Summary
CRISPR/Cas9 システムを用いたチャネル ナマズ胚の遺伝子を編集するための簡単かつ効率的なマイクロインジェクション プロトコルが表示されます。このプロトコルでは Rna、ガイドし、Cas9 蛋白質は 1 細胞期胚の卵黄に microinjected いた。このプロトコルは、2 つのチャネル ナマズ免疫関連遺伝子をノックアウトによって検証されています。
Abstract
アメリカナマズ遺伝子機能を勉強する大きな機会につながる、アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイの完全なゲノムが配列されています。遺伝子ノックアウトは、これらの遺伝子機能の生体を研究に使用されています。クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは、遺伝子の機能を変更するゲノム DNA 配列を編集するための強力なツールです。従来のアプローチは、マイクロインジェクションによる単一細胞期胚に CRISPR/Cas9 mRNA を導入してきましたが、ナマズの遅く、非能率的なプロセスをすることができますこの。ここでは、CRISPR/Cas9 蛋白質とアメリカナマズ胚のための詳しいプロトコルを説明します。簡潔に、卵子と精子は、収集し、人工受精を実行をだった。受精卵は、Holtfreter のソリューションを含むペトリ皿に移されました。注入量が校正され、ガイド Rna/Cas9 ターゲット フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM 1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子は 1 細胞期胚の卵黄に microinjected いた。オクターリピートされた DNA の配列によって確認された遺伝子ノックアウトに成功しました。これらの突然変異のための予測された蛋白質シーケンス変更フレーム シフトを含めるし、時期尚早停止コドンによる蛋白質を切り捨ています。
Introduction
マイクロインジェクション、細胞または胚ガラス毛管1を DNA、RNA、タンパク質、および他の高分子などの物質の少量を提供するために使用一般的な検査手法です。インジェクションは、マイクロ、マイクロマニピュレーター、顕微鏡2など特別な機器セットアップを使用して実行されます。手法は、遺伝子を通じて世代遺伝子組み換え、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子療法の細胞内構成要素3,4のダイナミクスを理解することを目的とする生物の多くを変更するのには研究者によって使用されています,5。
アメリカナマズ (Ictalurus イシガキダイ) は養殖に最も人気のあるナマズの種とアメリカ合衆国の遊漁船活動。チャネル ナマズの機能ゲノミクスの研究がますます必要あり、アメリカナマズの完全なゲノムの配列ゲノム編集ツール6、7の最近の進歩の有用性を高めます。遺伝子機能の理解だけはナマズ、実施されている研究の充実がないが、ナマズ産業を強化するより効果的な遺伝的改良プログラムにも 。興味の特定の特性の重要な遺伝子を特定すると、遺伝的有利な対立遺伝子を生成するゲノム編集によるナマズ生産を転送する、有害な対立遺伝子を抑制すること、これらの対立遺伝子の選択を改善するために使用できます。遺伝子導入、またはこれらのオプションのいくつかの組み合わせを有利な対立遺伝子。1 つの魚の種から商業的に有益な特性の異なる最高の遺伝子を組み合わせることによって、生産性と収益性魚生産操作8を大幅向上させるでしょう。
遺伝子ノックアウトは、遺伝子機能の生体を研究する直接法です。DNA レベルでの突然変異は、さまざまな世代の効果の研究を容易にする将来の世代に継承されます。異なるゲノム編集ツール開発含む亜鉛指核酸 (ZFNs)、転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) して定期的に空間短い回文繰り返し/CRISPR 関連タンパク質 9 (CRISPR/Cas9 をクラスター化) システム9,10、11,12。
CRISPR/Cas9 システムから RNA 誘導部位特異的 DNA 胸の谷間5,13魚の遺伝子ノックアウトを含むゲノムの DNA 配列を編集する使用されている強力な効率的なツールです。システムは、ゲノム DNA エンドヌクレアーゼ酵素、Cas9 で対象のシーケンスを決定するガイド RNA (gRNA) で構成されます。ZFNs と TALENs 上のいくつかの利点とのゲノムの任意のシーケンスをターゲットに CRISPR/Cas9 システムを設計することができます: (1) 低コスト (2) 簡単に工学ガイド RNA ターゲット シーケンスに結合した (3) より特定化したターゲットを突然変異 (4)複数のシーケンスが変更されません TALENs とまでの変異の (6) の改善された生殖伝送速度 6-fold ZFNs と TALENs14と比較した場合の遺伝子の同じ時間 (5) 高い突然変異率の異なる gRNA の対象になることができます。 15,16,17,18。
マイクロインジェクションの主な方法として、エレクトロポレーション、電気衝動が胚又は細胞膜の透過性と生体分子19,20の吸収を高めるために適用されます。いくつかの遺伝子導入魚はメダカ (メダカ)、ゼブラフィッシュ (動脈分布)、マスノスケ (オンコルヒュンクス ・ tshawytscha)、アメリカナマズ、鯛 (Sparus sarba) などのエレクトロポレーションを使用して生成された、一般的な鯉 (コイ)21,22,23,24,25,26。
エレクトロポレーションは遺伝子ノックアウトのプラスミド Cas9 の DNA、RNA および蛋白質を提供する使用されています。哺乳類セルの Cas9/gRNA プラスミド DNA Cas9 mRNA/gRNA、および Cas9 タンパク質/gRNA 複合体は、エレクトロポレーションを使用して配信され、突然変異誘発率はほとんどエレクトロポレーション テスト条件27Cas9 蛋白質/gRNA 錯体を用いた最高だった。マボヤ脊索動物 (ユウレイボヤ)、TALENs の構造を表現する複数の遺伝子28のノックアウトを誘発する受精卵に electroporated だった。ZFNs プラスミドの構成要素表現されたアメリカナマズ29黄体形成ホルモンをノックアウトする electroporated。ただし、一度細胞に導入し、プラスミドの構造必要があります RNA に転写、RNA のマイクロインジェクションに比べて突然変異誘発の時間を遅らせる可能性が高い目的の DNA シーケンスをターゲットすることができます前に機能性タンパク質に変換/タンパク質。胚の開発は、遅延変異は注入された創設者のモザイクを増加します。さらに、遺伝子組換え発現はマイクロインジェクション、変異導入効率を下げることで発現レベルを達成する可能性はありません。
細胞にゲノム編集ツールを導入するための手段としてマイクロインジェクション エレクトロポレーションにいくつかの利点があります。ゲノムの分子の編集は、細胞または胚マイクロインジェクション30を確実に導入できます。以下の注入材料が必要です。注入される材料の量を決定するは簡単です。高い突然変異の創始者魚における低モザイクでレートすることができます達成 F1変異の生殖を改善するでしょう。創始者の少ない魚は高い突然変異率のための最初の世代を作り出すために分析される必要があります。エレクトロポレーションで創設者のより多くの魚は、コストが増加分析する必要。ただし、アメリカナマズ microinjected 胚の生存はより多くの胚31,32を注入することによってこれを克服するのに electroporated のものより低い。アメリカナマズ、16 〜 55%、対象遺伝子によって卵黄 microinjected 胚の生存、gRNA/Cas9 蛋白質32の投与量。
ナマズ胚の正規のインジェクションは技術的に難しく、時間がかかり、ただし、迅速かつ効率的な CRISPR/Cas9 蛋白質マイクロインジェクション プロトコルが表示チャネル ナマズ胚のため。このプロトコルでは、1 つの細胞胚の卵黄に CRISPR/Cas9 タンパク質溶液を注入するので以下の時間と専門知識が必要です。受精卵の数百は、1 h (約が発生する最初の細胞分裂に必要な時間) で注入することができます。プロトコルを検証するため、2 つ病感受性関連遺伝子はアメリカナマズ、フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプターの分子 (TICAM1) 遺伝子、ラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子のノックアウトされました。TICAM 1 は、toll 様受容体 (TLR) 3 によって開始されたシグナル伝達経路に関与しています。TICAM 1 チャネル ナマズのE. ictaluri33耐性種、青ナマズのダウンレギュ レートであった細菌愛媛 ictaluri課題、次亢進していた劇的に。RBL は、病菌 columnareカラムナリス病の病原の感染初期で重要な役割を果たしている、急性と堅牢なアップレギュレーションに比べてカラムナリス病感受性チャネル ナマズの緊張で記録された、カラムナリス病耐性株34。
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Protocol
この実験は、魚の遺伝学研究ユニット、e. w. シェル水産総合研究センター、オーバーン大学、アラバマで行われました。この実験で使用されるすべての実験的プロトコルは、実験が開始される前にオーバーン大学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC-AU) によって承認されました。この実験で使用される材料・機器リストは、材料表で見つけることが。以下に、手順と手続きの準備とアメリカナマズ 1 細胞期胚の図 1に示します。
1. くよくよ銘柄選定と産卵
- ひずみまたは関心の遺伝的系統から健全なアメリカナマズひな株式を選択します。アメリカナマズの男性と女性は、良い二次性徴を表わすべきであります。
- よく発達した性器乳頭で自分の体の残りの部分よりも広い広い筋肉ヘッドを持っている男性を選択します。暗い色、瘢痕、領土戦いから傷は、性的な準備の兆候です。自分の体の残りの部分よりも狭く、頭を持って女性を選択し、ソフト、触知可能なバランスのとれた腹部があります。精度と初期処理中に魚を強調を避けるためには、産卵のための準備を検討する前に 2-3 日、女性を餌を停止します。
- 魚が慎重に、迅速に処理を実行します。処理のストレスを減らすためには、産卵袋 (32 mm サイズ メッシュ) で魚を押しながら処理女性を必要とするすべての手順を実行します。
- 排卵を誘発するホルモン注射の直前に、女性の体重を測定します。
- 継続的な水の流れと十分なエアレーション タンクを通過する流れの中の女性と産卵の袋を掛けます。
- 無菌、黄体形成ホルモン放出ホルモン アナログ (LHRHa) インプラントの 85 μ g/kg を 14 G 針は注入をロードします。0.9% 滅菌生理食塩注射前に、と注射部位 (背側の筋肉) をすすいでください。45 ° の角度で、注入装置を挿入し、インプラントをリリースします。70% エタノールに浸した綿球で針と注射部位にスワイプを撤回します。
- 場所保有物タンクで産卵袋魚は水没、水水面下 15-20 cm。(上記 5 ppm の溶存酸素) 十分な通気と水質が良い高品質卵の排卵のため重要です。
- 水の温度を35度時間 (h) の関係を使用してに基づいて排卵時間を予測します。度 h 応答時間ホルモン注射と排卵 (h) 時間を = * 水の温度 (° C)。たとえば、900-1,000 度 h 応答時間の女性目されているホルモン注入時 25 ° C から 36-40 h通常、卵の最初のチェックは、ホルモン投与後約 36 h、4 h の間隔で行われます。
- で排卵をチェックするには、産卵バッグ内側に取り付けられている卵を捜している間水面上産卵袋がフワリします。少なくとも 10 卵を見てこの女性は排卵と手除去のため準備ができていることを示します。
2. 精子の準備
注: 精子予想される排卵時間前に少数の時間を準備することができます。
- 麻酔は、精子の運動に悪影響を及ぼすかもしれないので麻酔なしで、頭にパーカッシブな打撃によって男性を安楽死させます。
- 小秤量皿に睾丸を収集、任意の組織を削除し、必要に応じて血液を削除する 0.9% 生理食塩水 50 mL で洗浄します。よく発達した精巣は白 villiform 突起が無数に (図 2) です。
- 睾丸の重量を決定します。
- 精子ソリューションを卵の受精の準備、精巣を鉗子を使用して 100 cm2 100 μ m メッシュのセンターに転送します。精巣精巣中にクラッシュを使用してメッシュを折るし、50 mL のコレクション チューブに精子をフィルターします。これは、親指を経由して、コレクション チューブの縁に対してメッシュ内の精巣に圧力を適用することによって行うことができます。0.9% 食塩を使用して、コレクションの管にメッシュから精子を洗浄します。食塩は、精巣の 10 mL/g まで追加できます。
- 精子の濃度、運動性および生存率をチェックしてください。
注: 濃度は希釈容積の分かっている白子の診断で精子細胞をカウントすることによって決定できます。また、分光光度計を使用して白子の光学密度を評価することによって精子密度を推定できます。この方法では 505 nm の波長で吸収は以前精子36の異なる濃度の吸収のために準備されている管理図と比較されます。精子の運動は、精子運動 (運動期間と呼ばれる)37の停止まで精子の活性化からの時間として、顕微鏡下でチェックできます。実行可能な精子無染色まま実行可能なだけの精子細胞を染色トリパン ブルーなど選択的色素を持つ精子を染色して、精子の生存率を決定できます。ただし、マイクロインジェクション手順、これは精巣がよく発達している場合は必要はありません。 - 4 ° C で 2.5 ステップから 0.9% 生理食塩水で精子を格納し、準備の後 24 時間以内に使用します。
3. 卵のコレクションと受精
- 直径 20 cm のきれいな乾いたパンを産卵に短縮野菜の非常に薄い層を適用します。
- 100 ppm の炭酸水素ナトリウムとバッファー tricaine メタン スルホン酸を含んだ麻酔液で女性の場所 (最終的な解決の pH は 7.0 であるべき) 魚は完全に麻酔38まで。
注意: Tricaine メタン スルホン酸刺激吸入、摂取または皮膚を通して吸収される場合があります。 - 慎重に、産卵の袋から魚を削除し、麻酔液を洗浄する 0.9% 生理食塩水に浸し。魚は、魚の体表の粘液層の除去を避け、清潔なタオルを使用して完全にオフに乾燥します。
- 植物性ショートニングを手剥離中に卵の付着を防ぐために、骨盤のフィンを含む口の周りの領域に適用されます。
- 手は、卵巣に穏やかな圧力を適用することによって産卵フライパンに卵をストリップします。良い卵が自由に流れる、色、黄金の黄色、最小限を持ってない塊や血栓 (図 2)。水は珠孔閉鎖を刺激することができます卵と受精する前に水との接触を避けてください。
- マイクロインジェクションの卵を受精させると、200-300 卵を産卵フライパンに転送します。油を塗ったプラスチック植物のラベルは、産卵フライパンに卵を転送するスプーンとして使用できます。精子ソリューション (ステップ 2.5) から卵への 1-2 mL を加え、軽く混ぜます。卵に精子の比率は、約 11,000 精子・卵をする必要があります。
- 精子と卵をアクティブに卵に淡水を追加します。少し卵をカバーするために十分な水を追加します。1-2 分で 30 s. 受精が発生するため、そっと卵を旋回します。単一の層で整理される卵を受精させることが重要です。ナマズ卵は、胚の複数の層を microinject が難しく、お互いに準拠します。
- 受精卵より淡水を追加でき、10-15 分を強化する卵。
- 乾燥を防ぐために、数時間にわたって受精濡れタオルで未受精卵の残りを含んでいる産卵鍋をカバーします。受精をずらして行うことができます、マイクロインジェクションと非注入コントロール胚の 1 つのセル段階の胚の連続供給を確保するため,の 200-300 の卵をすることができます 1 つのバッチが 30-60 分毎を受精するたとえば。卵がそれらを削除する困難にぬれたタオルに付着濡れタオルと卵との接触を避けてください。このプロトコルでは除去した後 2-3 時間以内の受精卵が効率的に microinjected し、いた卵同様の成功は、除去した後すぐに受精します。
4. 針を引っ張ると読み込み
- 2 針 (図 3) に 1.0 mm 外径ホウケイ酸ガラスの毛細管を引き出します。いくつかの切開が行われているスポンジの切れ端で紙箱に針を格納します。針を破損しないよう、スポンジの直径が針の幹の長さよりも小さい必要があります。
- 鋭いオブジェクトを使用して針の薄領域の小さい部分を分割することにより、針の先端を開きます。また、先端の薄領域を顕微鏡下で鉗子でつまんで針を開きます。
- Cas9 タンパク質と gRNA(s) を混ぜて注射液を準備します。他のタイプの RNA やタンパク質を注射して、同じ手順でこともできます。このプロトコルでは gRNAs はアメリカナマズ免疫関連遺伝子、フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子の 2 つをターゲットに設計されシャーらによると準備します。高品質な Taq ポリメラーゼ32,39を使って。GRNAs のゲノムのターゲットだった 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA TICAM 1 遺伝子 (図 4) 3' と 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' protospacer 隣接するモチーフ (PAM) RBL 遺伝子のエクソン 1 シーケンス下線 (図 6) のため。
- アメリカナマズ ゲノムに対して爆発ガイド RNA ターゲット シーケンスし、潜在的なターゲットを離れてサイトを持たないものを選択します。
- フェノールレッドをカラー gRNA/Cas9 蛋白質は総量の 3 分の 1 をミックスに追加します。
- それぞれの胚は 50 で注入されるヌクレアーゼ フリー水混ぜ gRNA/Cas9 タンパク質の最終濃度を調整 nL 約 2.5 ng gRNA と 7.5 ng Cas9 蛋白質を含みます。使用する前に氷で 10 分間混合物を孵化させなさい。
- Microloader と針の幹に、microloader を挿入する microloader チップ (図 3) を後退しつつゆっくりと混合物を追放して注射針に gRNA/Cas9 混合物の 5-10 μ L をロードします。内部に気泡を引っかけないように。
- マイクロ ピペット ホルダー付ける針とタイトな接続を確保するマイクロマニピュレーターにホルダーを取り付けます。無料の安定した動きを確認します。窒素ボンベを開き、圧力レギュレータを調整するマイクロインジェクションの圧力を適用します。
注: 注入量は、圧力、ニードル絞りの直径および注入の期間によって影響を受けます。鉱物油のドロップに注入を注入するボリュームを決定するには、診断に配置。必要な場合、注入量を増減する圧力、射出と針直径の期間を調整できます。鉱物油は一貫性のあるボリュームを確保するために複数回を挿入します。
5. ナマズ胚のマイクロインジェクション
- 植物性クリーン 100 mm ペトリ皿にショートニングの非常に薄い層を適用します。
- 油を塗ったプラスチック植物のラベルを使用して、ペトリ皿に受精パンから 50-100 卵を転送し、Holtfreter のソリューション (材料表) とそれらをカバーします。単一のレイヤーにお互いに対して卵を合わせます。この配置は、マイクロインジェクション プロセス中に場所に卵を保持する必要があります。
- 卵とペトリ皿を顕微鏡のステージに配置し、片方の手でそれを保持します。単一の滑らかな動きで絨毛膜や卵黄を貫くそれまでは、もう片方の手 (図 3) 針を下げ。針の先端は、注入材料を配信する前に、blastodisc にできるだけ近くする必要があります。
- 卵黄に注入材料を提供するペダルを押し下げます。Blastodisc が明確に表示されていない場合は、卵黄内の異なる場所に注入材料を広げることができます。針を挿入し、卵黄の遠端にし、ペダルと針を撤回、卵黄の異なる領域を介して注入材料の普及に同時に行われています。50 nanoliters までに注入することアメリカナマズの卵黄の胚は、しかし、gRNA/Cas9 の蛋白質の量は各遺伝子突然変異率および胚の生存のための32の最良の結果を達成するために最適化する必要があります。
- スムーズに針を撤回、卵を損傷しないようにします。同じ手順で別の卵を注入するシャーレに移動します。これが卵を損傷したり、針を破ると注入プロセス中にペトリ皿の動きを避けてください。破裂またはマイクロインジェクションによる建物損傷の卵を削除します。注入受精後 15-20 分で開始することができますコンティニュ (受精後約 60-90 分) までまだ 1 つのセル段階で胚がいる限りは。
- ドキシサイクリンと40を孵化まで 6-7 日間連続の穏やかな通気が 10 ppm と Holtfreter のソリューションに戻って挿入された胚を配置します。ソリューションを毎日変更し、死胚を削除します。
6. 突然変異の検出
- ランダムに、72 h ポスト受精でいくつか挿入された胚を収集、卵黄を削除およびゲノム DNA を抽出します。コントロールとして 3-5 非注入胚が含まれます。
注: ゲノム DNA は、卵の殻と卵黄素材プロティナーゼ K 消化とエタノール沈殿物32を使用しての除去後胚から抽出することができます。 - ゲノムの各遺伝子は、突然変異が、忠実度の高い Taq ポリメラーゼ32を使用して予想されるの gRNA 対象を並ぶ DNA のセグメントを増幅します。TICAM 1、5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG プライマーの 3' (フォワード) と 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (リバース)、750 を増幅する使用された RBL、5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA プライマーの中 bp 3' (フォワード) と 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (反転) しました。RBL 遺伝子から 375 bp セグメントを増幅します。
- 次の PCR の反作用を使用して: 最大 20 μ L PCR グレード水;1 x 高忠実度 MgCl2、0.2 mM dNTP Taq の酵素反応バッファーをミックス、それぞれ同じセット、100-300 ng の DNA と忠実度の高い Taq の酵素ブレンドの単位数として 1.25 の前方および逆のプライマーのための 0.4 μ M。PCR の循環状態を実行: 初期変性 94 ° c 3 分;35 サイクルの変性 94 ° C で 30 s、55 60 ° C で熱処理、TICAM の s と 40 の RBL、72 ° c 1 分/kb; 拡張用10 分のための 72 ° C で最終的な拡張子。
- 精製 PCR の製品、測量変異検出アッセイ、ヘテロデュプレックス易動移動性試金、制限酵素認識部位の損失のシーケンスなどの変異検出法やが、他の変異検出法を用いた変異胚を検出します。ターゲットに適しています。このプロトコルでは、TICAM 1 と RBL 遺伝子の精製 PCR 産物の塩基配列決定と同様、 SapIカット サイト制限酵素の損失のため測量変異検出法を用いた突然変異体の胚を検出します。
- 突然変異体の対立遺伝子を識別するために PCR の製品と個々 のコロニーからシーケンス ベクトルをクローンします。提示し、図 4と図 6突然変異体の対立遺伝子は挿入された胚から来た。6 からの PCR の製品の microinjected し、TICAM 1 と 8 を含むシーケンス、RBL 遺伝子の 48 のベクトルの 2 つの個別のチューブ、microinjected 胚の 1 つ、コントロールの胚は、急速に複製のための他と 86 ベクトルの各遺伝子の 3 コントロール胚を集めた各遺伝子の 3 コントロール非注入胚からの反応をシーケンスします。
- 別の突然変異体の対立遺伝子を識別するために変異胚からブラストや T コーヒーなど DNA シーケンスの配置ツールを使用して野生型シーケンスのシーケンスを比較します。
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Representative Results
マイクロインジェクション プロトコルの効率を示すためには、gRNAs チャネル ナマズ フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子をターゲットに設計された microinjected。
TICAM 1
プール、クローンの PCR の製品からの個々 のコロニーからのベクトルの DNA の配列は、TICAM 1 遺伝子の塩基変異を明らかにしました。突然変異率分析 24 個人で 79% であった。突然変異の例を図 4および図 5に示します。アメリカナマズのシーケンスを符号化 TICAM1 遺伝子の塩基変異の効果予測された蛋白質の長さと野生型のシーケンスと比較してシーケンスは表 1に示します。欠失変異体は、いくつかのいくつかのアミノ酸に予測された蛋白質から下流のリーディング ・ フレームを変更して途中で翻訳 (表 1) を終了につながる除去で起因しました。
ほとんどの場合、予測された蛋白質シーケンスの 80% 以上は時期尚早停止コドンのため切り詰められました。この場合、予測されるポリペプチドの長さは 106 のアミノ酸残基 (野生型 TICAM 1 は 520 アミノ酸残基) 91 からであった。非常に切り捨てられた蛋白質の突然変異は非機能的なタンパク質を生成する予定です。Bp の 87 削除変異 (表 2図 4) では、場合は、リーディング ・ フレームを変更することがなくタンパク質から 29 アミノ酸を取り外しました。このような突然変異の機能的な結果は実験的に評価する必要があります。
RBL
プール、クローンの PCR の製品からの個々 のコロニーからのベクトルの DNA の配列は、塩基変異 (図 6) の存在を確認しました。突然変異率を分析した 40 人の 88% であった。削除範囲 5 から 183 bp bp まで 20 中 bp が挿入されました。興味深いことに、183 bp 削除には、イントロン 1、2、および 19 エクソン bp イントロン 2 から完全に削除されます。理論的には、これは以来、スプライス部位の変異、RBL 遺伝子のスプライシング影響する必要があります。
塩基変異は野生型蛋白質シーケンス (308 アミノ酸残基) と比較した場合の予測された蛋白質シーケンスで変数の効果を持っていた (表 2)。オクターリピート 10% は、予測された切り捨てられた蛋白質の結果または野生型蛋白質の長さ未満の 70% 以上予測されたポリペプチドは年いくつかのオクターリピート (突然変異数 4、5、および 6)、未満 10 アミノ酸です。のみ 2 例 (数 2 と 3) は、可能性がありますまたはないタンパク質の機能に影響を与える可能性があります読書フレームを変更せず予測された蛋白質のアミノ酸組成を 2 と 4 の削除で起因しました。
Bi 対立遺伝子の突然変異は他の 2 つの gRNAs で誘導された (Elaswadら。 非公開)、両方の染色体は、いくつかの胚で変異したと野生型対立遺伝子は検出されませんでした。PCR 産物の電気泳動、これらの胚は、野生型バンド (以上 200 bp 削除) よりも短かっただけ 1 つのバンドをしていた。複製された PCR の製品の DNA の配列は、1 つだけ他の胚 (突然変異 heterozygous シュミレーション) で発生したすべてのベクトルは 2 つの突然変異体の対立遺伝子の中から 1 つの胚 (ホモ シュミレーション変異) 塩基配列変異アレルの存在を確認しました。他の胚がいくつか突然変異のモザイクをされた場合は、(最大 4 対立遺伝子) の変異体と野生型対立遺伝子は、複製された PCR の製品の DNA の配列によって検出されました。
図 1: 1 セル アメリカナマズのマイクロインジェクション措置の概要 (Ictalurus イシガキダイ) gRNA/Cas9 フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子およびラムノースをノックアウトするタンパク質を持つ胚結合レクチン (RBL) 遺伝子。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 精巣およびチャネル ナマズの卵Ictalurus イシガキダイ.(A)チャネル ナマズ男性のよく発達した精巣は突起が無数に villiform と白です。(B)チャネル ナマズ女性から良い卵は、最小限の色で黄金色またはない血の塊。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: マイクロニードルを引いて、読み込みと 1 セル アメリカナマズのマイクロインジェクションIctalurus イシガキダイ、胚。(A)針が垂直の針の引き手を引きます。針の構造と直径ヒーター フィラメントと電磁力の熱を受けます。(B)マイクロニードル CRISPR/Cas9 ミックスの microloader チップを使用して読み込み。(C) Holtfreter のソリューションを含む 100 mm ペトリ皿でアメリカナマズ胚のアレンジメント。それに触れるし、卵を貫くまで、マイクロニードルが低下します。(D)パネルC卵をピアスのプロセスを示すのセクションを拡大しました。針の先端内側絨毛膜は推進しているが、それはまだ浸透していません注意してください。注入された胚の中赤い注入材料があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: CRISPR/Cas9 誘起チャネル ナマズのシーケンスをコーディング フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子の変異Ictalurus イシガキダイ. 青のシーケンスは protospacer 隣接するモチーフ (PAM) を表し、緑のシーケンスは gRNA の対象を表します。Cas9 タンパク質による二重鎖切断は、2 つの赤い三角形のサイトで起こると予想され。突然変異には、1 8 からの数字が割り当てられます。欠失変異体は、削除されている塩基に対応する各破線、点線で表されます。赤のシーケンスは、紫を表す置換変異挿入。78 の分数は、シーケンシング反応 (78 反応の合計から 3 の配列の反作用の対立遺伝子が検出されたことを意味など3/78) 78 変異対立遺伝子の数を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: チャネル ナマズの塩基変異Ictalurus イシガキダイ、シーケンスをコーディング フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子によるチャネル ナマズ 1 細胞期胚に gRNA/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション DNA シーケンス クロマト グラムによって明らかにされたします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: CRISPR/Cas9 誘起チャネル ナマズのラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子の変異Ictalurus イシガキダイ. Exonic シーケンスは、イントロンのシーケンスは、小文字大文字。青のシーケンスは protospacer 隣接するモチーフ (PAM) を表し、緑のシーケンスは gRNA の対象を表します。蛋白質は 2 つの赤い三角形のサイトに発生する期待された Cas9 による二重鎖切断。突然変異には、1 ~ 9 の数字が割り当てられます。欠失変異体は、削除されている塩基に対応する各破線、点線で表されます。赤のシーケンスは、挿入です。 40 反応の合計から 2 の配列の反作用の対立遺伝子が検出されたことを意味するシーケンス反応など2/40 40 変異対立遺伝子の数 40 を表す分数です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 突然変異 | 挿入 | 削除 | 純変化 (Δ) | 長さタンパク質 (アミノ酸) | フレーム シフト変更 | 時期尚早停止コドン | 予測された蛋白質シーケンス | |||
| WT | 0 | 0 | 0 | 520 | 違います | 違います | MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM TVGGGVDSGDEDNF (GenBank: NP_001187154.1 |
|||
| 1 | 0 | 5 | -5 | 104 | うん | うん | MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS HNQ |
|||
| 2 | 5 | 40 | -35 | 94 | うん | うん | MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ |
|||
| 3 | 0 | 87 | -87 | 491 | 違います | うん | MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE AKPSSPLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQ LEKFKFRQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFL SIPSGGGKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSF STEKQASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKS RLESISSTIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSA YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN TVIPLLPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDT FEKMAKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREK QQWLQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQ QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST MTVGGGVDSGDEDNF |
|||
| 4 | 3 | 131 | -128 | 95 | うん | うん | MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG |
|||
| 5 | 1 | 0 | 1 | 106 | うん | うん | MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH SHNQ |
|||
| 6 | 1 | 0 | 1 | 106 | うん | うん | MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH SHNQ |
|||
| 7 | 14 | 0 | 14 | 100 | うん | うん | MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA |
|||
| 8 | 35 | 9 | 26 | 91 | うん | うん | MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV |
|||
表 1:フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子のアメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイのシーケンスを符号化塩基変異の効果予測蛋白質の長さ (アミノ酸) とシーケンスに比べて野生シーケンス (WT) を入力します。
| 突然変異 | 挿入 | 削除 | 純変化 (Δ) | 長さタンパク質 (アミノ酸) | フレーム シフト変更 | 時期尚早停止コドン | 予測された蛋白質シーケンス | |||
| WT | 0 | 0 | 0 | 308 | 違います | 違います | MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV (GenBank: AHJ14694.1) 53 |
|||
| 1 | 0 | 5 | -5 | 29 | うん | うん | MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ | |||
| 2 | 0 | 6 | -6 | 306 | 違います | 違います | MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV |
|||
| 3 | 0 | 12 | -12 | 304 | 違います | 違います | MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV |
|||
| 4 | 0 | 16 | -16 | 6 | うん | うん | MMLFLN | |||
| 5 | 0 | 183 | -183 | 8 | 違います | うん | MMLFLKRI (融着接続が変更されていないと仮定すると) | |||
| 6 | 1 | 183 | -182 | 5 | うん | うん | MMLFL (融着接続が変更されていないと仮定すると) | |||
| 7 | 1 | 0 | 1 | 31 | うん | うん | MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ | |||
| 8 | 1 | 0 | 1 | 31 | うん | うん | MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ | |||
| 9 | 20 | 0 | 20 | 18 | うん | うん | MMLFLKASSHISSSASSP | |||
表 2:ラムノース結合レクチン (RBL) アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ遺伝子の塩基変異の効果予測蛋白質の長さ (アミノ酸) とシーケンスに比べて野生型シーケンス (WT).
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Discussion
遺伝子ノックアウトを達成するためにチャネル ナマズ胚のための詳しいプロトコルが提示されました。卵黄の CRISPR/Cas9 蛋白質の注入ははるかに簡単、時間を節約、ほとんど遺伝子導入や遺伝子編集魚の一般的な手法である一の細胞胚の blastodisc を microinjecting と比較した場合の広範なトレーニングを必要としません。30,42。 現在のプロトコルはアメリカナマズ TICAM 1 および RBL 遺伝子でオクターリピートの誘起に成功する証明しました。信頼性と効果的な手順は、アメリカナマズに将来遺伝子のノックアウトを生成するための基盤を築きます。プロトコルは、CRISPR/Cas9 システムを使用してチャネル ナマズ ゲノムまたは媒介メダカ tol2 遺伝子導入などのナマズに他の遺伝子技術を適応させるために他の遺伝子を対象とする変更できます。また商業的に重要であると彼らの卵チャネル ナマズ卵より処理に敏感と思われる青ナマズ (I. furcatus) などその他のナマズの種の評価価値があります。しかし、他の gRNAs や DNA や mRNA などの生理活性物質を注入する場合は、プロトコルが最高の条件を決定するように最適化する必要があります。
魚の胚のためのプロトコルでは、マイクロインジェクション手順は 2 つの主なカテゴリに分かれてでした: 胚性細胞と卵黄注入注入。メダカ、morpholinos は生体内の様々 な発達過程41を研究する 1 細胞期胚の細胞質に注入しました。チャネル ナマズに CRISPR/Cas9 mRNA ターゲットに GnRH 遺伝子は 1 細胞期胚30の blastodisc に microinjected いた。イトヨ (カフレ ルーム) の割球が遺伝子組み換え、遺伝子ノックアウト42を生成する microinjected。その一方で、1 セル ゼブラフィッシュ胚はタンパク質中心のガラス (Heg) 効果的な43のあることが証明を操作する morpholinos と卵黄注入だった。これら 2 種類のアプローチが自分の長所と短所、両方は同じ種の同じ効果があると証明する場合、1 細胞期胚の卵黄マイクロインジェクション好ましいであろういくつかの理由。
マイクロインジェクション針が胚細胞を刺さないでので、卵黄のインジェクションは、胚への侵襲です。さらに、胚の中最初の細胞期にまだ多くの胚を短い期間で注入できます。特定の位置に胚を配置する必要はありません。これはまた時間を節約が、胚の処理負荷を軽減します。季節魚の産卵、産卵期間の限定手順が、すべてのノックアウトの成功を達成するために行われる必要があります。チャネル ナマズの産卵期は、約 2 ヶ月44続きます。したがって、迅速かつ効果的なマイクロインジェクション プロトコルを開発、この短い期間で多くの遺伝子を対象とする多くの胚のマイクロインジェクションすることできるようになります。幸いなことに、マイクロインジェクション手順45による高い死亡率を克服へのインジェクションの胚の十分に大きい数を供給するアメリカナマズを人工的に生成できます。さらに、受精のときは、必要なときの 1 細胞期の胚を確実に制御できます。
CRISPR/Cas9 のマイクロインジェクションによるゼブラフィッシュ、アトランティック サーモン (サルモ ・ サラルl.)、ナイル川のテラピア (試行)、アメリカナマズ、大西洋メダカ (Fundulus heteroclitus) を含むさまざまな魚種の indels の扱い46、および一般的な5,30,46,47,48,49,50 を鯉します。さらに、CRISPR/Cas9 システムは、ターゲット遺伝子51外国 DNA の相同組換えを介した挿入を介してLabeo rohita鯉の遺伝子を破壊する使用されました。このプロトコルでは劇的な効果は時期尚早停止コドンにフレーム シフト突然変異を含む、予測された蛋白質シーケンスのコーディング シーケンスで成功したオクターリピートが誘導された.これらの突然変異の表現型の影響を検討する必要があります。切り捨てられた Mrna は、ナンセンス変異を介した mRNA 崩壊 (NMD) 経路を通して、表現の抑制または削減の結果低下可能性が最も高いし、表現され、切り捨てられた蛋白質が機能しない52,53 をなる可能性が.
RBL 遺伝子実験で変異 (番号 5 と 6) の 2 種類が 183 の削除で起因した bp エクソン 1、イントロン 1、2、エキソンとイントロン 2 の一部の半分を完全に削除します。理論的には、このタイプの突然変異は、RBL mRNA のスプライシングを変更できます。スプライス部位の変異はエクソン54を認識するスプライソソームの能力を阻害します。
結論としては、アメリカナマズの編集対象となる遺伝子の信頼性の高い効率的なプロトコルの開発、ゲノム リソースをチャネル ナマズの最近のシーケンスと濃縮されている後に特に機能ゲノム学の勉強のために重要ゲノム。ここで説明する手順は単純で、急速なが効率的な遺伝子ノックアウトを正常に達成するために証明されています。2 つの遺伝子、TICAM 1、RBL はマイクロインジェクションを使用して CRISPR/Cas9 抜きの効率を発揮する目標とされました。挿入されるによって他の生物学的活性物質を含むようにプロトコルを変更できます。Microinject その他のナマズの種または類似の卵構造と組成を持つ他の魚種にも変更できます。このプロトコルは、アメリカナマズの遺伝子ノックアウトのための基礎を築きます。
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Disclosures
著者は、利害の対立があるないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、米国農務省-NIFA 賞 2015 67015 23488 ロジャー ・ コーンによって賄われていた。著者は博士ロナルド ・ フェルプスのビデオでひなの銘柄選択基準の説明をありがちましょう。Ahmed Elaswad とカリム大同博士研究を資金調達のためワシントン DC のエジプト文化および教育局を感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reproboost implant | Center of Marine Biotechnology | Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, sterile filtered |
| Stereo microscope | Olympus | 213709 | For visualizing the eggs during microinjection |
| Microinjector | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MPPI-3 | For the delivery of the injection material into the embryos |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MM33 | For holding and controlling the movement of the injection needle. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | For loading injection solution into microinjection needles. |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 720 | For pulling microinjection needles |
| Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes. |
| Expand High FidelityPLUS PCR System | Roche Diagnostics, USA | For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation | |
| Borosilicate glass capillaries | Fisher Scientific | 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles. | |
| Petri dish | VWR | 25384-302 | For holding the embryos during the microinjection. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. | |
| Holtfreter`s solution | Home Made | 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. | |
| Doxycycline hyclate USP (monohydrate) | Letco Medical | 690904 | Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections. |
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