Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56275
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 4, 5, 5, 1
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג'ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.

Abstract

הגנום המלא של השפמנון ערוץ, Ictalurus punctatus, יש כבר וסודרו, שמוביל הזדמנויות ללמוד ערוץ שפמנון ג'ין פונקציה. נוקאאוט גנטי שימש ללמוד פונקציות אלה ג'ין בתוך vivo. באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) המערכת היא כלי רב עוצמה המשמש לעריכת רצפי דנ א גנומי לשנות תפקוד הגן. בזמן הגישה המסורתית הייתה להציג CRISPR/Cas9 mRNA לתוך תא בודד העוברים דרך microinjection, זה יכול להיות תהליך איטי ולא יעיל של שפמנון. . הנה, מתואר פרוטוקול מפורט עבור microinjection של העוברים ערוץ שפמנון. עם חלבון CRISPR/Cas9. בקצרה, ביצים, הזרע היו הפריה שנאספו, ואז מלאכותיים שבוצעה. הביצים הועברו צלחת פטרי המכילות הפתרון של Holtfreter. נפח הזרקה היה מכויל, ואז מדריך RNAs/Cas9 מיקוד אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (טיקם 1) הגן לקולטן וג'ין לקטין (RBL) rhamnose האיגוד היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. נוקאאוט גנטי היה מוצלח כמו indels שאושרו על-ידי רצפי DNA. התיקונים רצף החלבון החזוי עקב מוטציות אלה כלולים frameshift, נחתך החלבון עקב עצירה מוקדמת codons.

Introduction

Microinjection היא טכניקה מעבדה נפוץ נהגה לספק כמות קטנה של חומר כמו DNA, RNA, חלבון ו מקרומולקולות אחרות לתוך תאים או עוברי דרך נימי זכוכית1. Microinjection מתבצעת באמצעות ציוד מיוחד ההתקנה כולל של microinjector, micromanipulator ו- מיקרוסקופ2. הטכניקה נעשה שימוש על ידי חוקרים כדי שינוי גנטי אורגניזמים רבים דרך הדור של transgenics, ג'ין הסתרה ולאחר טיפול גנטי, במטרה להבין את הדינמיקה של רכיבים תאיים3,4 , 5.

השפמנון ערוץ (Ictalurus punctatus) הוא המין שפמנון הפופולרי ביותר בחקלאות מים ופעילויות פנאי דיג בארצות הברית. יש צורך להגדיל ללמוד גנומיקה תפקודית ב ערוץ שפמנון ומגביר את רצף הגנום המלא של ערוץ שפמנון השירות של התפתחויות אחרונות הגנום-6,כלים-עריכה-7. להבנת תפקוד הגן לא רק להעשיר את המחקר מתנהל על שפמנון, אך גם להוביל תוכניות שיפור גנטי יעיל יותר כדי לשפר את תעשיית שפמנון. ברגע גנים קריטי עבור תכונה נתונה עניין מזוהים, הם יכולים לשמש לשיפור גנטית שפמנון ייצור באמצעות הגנום עריכה כדי להפיק תועלת אללים, הבחירה עבור אלה אללים, דיכוי של אללים מזיקה, העברת אללים מועיל דרך transgenesis, או שילוב של אפשרויות אלה. שילוב של הגנים הטובים ביותר עבור תכונות מועילות מסחרית שונים מ מינים שונים של דגים אחד לשפר במידה רבה פריון ורווחיות של דגים הפקה פעילות8.

נוקאאוט גנטי היא שיטה ישירה ללמוד ג'ין פונקציות בתוך vivo. מוטציות סמני דנ א תעבור בירושה לדורות אשר יקל את חקר ההשפעות שלהם בדורות שונים. כלי עריכה הגנום שונים יש כבר מפותחת כולל אבץ אצבע nucleases (ZFNs), תמלול אפקטור activator דמוי nucleases (TALENs), מקובצים באופן קבוע interspaced קצר palindromic חזרה/CRISPR-הקשורים חלבון 9 (CRISPR/Cas9 ) מערכת9,10,11,12.

מערכת CRISPR/Cas9 הוא כלי רב עוצמה, יעיל ששימש לעריכת רצפי דנ א גנומי כולל נוקאאוט גנטי בדגים עד מונחה RNA ספציפי לאתר ה-DNA המחשוף5,13. המערכת מורכבת RNA מדריך (gRNA), אשר קובע את רצף יישוב הגנום, אנזים endonuclease דנ א, Cas9. ניתן לעצב את מערכת CRISPR/Cas9 היעד כל רצף הגנום עם מספר יתרונות על ZFNs ועל TALENs: נמוך (1) עלות (2) קל הנדסה קשירה (3) יותר ספציפי של מדריך RNA רצף המטרה, צמצמה את המטרה מוטציות (4) ניתן לפלח רצפים מרובים עם gRNA שונים באותו זמן (5) מוטגנזה מכוונת גבוה קצב גנים יכול לא להיות מוטציה על ידי TALENs, (6) קצב השידור germline משופרת של מוטציות עבור עד 6-fold בהשוואה ZFNs, TALENs14, 15,16,17,18.

שיטת אלטרנטיבית הראשי עבור microinjection היא אלקטרופורציה, שבו מוחלות דחפים חשמליים העוברים או לתאים להגברת חדירות הממברנה ואת ספיגת של מולקולות ביולוגיות19,20. מספר דגים הטרנסגניים נוצרו באמצעות אלקטרופורציה כגון ערוץ שפמנון, שישן (Sparus sarba), סלמון צ'ינוק (Oncorhynchus tshawytscha), דג זברה (רזבורה rerio), medaka (Oryzias latipes), נפוץ קרפיון (קרפיון carpio)21,22,23,24,25,26.

אלקטרופורציה שימש כדי לספק חלבון ה-DNA, RNA ו- Cas9 פלסמיד עבור נוקאאוט גנטי. בתרבית של תאים, Cas9/gRNA פלסמיד ה-DNA, Cas9 mRNA/gRNA, Cas9 חלבון/gRNA מתחמי נשלחו באמצעות אלקטרופורציה, תעריפי מוטגנזה מכוונת הגבוהה ביותר באמצעות קומפלקסים של חלבונים/gRNA Cas9 עבור אלקטרופורציה רוב התנאים נבדקו27. Ascidian מיתרניים (Ciona intestinalis), היו TALENs המבטאת מבנים electroporated לתוך הביצים לזירוז נוקאאוט של גנים מרובים28. ZFNs לבטא פלסמיד בונה היו electroporated לדפוק את הורמון מחלמן שפמנון ערוץ29. עם זאת, ברגע הציג לתוך התא, בונה פלסמיד יהיה עליך להיות עיבד את ה-RNA, תרגם חלבונים פונקציונליים לפני בהם ניתן לסמן את רצף ה-DNA הרצוי, אשר סביר להניח יעכב את הזמן של מוטגנזה מכוונת לעומת microinjection של RNA / חלבון. כאשר העובר מתפתח, מוטגנזה מכוונת מושהית מגביר את פסיפס של מייסדי מוזרק. בנוסף, ביטוי הטרנסגניים סביר להשגת רמת ביטוי אפשרי עם microinjection, מוריד את היעילות מוטגנזה מכוונת.

כאמצעי ידביקו כלי עריכה הגנום בתאים, microinjection יש כמה יתרונות על פני אלקטרופורציה. הגנום עריכה מולקולות שיוכל אמינה להיכנס לתוך התאים או עוברי דרך microinjection30. חומר ההזרקה פחות נחוץ. . זה קל לקבוע את הכמויות של חומר מוזרק... מוטציה גבוהה המחירים עם פסיפס נמוך ב הדג מייסד יכולה להיות מושגת אשר תשפר germline שידור של מוטציות F1. דגים מייסד פחות צריך להיות מנותח כדי לייצר את הדור הראשון, עקב קצב מוטציה גבוהה יותר. אלקטרופורציה, עוד דגים מייסד צריך להיות מנותח אשר יגדיל עלויות. עם זאת, ההישרדות של ערוץ שפמנון microinjected עוברי הוא נמוך יותר electroporated אלה, אבל זה ניתן להתגבר על ידי הזרקת העוברים עוד31,32. ערוץ שפמנון, ההישרדות של microinjected-חלמון עוברי נע בין 16 ל- 55%, בהתאם הגנים מהווים מטרה, את המינון של חלבון gRNA/Cas932.

Microinjection קבוע של שפמנון העוברים הוא תובעני מבחינה טכנית, זמן רב, עם זאת, פרוטוקול microinjection חלבון CRISPR/Cas9 מהיר ויעיל מוצג עבור ערוץ שפמנון עוברי. פרוטוקול זה דורש פחות זמן ומומחיות מאז הפתרון חלבון CRISPR/Cas9 מוזרק לתוך החלמון של עוברי לתא אחד. יכול להיות מוזרק מאות הביצים ב h 1 (כ הזמן הדרוש עבור ליגה תא להתרחש). כדי לאמת את הפרוטוקול, שני גנים למחלות הקשורות הרגישות קיבלת מכה שפמנון ערוץ, את האגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן, הגן לקטין (RBL) מחייב rhamnose. 1 טיקם מעורב מסלול איתות שיזם קולטן דמוי-אגרה (TLR) 3. ערוץ שפמנון, טיקם 1 היה דרמטי upregulated בעקבות האתגר חיידקי עם Edwardsiella ictaluri, עוד הייתה downregulated ב כחול שפמנון, עמיד ictaluri ה33מינים. RBL ממלא תפקיד חשוב ב זיהום מוקדם עם Flavobacterium columnare, סוכן סיבתי של מחלת columnaris, שבו חריפה, קולטנים upregulation חזקים נרשמה זן שפמנון ערוץ columnaris, רגישים בהשוואה זן עמיד columnaris34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסוי זה נערך היחידה לחקר הגנטיקה של דגים, אי מעטפת וו הדיג מרכז מחקר, אוניברסיטת אובורן, AL. כל הפרוטוקולים ניסיוני השתמשו בניסוי זה אושרו על ידי אובורן אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (AU-IACUC) לפני הניסוי היה יזם. רשימה של ציוד ואספקה השתמשו בניסוי זה ניתן למצוא בטבלת חומרים. להלן הצעדים ואת הנהלים והכנה microinjection של שפמנון ערוץ אחד-תא עוברי כמופיע באיור1.

1. בחירת מניות והובילו להרהר

  1. לבחור בריא שפמנון ערוץ המניות שבוחרים זן או קו הגנטית של עניין. ערוץ שפמנון זכרים ונקבות צריך להציג מאפייני המין המשניים טוב.
  2. בחר גברים שיש להם ראש שרירים רחבה רחבה יותר שאר גופם מפותח papilla באברי המין. צבע כהה, צלקות, פצעים מן הלחימה טריטוריאלית הינם סימנים של המוכנות המינית. בחר לנקבות יש ראשים כי הם צרים יותר שאר הגופות שלהם, ויש על הבטן רכה, מוחשי, ואמיתיות. דיוק וכדי להימנע והדגיש את הדגים במהלך הטיפול הראשוני, תפסיקי להאכיל הנקבות 2-3 ימים לפני שבחן את המוכנות שלהן כדי להשריץ.
  3. מבצע דגים טיפול מהר, אבל בזהירות. כדי להפחית את הלחץ של הטיפול, לבצע כל ההליכים המחייבים טיפול הנקבות תוך החזקת דגים ההשרצה שקיות (רשת שינוי של גודל 32 מ מ).
  4. לפני הזרקת הורמון לזירוז ביוץ, מודדים את משקל הגוף של הנקבות.
  5. לתלות את השקיות ההשרצה עם נקבות בתוך זרם דרך טנק עם זרימת מים רציפה, אוורור נאותים.
  6. גילוח ורחיצה כירורגית, טען את implanter בעל מחט 14 G עם µg 85/kg של הורמון מחלמן משחרר הורמון אנלוגי השתל (LHRHa). לשטוף ההזרקה (השרירים הגבי) עם תמיסת מלח סטרילית 0.9% לפני הזריקה. הכנס את implanter בזווית של 45° ולשחרר את השתל. לשלוף את המחט ואת נשמטים ההזרקה עם כדור צמר גפן טבול בעבר ב- 70% אתנול.
  7. המקום השקית ההשרצה של המיכל כך הדג לגמרי שקוע בתוך מים 15-20 ס מ מתחת לפני המים. אוורור נאותים (מעל 5 ppm התפרקה חמצן) ואיכות מים טובים חשובים עבור ביוץ של ביצים באיכות גבוהה.
  8. לחזות את זמן הביוץ בהתבסס על טמפרטורת המים באמצעות היחסים מעלות שעות ביממה (h)35. זמן התגובה מעלות-h = זמן בין הזרקת הורמון הביוץ (h) * מים בטמפרטורה (° C). לדוגמה, עבור זמן תגובה מעלות-h של 900-1, 000, נקבה צפוי כדי להשריץ ב 36-40 שעות מעת הזרקת הורמון ב 25 º C. בדרך כלל, הבדיקה הראשונה של ביצים נעשה בערך 36 שעות לאחר הזרקת הורמון ולאחר מכן במרווח 4 שעות.
  9. כדי לבדוק אם הביוץ, הרם בעדינות את השקית ההשרצה מעל פני המים בזמן שאתה מחפש את הביצים המצורפים בתוך השקית ההשרצה. לראות לפחות 10 ביצים מציין שהנקבה הזו היא הביוץ ומוכן יד בנוכחות אחר.

2. זרע הכנה

הערה: זרע ניתן להכין כמה שעות לפני מועד הביוץ הצפוי.

  1. המתת חסד זכרים ע י מכה בראש ללא הרדמה, כאלו מאז הרדמה עלולה להיות בעלת השפעה שלילית על תנועתיות הזרע.
  2. לאסוף את האשכים במחבת קטנה במשקל, להסיר כל רקמות, ולשטוף אותם עם 50-מ ל תמיסת 0.9% כדי להסיר דם, במידת הצורך. האשכים מפותחת הם לבן עם תחזיות villiform רבים ( איור 2).
  3. לקבוע את המשקל של האשכים.
  4. כדי להכין את הפתרון הזרע להפריה ביצה, להעביר את האשכים המרכז של 100 ס מ2 100 מיקרומטר רשת שינוי באמצעות מלקחיים. מקפלים רשת השינוי עם האשכים בפנים, למחוץ את האשכים ולסנן את הזרע לתוך צינור אוסף 50 מ. ניתן לבצע זאת על ידי הפעלת לחץ על האשכים בתוך רשת השינוי נגד בקצה הצינור אוסף באמצעות האגודל. השתמש 0.9% תמיסת לשטוף את הזרע של רשת השינוי לתוך הצינור אוסף. תמיסת ניתן להוסיף עד 10 מ"ל/g של האשכים.
  5. קביעת ריכוז הזרע, בדוק את תנועתיות ואת הכדאיות.
    הערה: ריכוז יכול להיקבע על ידי ספירת תאי הזרע באמצעי אחסון מדולל הידוע של מילט באמצעות של hemocytometer. לחלופין, צפיפות הזרע יכול להיות מוערך על-ידי הערכת הצפיפות האופטית של מילט באמצעות ספקטרופוטומטרים. בשיטה זו, הספיגה-גל nm 505 מושווה תרשים בקרה הוכן קודם לכן על קליטתם של ריכוזים שונים של זרע36. תנועתיות הזרע ניתן לבדוק תחת המיקרוסקופ כמו הפעם מהפעלה של הזרע עד הפסקת זרע תנועה (נקרא תנועתיות משך)37. הכדאיות של זרע יכול להיקבע על ידי מכתימה את הזרע עם צבע בררני כגון trypan blue, אשר יהיה כתם תאי זרע רק כלכלית, ואילו זרעים יישאר וללא רבב. עם זאת, עבור הניתוחים microinjection, זה לא נחוץ אם האשכים מפותחים היטב.
  6. לאחסן זרע ב- saline 0.9% משלב 2.5-4 ° C ולהשתמש בתוך 24 שעות לאחר ההכנה.

3. ביצה אוסף, הפריה

  1. למרוח שכבה דקה מאוד של צמחי עד קוטר 20 ס מ נקי. יבש ההשרצה פאן.
  2. למקם את הנקבה הפתרון הרדמה המכיל 100 ppm של tricaine במאגר מתאן סולפונאט עם סודיום ביקרבונט (ה-pH של הפתרון הסופי צריך להיות 7.0) עד הדג הוא מורדם לחלוטין38.
    התראה: Tricaine מתאן סולפונאט עלול להיות מעצבן אם נשאף, בלע או נספג דרך העור.
  3. . בזהירות, להסיר את הדג מן השקית ההשרצה וטובל ב- saline 0.9% לשטוף את הפתרון הרדמה. לייבש את הדגים לחלוטין בעזרת מגבת נקייה, הימנעות ההסרה של השכבה ריר על פני גוף הדג.
  4. החל לינוק ירקות לאיזור סביב האוורור, כולל את הסנפירים האגן, כדי למנוע החזקה של הביצים במהלך היד בנוכחות אחר.
  5. יד להפשיט את הביצים לתוך התבנית המשומנת ההשרצה על ידי הפעלת לחץ עדין השחלות. ביצים טוב צריך לזרום בחופשיות, מצהוב-זהוב בצבע ויש מינימלי אין גושים או קרישי דם (איור 2). יש למנוע מגע בין ביצים ומים לפני ההפריה, כמו מים יכול לעורר micropyle הסגר.
  6. כדי להפרות את הביצים עבור microinjection, להעביר 200 – 300 ביצים משומנת ההשרצה. מפעל פלסטיק שמנונית תוויות יכול לשמש כמו כפית כדי להעביר ביצים התבנית המשומנת ההשרצה. מוסיפים 1-2 מ של הפתרון זרע (מתוך שלב 2.5) הביצים ומערבבים בעדינות. היחס של הזרע אל הביצית צריכה להיות כ זרע/ביצה 11,000.
  7. להוסיף מים מתוקים על הביצים כדי להפעיל את הזרע ואת הביצים. מוסיפים מים לכיסוי מעט את הביצים. מערבולת בעדינות את הביצים עבור הפריה ס' 30 צריכה להתרחש ב- 1-2 דקות. חשוב לדשן ביצים אשר מסודרים בשכבה אחת בלבד. שפמנון ביצים לדבוק אחד את השני ומקשה על microinject שכבות מרובות של העוברים.
  8. להוסיף יותר מים מתוקים על הביצים ולאפשר את הביצים להקשיח למשך 10-15 דקות.
  9. מכסים את התבנית ההשרצה המכילה את הביצים הנותרות מופרית על-ידי מגבת רטובה כדי למנוע ייבוש, לדשן במשך כמה שעות. הפריה יכול להיעשות באופן רציף, לדוגמה, אצווה אחת של 200 – 300 ביצים יכולה להיות מופרית כל 30-60 דקות להבטחת אספקה רציפה של העוברים בשלב תא אחד עבור microinjection ושליטה ללא הזרקת עוברי. יש למנוע מגע בין מגבת רטובה את הביצים כמו הביצים עשויים לדבוק מגבת רטובה ולכן קשה להסיר אותם. פרוטוקול זה, ביצים מופרית תוך 2-3 h אחרי ששללו היו microinjected ביעילות, היה להצלחה דומה ביצים מופרית מיד לאחר בנוכחות אחר.

4. המחט משיכת וטעינה

  1. משוך על נימי זכוכית בורוסיליקט OD 1.0 מ מ לתוך 2 מחטים (איור 3). אחסן את המחטים בתוך קופסה נייר עם חתיכת ספוג שבו נעשו מספר חתכים. כדי למנוע את שבירת המחט, הקוטר של הספוג צריך להיות קטן יותר מאשר אורך הגבעול מחט.
  2. פתח את מחט על ידי שבירת חלק קטן הדק באזור של המחט באמצעות חפץ חד. לחלופין, פתח את המחט על ידי צובט את האזור הדק של הקצה עם מלקחיים מתחת למיקרוסקופ.
  3. הכן את הפתרון הזרקת על ידי ערבוב gRNA(s) עם חלבון Cas9. סוגים אחרים של RNA או החלבון גם יכול להיות מוזרק עם ההליך אותו. ב פרוטוקול זה, gRNAs היו נועדה מטרה שתיים של ערוץ שפמנון המערכת החיסונית קשורים גנים, אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן וג'ין לקטין (RBL) מחייב rhamnose, המוכנים לפי שאה ואח. עם השימוש דיוק גבוה Taq פולימראז32,39. המטרות גנומית עבור gRNAs היו 5' לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה GGT גה GCA מס רווחי הון CGA לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה 3' עבור טיקם 1 ג'ין (איור 4) ו- 5' לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה CTT TGA GTC לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה גה חברתנו G 3' עבור אקסון 1 לייעו RBL עם מוטיב סמוך protospacer (פאם) רצף בקו תחתון (איור 6).
    1. הפיצוץ מטרות מדריך RNA כנגד הגנום ערוץ שפמנון רצף ובחר אלה עם אין אתרי חופש-יעד פוטנציאליים.
    2. להוסיף פנול אדום צבע החלבון gRNA/Cas9 לערבב כדי שליש מהנפח הכולל.
    3. להתאים את הריכוז הסופי של החלבון gRNA/Cas9 לערבב עם מים חינם נוקלאז כך כל העובר מוזרק עם 50 nL המכיל כ 2.5 ng gRNA וחלבון ng Cas9 7.5. דגירה את התערובת למשך 10 דקות על הקרח לפני השימוש.
  4. כאשר microloader, טען µL 5 – 10 של תערובת gRNA/Cas9 לתוך המחט הזרקת על-ידי הוספת את microloader לתוך הגבעול מחט וגירשו את התערובת באיטיות תוך פותחים את הטיפ microloader (איור 3). למנוע השמנה בועות אוויר בתוך.
  5. לצרף את המחט בעל micropipette להבטיח חיבור חזק, ואז לצרף המחזיק micromanipulator. ודא לחופש תנועה יציבה. הפעילו לחץ על microinjection על-ידי פתיחת הגליל חנקן והזזת את וסת הלחץ.
    הערה: עוצמת הזריקה יכולה להיות מושפעת הלחץ, קוטר הצמצם המחט ומשך ההזרקה. כדי לקבוע את עוצמת הקול כדי להזריק, מזריקים לתוך טיפה של שמן מינרלי מונחת על hemocytometer. אם יש צורך, הלחץ, משך הזרקה, ואת קוטר המחט יכול להיות מותאם כדי להגדיל או להקטין את עוצמת הזריקה. מזריקים מספר פעמים לתוך שמן מינרלי כדי להבטיח נפח עקבית.

5. microinjection של העוברים שפמנון

  1. למרוח שכבה דקה מאוד של צמחי על צלחת פטרי נקי 100 מ מ.
  2. באמצעות תווית שמנונית מפעל פלסטיק, להעביר 50 – 100 ביצים למחבת הפריה הפטרי, לכסות אותם עם הפתרון של Holtfreter (חומרים טבלה). יישר את הביצים אחד נגד השני בשכבה אחת בלבד. יישור זה אמור להחזיק את הביצים במקום במהלך תהליך microinjection.
  3. מניחים על צלחת פטרי עם הביצים על השלב של המיקרוסקופ והחזק אותו עם יד אחת. להנמיך את המחט ביד האחרת (איור 3) עד זה מפלח את chorion ואת החלמון בתנועה אחת חלקה. קצה המחט צריך להיות הכי קרוב ככל האפשר כדי blastodisc לפני מסירת החומר הזרקה.
    1. לדכא את דוושת ולהעביר את החומר הזרקה לתוך החלמון. אם blastodisc לא נראה בבירור, הזרקת החומר יכול להיות להתפשט לתוך במקומות שונים בהחלמון. כדי לעשות זאת, המחט מוחדרת לקצה הרחוק של החלמון, ולאחר מכן מדכא את דוושת וחוזר חלילה את המחט נעשים בו זמנית כדי להפיץ את החומר הזרקה דרך אזורים שונים של החלמון. עד 50 nanoliters יכול להיות מוזרק לתוך החלמון של ערוץ שפמנון עוברי, עם זאת, כמות החלבון gRNA/Cas9 צריך להיות מותאם עבור כל ג'ין להשיג את התוצאות הטובות ביותר עבור מוטציה קצב ואת העובר הישרדות32.
  4. . משכי את המחט בצורה חלקה כדי לא לגרום נזק הביצה. הזז את צלחת פטרי להחדיר ביצה נוספת לאותו התהליך. הימנע תנועת הפטרי בעת תהליך ההזרקה כמו זה עלול לגרום נזק הביצה או תשבור את המחט. הסר ביצים קרוע או ניזוק עקב microinjection. הזרקת ניתן להתחיל 15-20 דקות לאחר ההפריה ולהמשיך כל עוד העוברים נמצאים עדיין בשלב תא אחד (עד בערך 60-90 דקות לאחר ההפריה).
  5. מקום עוברי מוזרקים חזרה הפתרון של Holtfreter עם 10 עמודים לדקה של דוקסיציקלין ו לערבב בעדינות רציפה במשך 6-7 ימים עד הבקיעה40. לשנות את הפתרון מדי יום ולהסיר את העוברים מת.

6. זיהוי המוטציה

  1. באופן אקראי, לאסוף את מספר העוברים מוזרק ב 72 h שלאחר ההפריה, להסיר את החלמון ולחלץ הדנ א. כוללות 3-5 ללא הזרקת עוברי פקד.
    הערה: הדנ א הגנומי יכול להיות מופק העוברים לאחר הסרת קליפות ביצה, חלמון חומר באמצעות עיכול proteinase K ואתנול משקעים32.
  2. להגביר את מקטע ה-DNA איגוף המטרות גנומית עבור gRNA של כל גן, שבו מוטציות צפויים להופיע, שימוש של דיוק גבוה Taq פולימראז32. עבור טיקם 1, תחל 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (קדימה) 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (הפוכה) שימשו כדי להגביר את 750 bp בזמן RBL, תחל 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (קדימה) ו 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (הפוכה) היו רגילים להגביר את קטע bp 375 מן הגן RBL.
    1. השתמש התגובה PCR הבאים: עד 20 µL PCR כיתה מים; דיוק גבוה x 1 מאגר תגובת האנזים Taq עם MgCl2, מ מ 0.2 dNTP לערבב, מיקרומטר 0.4 לכל אחד הראשיים ואחורה. של אותה קבוצה, 100-300 ng הדנ א ויחידות 1.25 מתערובת אנזים Taq דיוק גבוה. לבצע PCR תנאי הרכיבה: דנטורציה הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 35 מחזורי דנטורציה ב 94 ° C ל 30 s, חישול ב 60 מעלות צלזיוס במשך 55 s עבור טיקם, ו- 40 s עבור RBL, סיומת ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה/kb; והסיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות.
  3. לזהות את העוברים מוטציה באמצעות שיטה לזיהוי מוטציה כגון רצף של מוצרי ה-PCR מטוהרים, מודד מוטציה זיהוי assay, heteroduplex ניידות assay, אובדן של אנזים הגבלה זיהוי האתר, או כל מוטציה זיהוי שיטה אחרת זה מתאים למטרה. ב פרוטוקול זה, לזהות מוטציות עוברי שימוש assay זיהוי המוטציה מודד טיקם 1, אובדן של אנזים הגבלה ש-sapi לחתוך באתר, כמו גם רצף של מוצרי ה-PCR מטוהרים RBL ג'ין.
  4. כדי לזהות אללים mutant, לשכפל PCR מוצרים ווקטורים רצף של מושבות בודדות. אללים mutant המוצגים באיור 4 ו- 6 איור בא מן העוברים מוזרק. מוצרי ה-PCR 6-microinjected, העוברים בקרה 3 עבור כל ג'ין היו איחדו שני צינורות נפרדים, אחד עבור עוברי microinjected, השני עבור עוברי שליטה במהירות משובטים ווקטורים 86 עבור 1 טיקם ווקטורים 48 עבור RBL ג'ין וסודרו, כולל 8 קביעת רצף תגובות 3 שליטה ללא הזרקת העוברים על כל הגן.
  5. כדי לזהות אללים mutant שונים, להשוות את רצפי מעוברים מוטציה רצף פראי סוג באמצעות כל כלי היישור של רצף DNA כמו הפיצוץ או T-קפה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול microinjection, gRNAs שנועדו למקד את השפמנון ערוץ אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן וג'ין rhamnose איגוד לקטין (RBL) היו microinjected.

טיקם 1
רצפי DNA של וקטורים של מושבות בודדות ממוצרים PCR במאגר, משובטים חשף מוטציות ויאסין המושרה בטיקם 1 ג'ין. שיעור מוטציה היה 79% ב- 24 אנשים שנותחו. דוגמאות של מוטציות מומחשים איור 4 , איור 5. השפעות ויאסין מוטציות בגן TICAM1 קידוד רצף של שפמנון ערוץ על חלבונים החזוי האורך ואת רצף לעומת הרצף פראי סוג מומחשים טבלה 1. מוטציות מחיקה כתוצאה מהסרת כמה כדי מספר חומצות האמינו של החלבון החזוי, שמוביל שינוי המסגרת הקריאה במורד הזרם, בטרם עת הפסקת התרגום (טבלה 1).

ברוב המקרים, יותר מ- 80% של רצף החלבון החזוי נחתכה עקב codon עצירה מוקדמת. במקרים אלה, האורך מפוליפפטיד החזויים נע בין 91 אל שאריות חומצה אמינית 106 (סוג פראי טיקם 1 יש שאריות חומצה אמינית 520). מוטציות עם חלבון מאוד קטום צפויים לייצר חלבון פונקציונלי. במקרה של 87 bp מחיקה המוטציה (טבלה 2, איור 4), חומצות אמינו 29 הוסרו מן החלבון מבלי לשנות את מסגרת הקריאה. ההשלכות פונקציונלי של מוטציות כאלה צריך להעריך השפעול.

RBL
רצפי DNA של וקטורים של מושבות בודדות ממוצרים PCR במאגר, משובטים אישרו הנוכחות של מוטציות ויאסין (איור 6). שיעור מוטציה היה 88% ב- 40 אנשים שנותחו. מחיקות נע בין 5 bp ל 183 bp, תוך עד 20 bp הוכנסו. מעניין, המחיקות bp 183 הוסרו לחלוטין אינטרון 1, bp אקסון 2 ו- 19 מאינטרון 2. באופן תיאורטי, זה אמור להשפיע של שחבור של הגן RBL מאז האתרים splice יש מוטציה.

מוטציות ויאסין היו תופעות משתנה על הרצף חלבון החזוי בהשוואה פראי סוג חלבון הרצף (שאריות חומצה אמינית 308) (טבלה 2). יותר מ 70% של indels הביא חלבון קטום החזוי הוא 10% או פחות אורך החלבון פראי סוג. כמה indels (מוטציה מספר 4, 5 ו- 6), היה מפוליפפטיד החזוי פחות מ-10 חומצות אמינו. רק 2 מקרים (מספר 2 ו- 3) הביא למחיקה של 2 ו 4 חומצות אמינו בחלבון החזוי מבלי לשנות את מסגרת הקריאה אשר או לא משפיעה על הפונקציה חלבון.

מוטציות דו-allelic היו המושרה עם שני gRNAs אחרים (Elaswad et al., שלא פורסמו) שבו שני כרומוזומים היו מוטציה כמה עוברי, אללים פראי סוג לא אותרו. עם אלקטרופורזה בג'ל של מוצרי ה-PCR, העוברים האלה היה רק אחד הלהקה היה קצר יותר מאשר הלהקה פראי סוג (יותר מ-200 bp מחיקה). רצפי DNA של מוצרי ה-PCR משובטים אישרו הנוכחות של היחיד אלל mutant ב כל כיווני וסודרו מ אחד העובר (homozygous biallelic מוטציה) תוך שני אללים mutant ארע שלאחרים (מוטציה biallelic משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים). ב כמה אחרים העוברים היו פסיפס בשביל המוטציה, מוטציה (עד 4 אללים) והן אללים פראי סוג אותרו על ידי רצפי DNA של מוצרי ה-PCR משובטים.

Figure 1
איור 1 : סיכום של נהלי שפמנון ערוץ אחד-תא microinjection (Ictalurus punctatus) העוברים עם gRNA/Cas9 חלבון כדי לעלף אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן, rhamnose איגוד הגנים לקטין (RBL). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : האשכים וביצים של ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus . (א) מפותח האשכים של ערוץ שפמנון הזכרים הם לבן עם תחזיות villiform רבים. (B) ביצים טעימות מן הנקבות ערוץ שפמנון הם זהב צהוב צבע עם מינימלי או אין קרישי דם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Microneedle מושך, וטעינה של microinjection של שפמנון ערוץ אחד-תא, Ictalurus punctatus , העוברים. (א) מחט מושך עם פולר המחט אנכי. מבנה המחט ואת קוטר מושפעים החום של חוט הלהט החימום ואת הכוח ברז חשמלי. Microneedle (B) טעינה עם השילוב CRISPR/Cas9 באמצעות טיפ microloader. (ג) סידור של ערוץ שפמנון עוברי בצלוחית 100-מ מ המכיל הפתרון של Holtfreter. Microneedle היא יורדת עד שזה נוגע מפלח את הביצה. (ד) מוגדל הוקצה ' בחלונית ' ג מציג את התהליך של פירסינג הביצה. הערה קצה המחט דוחף את הקרום שליה פנימה, אך לא חדרו לתוכה עדיין. עוברי מוזרק יש חומר הזרקה אדום בפנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : CRISPR/Cas9 המושרה מוטציות בגן אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן קידוד רצף של ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus . רצף הכחול מייצג מוטיב סמוך protospacer (פאם) בעוד הרצף הירוק מייצג את היעד עבור gRNA. כפול strand break המושרה על ידי חלבון Cas9 היה צפוי להופיע באתר של המשולשים האדומים 2. מוטציות מוקצים מספרים 1 עד 8. מחיקה מוטציות מיוצגים באמצעות קו מקווקו שבו כל מקף מקביל נוקלאוטיד נמחקה. רצפים אדום הינם הוספות בעוד סגול מייצגת החלפת מוטציה. שברים של 78 מייצגים את המספר של אללים מוטציה ב- 78 רצף תגובות (למשל, 3/78 אומר כי אלל זוהה 3 רצף תגובות מצד סך של 78 תגובות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : מוטציות ויאסין לשפמנון ערוץ, Ictalurus punctatus , אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן קידוד רצף שנגזרות microinjection gRNA/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון תא אחד העוברים כפי chromatogram רצפי דנ א. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : CRISPR/Cas9 המושרה מוטציות בגן rhamnose איגוד לקטין (RBL) של ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus . רצפים exonic הם אותיות רישיות, בעוד intronic רצפי אותיות קטנות. רצף הכחול מייצג מוטיב סמוך protospacer (פאם) בעוד הרצף הירוק מייצג את היעד עבור gRNA. הפסקה גדיל כפול שנגזרות Cas9 חלבון היה צפוי להופיע באתר של המשולשים האדומים 2. מוטציות מוקצים מספרים 1 עד 9. מחיקה מוטציות מיוצגים באמצעות קו מקווקו שבו כל מקף מקביל נוקלאוטיד נמחקה. רצפים אדום הינם הוספות. שברים של 40 מייצגים המספר של אללים מוטציה ב- 40 רצף תגובות למשל 2/40 אומר כי אלל זוהה 2 רצף תגובות מצד סך של 40 תגובות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מוטציה הכניסה מחיקה שינוי נטו (Δ) אורך החלבון (חומצת אמינו) Frameshift השתנה מוקדמת stop codon חלבון החזוי רצף
WT 0 0 0 520 לא לא MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST
ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS
PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF
RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG
GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ
ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS
STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL
LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL
LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM
AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW
LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ
HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS
PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM
TVGGGVDSGDEDNF
(GenBank: NP_001187154.1
1 0 5 -5 104 כן כן MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS
HNQ
2 5 40 -35 94 כן כן MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS
GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF
KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ
3 0 87 -87 491 לא כן MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE
AKPSSPLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQ
LEKFKFRQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFL
SIPSGGGKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSF
STEKQASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKS
RLESISSTIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSA
YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN
TVIPLLPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDT
FEKMAKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREK
QQWLQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQ
QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP
SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST
MTVGGGVDSGDEDNF
4 3 131 -128 95 כן כן MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG
5 1 0 1 106 כן כן MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
6 1 0 1 106 כן כן MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
7 14 0 14 100 כן כן MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA
8 35 9 26 91 כן כן MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV

טבלה 1: ההשפעות של מוטציות ויאסין האגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן קידוד רצף של ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, על חזה אורך חלבונים (חומצות אמינו), רצף ביחס אל הטבע הקלד רצף (WT).

מוטציה הכניסה מחיקה שינוי נטו (Δ) אורך החלבון (חומצת אמינו) Frameshift השתנה מוקדמת stop codon חלבון החזוי רצף
WT 0 0 0 308 לא לא MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR
LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT
NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE
IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL
SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT
VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT
DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE
EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
(GenBank: AHJ14694.1) 53
1 0 5 -5 29 כן כן MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
2 0 6 -6 306 לא לא MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT
CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN
CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI
EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT
LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL
TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR
TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC
EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
3 0 12 -12 304 לא לא MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE
TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA
LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK
YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA
NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA
AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI
CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST
TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS
SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
4 0 16 -16 6 כן כן MMLFLN
5 0 183 -183 8 לא כן MMLFLKRI (בהנחה שחבור אינה משתנה)
6 1 183 -182 5 כן כן MMLFL (בהנחה שחבור אינה משתנה)
7 1 0 1 31 כן כן MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
8 1 0 1 31 כן כן MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
9 20 0 20 18 כן כן MMLFLKASSHISSSASSP

בטבלה 2: ההשפעות של מוטציות ויאסין rhamnose איגוד הגנים לקטין (RBL) של ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, חזה אורך חלבונים (חומצות אמינו), רצף לעומת הרצף פראי סוג (WT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הוצג פרוטוקול מפורט עבור microinjection של ערוץ שפמנון העוברים על מנת להשיג נוקאאוט גנטי. הזרקה של חלבון CRISPR/Cas9 החלמון היא הרבה יותר פשוטה, חוסך זמן, אינה דורשת הכשרה נרחבת בהשוואה microinjecting של blastodisc של העובר תא אחד, אשר הוא הטכניקה נפוצה ברוב העברה גנטית ועריכה ג'ין עם דגים 30 , 42. בפרוטוקול הנוכחי הוכיח כדי להיות מוצלחת וגורם indels של שפמנון ערוץ 1 טיקם ו RBL גנים. הליכים אלה אמין ויעיל להניח את הבסיס ליצירת הגן העתידי הסתרה בתוך הערוץ שפמנון. ניתן לשנות את הפרוטוקול היעד גנים אחרים בגנום שפמנון הערוץ באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, או בהתאמת טכנולוגיות אחרות ג'ין כדי שפמנון, כגון transgenesis tol2 מתווכת. זה גם שווה הערכה בתחום מינים שפמנון אחרים כגון לשפמנון כחול (אני furcatus), אשר חשובים מבחינה מסחרית וביצים שלהם נראה להיות רגיש לטיפול יותר ערוץ שפמנון ביצים. עם זאת, אם gRNAs או חומרים פעילים ביולוגית כגון ה-DNA או mRNA אחרים כדי להיות מוזרק, הפרוטוקול ייתכן שתצטרך להיות מותאם כדי לקבוע את התנאים הטובים ביותר.

בפרוטוקולים עבור microinjection של עוברי דגים, הליכים microinjection חולקה לשתי קטגוריות עיקריות: הזרקה לתוך תאים עובריים ו הזרקה לתוך החלמון. ב- medaka, morpholinos היו מוזרק לתוך הציטופלסמה של התא אחד העוברים ללמוד תהליכים התפתחותיים שונים ויוו41. ב ערוץ שפמנון, CRISPR/Cas9 mRNA מיקוד הגן GnRH היו microinjected לתוך blastodisc של תאים אחד העוברים30. בתוך שלוש – spined stickleback (Gasterosteus aculeatus), blastomeres היו microinjected כדי ליצור הסתרה של transgenics, ג'ין-42. מצד שני, דג זברה תא אחד העוברים היו הזריק החלמון morpholinos לתמרן החלבון Heart of Glass (Heg), שהוכחו יעילים43. אלה 2 סוגי הגישה יש יתרונות וחסרונות, אבל אם שניהם להוכיח שיש את אותה מידת יעילות עבור בני אותו מין, חלמון microinjection של תאים אחד העוברים יהיה מועדף מכמה סיבות.

החלמון microinjection היא פחות פולשנית כדי העוברים, שכן המחטים microinjection פירס לא התאים מתחלקים. בנוסף, רבים העוברים יכול להיות מוזרק תוך תקופה קצרה בזמן העוברים נמצאים עדיין בשלב התא הראשון. יש צורך ליישר את העוברים במצב מסוים. זה גם לחסוך זמן, להפחית את הלחץ של הטיפול של העוברים. עונתיות ההשרצה דגים יש זמן מוגבל ההשרצה ב כשכל ההליכים צריך להיעשות כדי להשיג כיסוי מוצלח. ב ערוץ שפמנון, עונת ההשרצה נמשך בערך חודשיים44. לכן פיתוח פרוטוקול microinjection מהירה ויעילה יאפשר microinjection של רבים העוברים היעד גנים רבים בפרק זמן קצר זה. למרבה המזל, שפמנון ערוץ יכול להיות באופן מלאכותי הוליד כדי לספק מספר גדול מספיק של העוברים על microinjection להתגבר על תמותה גבוהה בשל הליכים microinjection45. בנוסף, ניתן לשלוט בזמן ההפריה כדי להבטיח שהעוברים נמצאים בשלב אחד-cell בעת הצורך.

Microinjection של CRISPR/Cas9 המושרה indels של מיני דגים שונים כולל דג זברה, סלמון אטלנטי (Salmo סאלאר ל'), אמנון הנילוס (Oreochromis niloticus), ערוץ שפמנון, אטלנטיק דגים גמבוזיים (Fundulus heteroclitus) 46, ו משותף קרפיון5,30,46,47,48,49,50. בנוסף, מערכת CRISPR/Cas9 שימש כדי לשבש גנים קרפיון Labeo rohita ויה הומולוגי בתיווך רקומבינציה החדרת דנ א זר לתוך הגנים יישוב51. ב פרוטוקול זה, indels מוצלח היו המושרה ברצף קידוד עם השפעות דרמטיות על הרצף חלבון החזוי, כולל מוטציות frameshift וכתוצאה מכך מוקדמת stop codon. ההשפעות פנוטיפי של מוטציות אלו עדיין צריך להיחקר. MRNAs קטום סביר השפיל דרך בתיווך שטויות mRNA דעיכה (NMD) בשביל, וכתוצאה מכך הפחתת או עיכוב של הביטוי, ו אם הביע, חלבונים קטום צפויה להיות מתפקד52,53 .

בניסוי שלנו עם הגן RBL, שני סוגים של מוטציות (מספר 5 ו-6), גרמו מחיקה של 183 bp לחלוטין הסרת מחצית אקסון 1, אינטרון 1, אקסון 2, וחלק אינטרון 2. באופן תיאורטי, זה סוג של מוטציה עשוי לשנות את שחבור של RBL pre-mRNA. מוטציות באתרים splice לעכב את היכולת של ספלייסוזום מזהה את אקסון54.

לסיכום, הפיתוח של פרוטוקול אמין יעיל עבור ג'ין יישוב עריכה בשפמנון ערוץ חיוני ללמוד גנומיקה תפקודית, במיוחד אחרי המשאבים גנומית יש מועשר רצף האחרונות של השפמנון ערוץ הגנום. ההליכים המתוארים כאן הם פשוט, מהיר אבל יעיל, הם הוכיחו להשיג בהצלחה נוקאאוט גנטי. שני גנים, טיקם 1 ו RBL, ממוקדים כדי להדגים את היעילות של CRISPR/Cas9 הסתרה באמצעות microinjection. תלוי מה להיות מוזרק, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי לכלול חומרים פעילים ביולוגית אחרים. זה יכול להיות גם שונה כדי microinject מינים אחרים שפמנון או מינים אחרים של דגים בעלי מבנה דומה ביצה ו הלחנה. פרוטוקול זה נעוץ את היסודות נוקאאוט גנטי ערוץ שפמנון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי משרד החקלאות-NIFA פרס 2015-67015-23488 רוג'ר חרוט. המחברים מודים ד ר רונלד פלפס על התיאור של קריטריוני הבחירה מניות שבוחרים וידאו. אחמד Elaswad, כרים חליל רוצה להודות את התרבות המצרית, הלשכה חינוכיים בוושינגטון למימון המחקר Ph.d. שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

גנטיקה גיליון 131 CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה נוקאאוט גנטי microinjection העוברים ערוץ שפמנון מוטציה נחתך החלבון indels
Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, <em>Ictalurus punctatus</em>, העוברים עבור ג'ין עריכה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D.,… More

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter