristet eller beskadiges på grund af mikroinjektion. Injektion kan startes på 15-20 min efter befrugtning og fortsætte så længe embryonerne er stadig i en celle stadium (indtil ca. 60-90 min. efter befrugtning).
  5. Placer injiceres embryoner tilbage i Holtfreters løsning med 10 ppm af doxycyclin og kontinuerlig blid beluftning i 6 – 7 dage indtil rugeæg40. Ændre løsningen dagligt og fjerne døde embryoner.

6. mutation påvisning

  1. Tilfældigt, indsamle flere injiceres embryoner på 72 h post befrugtning, fjerne æggeblomme og udtrække genomisk DNA. Omfatte 3-5 ikke-indsprøjtning embryoner som en kontrol.
    Bemærk: Genomisk DNA kan udvindes fra embryoner efter fjernelse af æggeskaller og æggeblomme materiale ved hjælp af proteinase K fordøjelse og ethanol nedbør32.
  2. Forstærke et DNA segment flankerende genomisk målene for gRNA af hvert gen, hvor mutationer forventes at opstå, ved hjælp af en high fidelity Taq-polymerase32. For TICAM 1, primere 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (frem) og 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (omvendt) blev brugt til at forstærke en 750 bp for RBL, primere 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (frem) og 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (omvendt) blev brugt til forstærke en 375 bp segment fra RBL-genet.
    1. Brug følgende PCR reaktionen: op til 20 µL PCR grade vand; 1 x high fidelity Taq enzym reaktion buffer med MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 0,4 µM for hver af de forward og reverse primer af det samme sæt, 100-300 ng genomisk DNA og 1,25 enheder af high fidelity Taq enzym blanding. Udføre PCR cykling betingelser: indledende denaturering på 94 ° C i 3 min. 35 cyklusser af denaturering på 94 ° C til 30 s, udglødning ved 60 ° C for 55 s for TICAM og 40 s for RBL, udvidelse ved 72 ° C i 1 min/kb; og sidste udvidelse ved 72 ° C i 10 min.
  3. Opdage de mutante embryoner ved hjælp af en metode til påvisning af mutation såsom sekventering af renset PCR produkter, landmåler mutation påvisning assay, heteroduplex mobilitet assay, tab af begrænsning enzym anerkendelse websted, eller enhver anden mutation opdagelse metode, der er passende for målet. I denne protokol, opdage mutant embryoner ved hjælp af landinspektør mutation påvisning assay for TICAM 1 og tab af begrænsning enzym SapI skære websted samt sekventering af renset PCR produkter til RBL genet.
  4. For at identificere mutante alleler, klon PCR produkter og sekvens vektorer fra enkelte kolonier. De mutante alleler præsenteret i figur 4 og figur 6 kom fra injiceres embryoner. PCR produkter fra seks microinjected og 3 kontrol embryoner for hvert gen var samlet i to separate rør, et til microinjected embryoner og den anden for kontrol embryoner, hurtigt klonet og 86 vektorer for TICAM 1 og 48 vektorer for RBL gen sekventeret, herunder 8 sekventering reaktioner fra 3 kontrol ikke injiceres embryoner for hvert Gen.
  5. For at identificere forskellige mutante alleler, sammenligne sekvenser fra mutant embryoner til vildtype sekvens benytter enhver DNA sekvens justering værktøj såsom BLAST eller T-kaffe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at demonstrere effektiviteten af mikroinjektion protokol, blev gRNAs designet til at målrette kanal havkat vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige adapter molekyle (TICAM1) genet og rhamnose bindende lektin (RBL) genet microinjected.

TICAM 1
DNA-sekventering af vektorer fra enkelte kolonier fra poolede, klonede PCR produkter afslørede indel mutationer induceret i TICAM 1 gen. Den mutation var 79% i de 24 personer analyseret. Eksempler på mutationer er illustreret i figur 4 og figur 5. Virkningerne af indel mutationer i TICAM1 genet kodende sekvens af kanal havkat på forudsagte protein længde og sekvens i forhold til den vilde skrive sekvens er illustreret i tabel 1. Sletning mutationer resulteret i fjernelsen af nogle få til flere aminosyrer fra den forudsagte protein, fører til skiftende downstream læsning rammen og før tid opsige oversættelse (tabel 1).

I de fleste tilfælde blev mere end 80% af den forventede protein sekvens afkortet på grund af et for tidligt stop-codon. I disse tilfælde, den forudsagte polypeptid længde varierede fra 91 til 106 aminosyrerester (vilde type TICAM 1 har 520 aminosyrerester). Mutationer med ekstremt afkortet protein forventes at producere en ikke-funktionelle protein. For 87 bp sletning mutationen (tabel 2, figur 4), blev 29 aminosyrer fjernet fra protein uden at ændre rammen læsning. De funktionelle konsekvenser af sådanne mutationer skal evalueres eksperimentelt.

RBL
DNA-sekventering af vektorer fra enkelte kolonier fra poolede, klonede PCR produkter bekræftet tilstedeværelsen af indel mutationer (figur 6). Den mutation var 88% i de 40 personer analyseret. Sletninger varierede fra 5 bp at 183 bp, mens op til 20 bp blev indsat. Interessant, fjernet de 183 bp sletninger helt intron 1, exon 2, og 19 bp fra intron 2. Teoretisk set bør dette påvirke splejsning af RBL-genet da splejse websteder har været muteret.

Indel mutationer havde variable effekter på den forudsagte protein sekvens i forhold til den vilde type protein sekvens (308 aminosyrerester) (tabel 2). Mere end 70% af indels resulterede i en forudsagt afkortet protein, der er 10% eller mindre end længden af vildtype protein. I nogle indels (mutation nummer 4, 5 og 6) blev det forudsagte polypeptid mindre end 10 aminosyrer. Kun 2 sager (nummer 2 og 3) resulterede i sletning af 2 og 4 aminosyrer i den forudsagte protein uden at ændre rammen læsning, som kan eller kan ikke påvirke funktionen protein.

Bi-allel mutationer blev induceret med to andre gRNAs (Elaswad mfl., ikke udgivet) hvor begge kromosomer var muteret i nogle embryoner og ingen vildtype alleler blev ikke fundet. Med gelelektroforese af PCR produkter havde disse embryoner kun et band, der var kortere end vildtype band (mere end 200 bp sletning). DNA-sekventering af klonede PCR produkter bekræftet tilstedeværelsen af kun én mutant allel i alle vektorer sekventeret fra ét embryon (homozygote biallelic mutation) mens to muterede alleler opstod i andre embryoner (heterozygous biallelic mutation). I nogle andre embryoner, der var mosaik for mutationen, blev både mutant (op til 4 alleler) og vildtype alleler opdaget af DNA-sekventering af klonede PCR produkter.

Figure 1
Figur 1 : En oversigt over mikroinjektion procedurer for én-celle kanal havkat (Ictalurus punctatus) embryoner med gRNA/Cas9 protein til at udskære vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige adapter molekyle (TICAM1) genet og rhamnose bindende lektin (RBL) genet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Testiklerne og æg af kanal havkat, Ictalurus punctatus . (A) veludviklet testiklerne kanal havkat hanner er hvid med mange villiform fremskrivninger. (B) god æg fra kanal havkat hunner er golden-gul i farven med minimal eller ingen blodpropper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Microneedle trække, lastning og mikroinjektion af én-celle kanal havkat, Ictalurus punctatus , embryoner. (A) nål trække med en lodret nål puller. Nål struktur og diameter er påvirket af varme vandvarmeren glødetråden og magnetventil kraft. (B) Microneedle indlæsning med CRISPR/Cas9 blanding ved hjælp af en microloader spids. (C) Arrangement af kanal havkat embryoner i en 100-mm petriskål indeholdende Holtfreters løsning. Microneedle sænkes indtil det rører og gennemborer ægget. (D) forstørret del af panelet C viser processen med piercing ægget. Bemærk needle-tip er at skubbe chorion membranen indad men har ikke trængte det endnu. Injiceres embryoner har den røde indsprøjtning materiale indeni. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : CRISPR/Cas9 induceret mutationer i vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige adapter molekyle (TICAM1) genet kodende sekvens af kanal havkat, Ictalurus punctatus . Blå sekvens repræsenterer protospacer tilstødende motiv (PAM), mens den grønne sekvens repræsenterer målet for gRNA. Dobbelt strand bryde induceret af Cas9 protein var forventes at forekomme i stedet for de 2 røde trekanter. Mutationer er tildelt tallene 1 til 8. Sletning mutationer er repræsenteret ved en stiplet linje, hvor hvert dash svarer til et nukleotid, der er blevet slettet. Rød sekvenser er indsætninger mens lilla repræsenterer substitution mutation. Brøkdele af 78 repræsenterer antallet af muterede alleler i 78 sekventering reaktioner (fx, 3/78 betyder at en allel blev fundet i 3 sekventering reaktioner fra ialt 78 reaktioner). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Indel mutationer i kanal havkat, Ictalurus punctatus , vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige adapter molekyle (TICAM1) genet kodende sekvens induceret ved mikroinjektion af gRNA/Cas9 protein i kanal havkat én-celle embryoner som afsløret af DNA-sekventering kromatogram. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : CRISPR/Cas9 induceret mutationer i rhamnose bindende lektin (RBL) gen af kanal havkat, Ictalurus punctatus . Exonic sekvenser er med store bogstaver, mens intronic sekvenser er små bogstaver. Blå sekvens repræsenterer protospacer tilstødende motiv (PAM), mens den grønne sekvens repræsenterer målet for gRNA. En dobbeltstrenget pause induceret af Cas9 protein var forventes at forekomme i stedet for de 2 røde trekanter. Mutationer er tildelt tallene 1 til 9. Sletning mutationer er repræsenteret ved en stiplet linje, hvor hvert dash svarer til et nukleotid, der er blevet slettet. Rød sekvenser er indsættelser. Fraktioner af 40 repræsenterer antallet af muterede alleler i 40 sekventering reaktioner f.eks 2/40 betyder at en allel blev fundet i 2 sekventering reaktioner fra ialt 40 reaktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Mutation Indsættelse Sletning Bevægelsen (Δ) Protein længde (aminosyre) Frameshift ændret For tidligt stop codon Forudsagte protein sekvens
WT 0 0 0 520 Nej Nej MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST
ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS
PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF
RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG
GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ
ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS
STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL
LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL
LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM
AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW
LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ
HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS
PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM
TVGGGVDSGDEDNF
(GenBank: NP_001187154.1
1 0 5 -5 104 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS
HNQ
2 5 40 -35 94 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS
GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF
KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ
3 0 87 -87 491 Nej Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE
AKPSSPLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQ
LEKFKFRQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFL
SIPSGGGKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSF
STEKQASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKS
RLESISSTIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSA
YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN
TVIPLLPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDT
FEKMAKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREK
QQWLQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQ
QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP
SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST
MTVGGGVDSGDEDNF
4 3 131 -128 95 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG
5 1 0 1 106 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
6 1 0 1 106 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
7 14 0 14 100 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA
8 35 9 26 91 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV

Tabel 1: Effekter af indel mutationer i vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige adapter molekyle (TICAM1) genet kodende sekvens af kanal havkat, Ictalurus punctatus, på forudsagt protein længde (aminosyrer) og rækkefølgen i forhold til naturen Skriv rækkefølgen (WT).

Mutation Indsættelse Sletning Bevægelsen (Δ) Protein længde (aminosyre) Frameshift ændret For tidligt stop codon Forudsagte protein sekvens
WT 0 0 0 308 Nej Nej MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR
LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT
NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE
IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL
SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT
VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT
DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE
EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
(GenBank: AHJ14694.1) 53
1 0 5 -5 29 Ja Ja MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
2 0 6 -6 306 Nej Nej MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT
CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN
CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI
EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT
LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL
TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR
TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC
EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
3 0 12 -12 304 Nej Nej MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE
TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA
LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK
YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA
NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA
AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI
CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST
TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS
SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
4 0 16 -16 6 Ja Ja MMLFLN
5 0 183 -183 8 Nej Ja MMLFLKRI (forudsat splejsning ikke er ændret)
6 1 183 -182 5 Ja Ja MMLFL (forudsat splejsning ikke er ændret)
7 1 0 1 31 Ja Ja MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
8 1 0 1 31 Ja Ja MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
9 20 0 20 18 Ja Ja MMLFLKASSHISSSASSP

Tabel 2: Effekter af indel mutationer i rhamnose bindende lektin (RBL) gen af kanal havkat, Ictalurus punctatus, forudsagde protein længde (aminosyrer) og rækkefølgen i forhold til den vilde skrive sekvens (WT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En detaljeret protokol for mikroinjektion af kanal havkat embryoner at opnå gen knockout blev præsenteret. Injektion af CRISPR/Cas9 protein i blommesækken er meget enklere, sparer tid og kræver ikke omfattende uddannelse i forhold til microinjecting blastodisc af én-celle embryon, som er den fælles teknik til de fleste overførsel af gener og gen redigering med fisk 30 , 42. den nuværende protokol viste sig for at være en succes i overtalelse indels i kanal havkat TICAM 1 og RBL gener. Disse pålidelige og effektive procedurer lægge fundamentet til at generere fremtidige gen knockouts i kanal havkat. Protokollen kan ændres for at målrette andre gener i den kanal havkat genom ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet, eller for at tilpasse andre gen teknologier til havkat, såsom tol2 medieret transgenese. Det er også værd at evaluering i andre havkat arter såsom blå havkat (I. furcatus), som er kommercielt vigtige og deres æg synes at være mere følsomme over for håndtering end kanal Malle æg. Hvis andre gRNAs eller biologisk aktive stoffer såsom DNA og mRNA er sprøjtes, kan protokollen kan skal optimeres for at bestemme de bedste betingelser.

I protokollerne for mikroinjektion af fisk embryoner, mikroinjektion procedurer kan opdeles i to hovedkategorier: indsprøjtning i embryonale celler og injektion i æggeblomme. I medaka, blev morpholinos sprøjtet ind i cytoplasmaet i en celle embryoner at studere forskellige udviklingsprocesser i vivo41. I kanal havkat, CRISPR/Cas9 mRNA målretning af GnRH genet blev microinjected i blastodisc af én-celle embryoner30. I Trepigget Hundestejle (Gasterosteus aculeatus), var blastomeres microinjected til at generere transgenics og gen knockouts42. På den anden side blev én-celle zebrafisk embryoner æggeblomme-indsprøjtning med morpholinos til at manipulere protein hjertet af glas (Heg), som viste sig for at være effektiv43. Disse 2 typer af tilgang har deres fordele og ulemper, men hvis begge har samme effektivitet for de samme arter, æggeblomme mikroinjektion af én-celle embryoner vil blive foretrukket af flere grunde.

Æggeblomme mikroinjektion er mindre invasive til embryoner, da mikroinjektion nåle ikke punkteres embryonale celler. Derudover kan mange embryoner injiceres i en kort periode, mens embryonerne er stadig på den første celle stadium. Der er ingen grund til at justere embryoner i en bestemt position. Dette ville også spare tid og reducere stress håndtering af embryoner. I sæsonkorrigerede gydende fisk, er der en begrænset gydning tid, hvor alle procedurerne, der skal gøres for at opnå succesfulde knockout. I kanal havkat, gydetiden varer for omkring 2 måneder44. Derfor vil tillade udvikle en hurtig og effektiv mikroinjektion protokol mikroinjektion af mange embryoner til at målrette mange gener i denne korte periode. Heldigvis, kanal havkat kan blive kunstigt opfostrede for at levere et stort nok antal embryoner til mikroinjektion at overvinde den høje dødelighed på grund af mikroinjektion procedurer45. Tidspunktet for befrugtning kan desuden kontrolleres for at sikre, at embryoner i én-celle stadium efter behov.

Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 induceret indels i forskellige fiskearter, herunder zebrafisk, laks (Salmo salar L.), Nile tilapia (Oreochromis niloticus), kanal havkat, Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus) 46og almindelig karpe5,30,46,47,48,49,50. Hertil kommer, blev CRISPR/Cas9-systemet brugt til at forstyrre gener i Labeo rohita karper via homologe rekombination-medieret indsættelse af fremmed DNA i målrettede gener51. I denne protokol, var vellykket indels induceret i kodning sekvenser med dramatiske effekter på den forudsagte protein sekvens, herunder frameshift mutationer resulterer i for tidlig stop-codon. Fænotypisk virkninger af disse mutationer stadig skal undersøges. Afkortet mRNAs er mest sandsynligt nedbrudt gennem nonsens-medieret mRNA henfald (NMD) vej, hvilket resulterer i en reduktion eller hæmning af udtryk, og hvis udtrykt, afkortet proteiner vil sandsynligvis være nonfunctional52,53 .

I vores eksperiment med RBL-gen, to typer af mutationer (nummer 5 og 6) resulterede i sletning af 183 bp helt at fjerne halvdelen af exon 1, intron 1, exon 2, og en del af intron 2. Teoretisk, denne type af mutation kan ændre splejsning af RBL pre-mRNA. Mutationer på splice websteder hæmme spliceosome evne til at genkende exon54.

Afslutningsvis, er udvikling af en pålidelig effektiv protokol for målrettede gen redigering i kanal havkat afgørende for at studere funktionel genomforskning, især efter de genomiske ressourcer har været beriget med de seneste sekventering af kanal havkat genom. De procedurer, der er beskrevet her er enkle, hurtige men effektiv og har vist sig at kunne opnå gen knockout. To gener, TICAM 1 og RBL, var målrettet mod for at påvise effektiviteten af CRISPR/Cas9 knockout bruger mikroinjektion. Afhængigt af hvad der indsprøjtes, kan protokollen ændres til at omfatte andre biologisk aktive stoffer. Det kan ændres også til microinject andre arter, havkat eller andre fiskearter, der har lignende æg struktur og sammensætning. Denne protokol skabe grundlaget for gen knockout i kanal havkat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskning er finansieret af USDA-NIFA award 2015-67015-23488 til Roger Cone. Forfatterne takke Dr. Ronald Phelps for beskrivelsen af yngel lager udvælgelseskriterier i videoen. Ahmed Elaswad og Karim Khalil vil gerne takke de egyptiske kulturelle og uddannelsesmæssige Bureau i Washington DC til finansiering af deres Ph.D. forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

Genetik sag 131 CRISPR/Cas9 gen redigering gen knockout mikroinjektion kanal havkat embryoner mutation afkortet protein indels
Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 Protein i kanal havkat, <em>Ictalurus punctatus</em>, embryoner til Gene Editing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D.,… More

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter