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Genetics

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56275
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 4, 5, 5, 1
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Abstract

Se ha secuenciado el genoma completo del bagre de canal, Ictalurus punctatus, conduciendo a mayores oportunidades para estudiar la función genética de bagre de canal. Golpe de gracia del gene se ha utilizado para el estudio de estos genes funciones en vivo. El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) el sistema es una potente herramienta para editar secuencias genómicas de ADN para alterar la función génica. Mientras que el enfoque tradicional ha sido introducir CRISPR/Cas9 mRNA en los embriones de la célula a través de microinyección, esto puede ser un proceso lento e ineficiente en el bagre. Aquí, se describe un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal con CRISPR/Cas9 proteína. Brevemente, óvulos y espermatozoides fueron recogida y luego artificial fertilización realizada. Los huevos fertilizados se transfirieron a una placa de Petri que contenga solución de Holtfreter. Volumen de inyección fue calibrado y luego guía RNAs/Cas9 dirigido a los toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM 1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene fueron microinyectados en la yema de los embriones de una célula. El golpe de gracia del gene era acertado como indels fueron confirmados por secuenciación del ADN. Las alteraciones de la secuencia de la proteína prevista debido a estas mutaciones incluyen mutágeno ' frameshift ' y truncarán de la proteína debido a codones de parada prematura.

Introduction

Microinyección es una técnica de laboratorio común utilizada para entregar una pequeña cantidad de una sustancia tales como DNA, RNA, proteínas y otras macromoléculas en células o embriones a través de un capilar de vidrio1. Microinyección se realiza mediante la instalación de equipos especiales incluyendo un microinyector, instrumental quirúrgico y un microscopio2. La técnica se ha utilizado por los investigadores para modificar genéticamente muchos organismos a través de la generación de transgénicos, knockouts de genes y terapia genética, con el objetivo de comprender la dinámica de componentes intracelulares3,4 , 5.

El bagre de canal (Ictalurus punctatus) es la especie más popular del bagre en la acuicultura y las actividades de pesca recreativa en los Estados Unidos. Hay una creciente necesidad de estudio de genómica funcional en bagre de canal, y la secuencia del genoma completo de bagre de canal aumenta la utilidad de los recientes avances en genoma edición herramientas6,7. Comprender la función del gen no sólo enriquecería la investigación que se lleva a cabo en el bagre, pero también podría conducir a programas de mejoramiento genético más efectivos para mejorar la industria del bagre. Una vez que se identifican genes críticos para un determinado rasgo de interés, pueden ser utilizados para mejorar genéticamente la producción de bagre a través de la edición del genoma para generar alelos beneficiosos, selección de estos alelos, suprimiendo los alelos perjudiciales, transferencia de los alelos beneficiosos a través de la transgénesis, o alguna combinación de estas opciones. Combinar los mejores genes para diferentes características comercialmente beneficiosos de diferentes especies de una peces mejoraría grandemente la productividad y rentabilidad de las operaciones de producción de pescado8.

Knockout de genes es un método directo para el estudio de las funciones del gene in vivo. Mutaciones a nivel de ADN serán heredadas por las generaciones futuras que facilitarán el estudio de sus efectos en diferentes generaciones. Herramientas de edición diferentes del genoma han sido desarrollados incluyendo zinc finger nucleasas (ZFNs), transcripción nucleasas activador como efectoras (TALENs) y agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones/CRISPR-proteína asociada 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema9,10,11,12.

El sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta potente y eficaz que se ha utilizado para editar secuencias genómicas de ADN incluyendo knockout de genes de peces a través de RNA-dirigida específica escote de DNA5,13. El sistema consta de un RNA de la guía (gRNA), que determina la secuencia específica en el genoma y una enzima endonucleasa de ADN, Cas9. El sistema CRISPR/Cas9 puede diseñarse para cualquier secuencia en el genoma con varias ventajas sobre ZFNs y TALENs de destino: (1) menor costo de ingeniería (2) más fácil Unión (3) más específica de RNA guía de la secuencia Diana y reducido objetivo mutaciones (4) secuencias múltiples pueden ser dirigidas con gRNA diferentes en la misma proporción de tiempo (5) alta mutagénesis en los genes que podrían no ser transformado por TALENs y (6) tasa de transmisión mejorada del germline de mutaciones para hasta doblez 6 comparado con ZFNs y TALENs14, 15,16,17,18.

El principal método alternativo para la microinyección es electroporación, en el cual se aplican impulsos eléctricos a embriones o células para aumentar la permeabilidad de la membrana y la absorción de moléculas biológicas19,20. Varios peces transgénicos se generaron usando electroporación como medaka (Oryzias latipes), pez cebra (Danio rerio), salmón chinook (Oncorhynchus tshawytscha), bagre, dorada (Sparus sarba), y común carpa (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

La electroporación se ha utilizado para ofrecer proteína de DNA, RNA y Cas9 de plásmido por golpe de gracia del gene. En células de mamífero, Cas9/gRNA plásmido ADN Cas9 mRNA/gRNA y complejos de la proteína/gRNA Cas9 fueron entregados mediante electroporación y las tarifas de mutagénesis fueron mayores con complejos de proteínas/gRNA Cas9 para más electroporación condiciones probadas27. En el cordado de la coloración (Savignyi intestinalis), TALENs expresar construcciones fueron electroporated en los huevos fertilizados para inducir knockout de genes múltiples28. ZFNs expresando plásmido construcciones fueron electroporated para noquear a la hormona luteinizante en el bagre de canal29. Sin embargo, una vez introducidos en la célula, plásmido construcciones deberá ser transcrito a RNA y traducido a proteínas funcionales antes de que puede apuntar la secuencia de ADN deseada, que probablemente retrasaría el momento de la mutagénesis en comparación con microinyección del ARN / proteína. Como el desarrollo de un embrión, mutagénesis tardía aumenta el mosaicism de fundadores inyectados. Además, la expresión transgénica es poco probable alcanzar el nivel de expresión posible con microinyección, bajando la eficiencia de mutagénesis.

Como un medio para introducir herramientas de edición del genoma en las células, microinyección tiene varias ventajas sobre electroporación. Moléculas de edición genómica puede introducirse confiablemente en células o embriones mediante microinyección30. Se necesita menos material de inyección. Es fácil determinar las cantidades de material inyectado. Mayor mutación tarifas con mosaicism bajo en los peces del fundador pueden ser alcanzado que mejoraría del germline transmisión de mutaciones a F1. Menos peces fundador deben ser analizados para producir la primera generación, debido a la mayor tasa de mutación. En electroporación, peces fundador deben analizarse que aumentarán los costos. Sin embargo, la supervivencia de los embriones microinyectados de bagre de canal es menor que electroporated que, aunque esto se puede solucionar mediante la inyección de más embriones31,32. En bagre de canal, la supervivencia de los embriones microinyectados yema osciló entre 16 y 55%, dependiendo de los genes blanco y la dosis de proteína de gRNA/Cas932.

Regular microinyección de embriones de bagre es técnicamente exigente y mucho tiempo, sin embargo, un rápido y eficaz protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 proteína se presenta para embriones de bagre de canal. Este protocolo requiere menos tiempo y experiencia ya que la solución de proteína CRISPR/Cas9 se inyecta en la yema de uno de embriones de células. Cientos de huevos fecundados se pueden inyectar en 1 h (aproximadamente el tiempo necesario para que la primera división celular que se produzca). Para validar el protocolo, dos genes relacionados con la susceptibilidad de la enfermedad fueron eliminados en bagre de canal, toll/interleukin 1 gene del receptor del dominio-que contienen adaptador molécula (TICAM1) y el gene de lectinas (RBL) obligatorio de ramnosa. TICAM 1 participa en la vía de señalización iniciada por el receptor de tipo toll (TLR) 3. En bagre de canal, TICAM 1 fue significativamente upregulated después del desafío bacteriano con Edwardsiella ictaluri, mientras que fue regulada en bagre azul, una especie resistente E. ictaluri33. RBL desempeña un papel importante en la infección temprana con Flavobacterium columnare, el agente causativo de la enfermedad columnaris, donde aguda y robusta upregulation se registró en una cepa susceptible columnaris bagre de canal en comparación con un cepa resistente columnaris34.

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Protocol

Este experimento se llevó a cabo en la unidad de investigación de genética de peces, centro de investigación de pesquerías de E. W. Shell, Universidad de Auburn, Alabama. Todos los protocolos experimentales utilizados en este experimento fueron aprobados por la Universidad de Auburn institucional Animal Care y Comité uso (IACUC-AU) antes de inicia el experimento. Una lista de la maquinaria y equipo utilizado en este experimento puede encontrarse en la tabla de materiales. Los siguientes son los pasos y procedimientos para la preparación y microinyección de embriones de una célula de bagre de canal como se ilustra en la figura 1.

1. selección de acciones y desove de reproductores

  1. Elegir sano bagre cría de la cepa o línea genética de interés. Hembras y machos de bagre de canal deben exhibir buenas características secundarias del sexo.
  2. Seleccionar los machos que tienen una amplia cabeza muscular que es más ancha que el resto de sus cuerpos con la papila genital bien desarrollada. Color oscuro, cicatrices y heridas de lucha territorial son también signos de preparación sexual. Seleccionar las hembras que tienen jefes que son más estrechos que el resto de sus cuerpos y tienen abdomen suave, palpable, bien redondeado. Para la precisión y evitar destacando los peces durante el manejo inicial, pare el alimentar a las hembras 2-3 días antes de examinar su preparación para el desove.
  3. Realizar manejo rápidamente pero con cuidado de peces. Para reducir el estrés de manejo, realizar todos los procedimientos que requieren manejo de hembras manteniendo peces en bolsas (32 m m tamaño de malla) de desove.
  4. Justo antes de la inyección de hormonas para inducir la ovulación, medir el peso corporal de las hembras.
  5. Colgar las bolsas de desove con las mujeres dentro de un flujo a través del tanque con el flujo de agua continuo y suficiente aireación.
  6. Asépticamente, carga al implantador que tiene una aguja 14 G con 85 μg/kg de implante de (LHRHa) análogo de la hormona de liberación de la hormona luteinizante. Enjuagar el sitio de inyección (musculatura dorsal) con solución salina estéril 0,9% antes de la inyección. Inserte al implantador en un ángulo de 45° y liberar el implante. Retirar la aguja y pasar el sitio de inyección con una bola de algodón previamente empapada en etanol al 70%.
  7. Lugar la bolsa de desove en el depósito para que el pescado esté totalmente sumergido en agua 15-20 cm por debajo de la superficie del agua. Adecuada aireación (sobre 5 ppm disuelto oxígeno) y buena calidad del agua son importantes para la ovulación de los huevos de alta calidad.
  8. Predecir el momento de la ovulación basado en la temperatura del agua mediante la relación de grados-hora (h)35. Tiempo de respuesta de grado h = tiempo entre la inyección de hormonas y la ovulación (h) * temperatura (° C) del agua. Por ejemplo, para un tiempo de respuesta de h grado de 900-1000, una mujer espera a desovar a las 36-40 h de tiempo de la inyección de la hormona a 25 ° C. Generalmente, el primer cheque de huevos se realiza en aproximadamente 36 h después de la inyección de hormona y luego en intervalos de 4 h.
  9. Para verificar la ovulación, levante suavemente la bolsa reproductora por encima de la superficie del agua mientras que usted está buscando los huevos que se fijan dentro de la bolsa de desove. Ver al menos 10 huevos indica que esta mujer está ovulando y lista para pelar de la mano.

2. preparación del esperma

Nota: Espermatozoides se pueden preparar unos h antes de la ovulación esperada.

  1. Eutanasia a los machos por un percusión golpe en la cabeza sin anestesia, ya que la anestesia tenga un efecto negativo sobre la motilidad del esperma.
  2. Recoger los testículos en un platillo pequeño, quitar cualquier tejido y lavar con 50 mL de solución salina 0.9% para eliminar sangre, si es necesario. Testículos bien desarrollados son de color blancos con muchas proyecciones viliformes ( figura 2).
  3. Determinar el peso de los testículos.
  4. Para preparar la solución de esperma para la fertilización del huevo, transferir los testículos al centro de una malla de 100 cm2 100 μm usando fórceps. Doblar la malla con los testículos dentro, aplastar los testículos y los espermatozoides del filtro en un tubo de recogida de 50 mL. Esto puede hacerse aplicando presión a los testículos dentro de la malla contra el borde del tubo de colección mediante el pulgar. Usar solución salina 0.9% lavar los espermatozoides de la malla en el tubo de la colección. Solución salina se puede Agregar hasta 10 mL/g de los testículos.
  5. Determinar la concentración de los espermatozoides, comprobar la motilidad y viabilidad.
    Nota: La concentración se puede determinar contando los espermatozoides en un volumen conocido de diluido de semen usando un hemocitómetro. Por otra parte, la densidad de esperma puede estimarse mediante la evaluación de la densidad óptica de semen usando un espectrofotómetro. En este método, la absorción en la longitud de onda de 505 nm es comparada con un gráfico de control que ha sido previamente preparado para la absorción de diferentes concentraciones de espermatozoides36. La motilidad del esperma se puede comprobar al microscopio como el tiempo de activación de los espermatozoides hasta el cese de esperma movimiento (llamado duración de motilidad)37. La viabilidad de los espermatozoides puede determinarse por la coloración de la esperma con tintes selectivos como el trypan azul, que se mancha espermatozoides no viables solamente, mientras que esperma viable seguirá siendo sin mancha. Sin embargo, para estos procedimientos de microinyección, esto no es necesario si los testículos están bien desarrollados.
  6. Almacenar esperma en solución salina al 0.9% de paso 2.5 a 4 ° C y usar dentro de 24 h después de la preparación.

3. recolección y fertilización del huevo

  1. Aplicar una capa muy fina de manteca a un diámetro de 20 cm limpio y seco desove pan vegetal.
  2. Lugar de la mujer en la solución anestésica que contiene 100 ppm de sulfonato de metano tricaine tamponada con bicarbonato de sodio (pH de la solución final debe ser 7.0) hasta que el pescado esté totalmente anestesiado38.
    PRECAUCIÓN: Metanosulfonato sulfonato de metano puede ser irritante si se inhala, ingiere o absorbe a través de la piel.
  3. Con cuidado, quitar los peces de la bolsa de desove y sumergirla en solución salina 0.9% lavar fuera de la solución anestésica. Seque el pescado completamente con una toalla limpia, evitando la remoción de la capa de moco en la superficie del cuerpo del pescado.
  4. Aplique grasa vegetal en el área alrededor de la rejilla de ventilación, incluyendo las aletas pélvicas, para evitar la fijación de los huevos durante el desmontaje de la mano.
  5. Mano tira de los huevos en el desove engrasado aplicando presión suave en los ovarios. Buenos huevos deben fluir libremente, color amarillo dorado y tiene mínimo o ningún grumos o coágulos de sangre (figura 2). Evite el contacto entre huevos y el agua antes de la fertilización, como el agua puede estimular el cierre del micrópilo.
  6. Para fertilizar los huevos para microinyección, transferencia de 200-300 huevos a un desove enmantecado. Etiquetas de plástico engrasado de la planta pueden utilizarse como una cuchara para transferir huevos en el desove enmantecado. Añadir 1-2 mL de la solución de esperma (del paso 2.5) a los huevos y mezclar suavemente. La proporción de los espermatozoides hacia el huevo debe ser aproximadamente 11.000 de la esperma/del huevo.
  7. Añadir agua a los huevos para activar el esperma y los huevos. Añada suficiente agua para cubrir un poco los huevos. Agitar suavemente los huevos para 30 s. fertilización debe ocurrir en 1 a 2 min. Es importante fertilizar los huevos que están dispuestos en una sola capa. Huevos de bagre se adhieren entre sí dificultando la microinject varias capas de embriones.
  8. Añadir más agua dulce a los huevos fecundados y los huevos a endurecer durante 10 – 15 minutos.
  9. Cubrir la bandeja de desove que contiene los huevos no fertilizados por una toalla mojada para evitar que se sequen y fertilizar durante unas horas. La fertilización puede hacerse de manera escalonada, por ejemplo, un lote de 200-300 huevos pueden ser fecundados cada 30 – 60 min para asegurar un suministro continuo de embriones en la etapa de una célula para microinyección y control no embriones. Evitar el contacto entre la toalla mojada y los huevos, los huevos pueden adherirse a la toalla mojada lo que hace difícil quitarlos. En este protocolo, óvulos fecundados dentro de 2-3 h después de decapar eficientemente fueron microinyectados y tenía éxito similar como huevos fertilizados inmediatamente después de la extracción.

4. aguja de tracción y de carga

  1. Tirar un vidrio de borosilicato de 1,0 mm OD capilar en 2 agujas (figura 3). Almacenar las agujas en una caja de papel con un trozo de esponja en el cual se hicieron varias incisiones. Para evitar romper la aguja, el diámetro de la esponja debe ser menor que la longitud del vástago de la aguja.
  2. Rompiendo un pedazo pequeño de la región más fina de la aguja utilizando un objeto punzante para abrir la punta de la aguja. Alternativamente, abra la aguja pellizcando fuera de la región más delgada de la punta con pinzas bajo el microscopio.
  3. Preparar la solución de la inyección mediante la mezcla de gRNA(s) con la proteína Cas9. Otros tipos de ARN o proteína también pueden ser inyectados con el mismo procedimiento. En este protocolo, gRNAs fueron diseñados para actuar dos del bagre el inmunes genes relacionados, toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene y preparados según Shah et al. con el uso de una alta fidelidad Taq polimerasa32,39. Los objetivos de la genómicos para gRNAs eran 5' GGA GGT GAA GCA GGA de CGA CGT 3' gen TICAM 1 (figura 4) y GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' 5' para el exón 1 del gen RBL con protospacer motivo adyacente (PAM) de la secuencia subrayada (figura 6).
    1. Objetivos guía RNA de ráfaga contra el genoma de bagre de canal en secuencia y seleccionar aquellos con no potenciales sitios de fuera de objetivo.
    2. Agregar rojo de fenol al color de la proteína de gRNA/Cas9 mezclar un tercio del volumen total.
    3. Ajustar la concentración final de proteína de gRNA/Cas9 mezcla con agua libre de nucleasa para que cada embrión se inyecta con 50 nL con gRNA ng aproximadamente 2,5 y 7,5 ng Cas9 proteína. Incubar la mezcla por 10 min en hielo antes de usarlo.
  4. Con un microloader, carga 5-10 μl de la mezcla de gRNA/Cas9 en la aguja de inyección insertando la microloader en el vástago de la aguja y expulsar la mezcla lentamente mientras retrae la punta de microloader (figura 3). Evite atrapar burbujas de aire dentro.
  5. Conecte la aguja en el soporte de Micropipetas y asegurar una conexión firme y luego fije el soporte a las amalgamas dentales. Garantizar la libre circulación estable. Aplique presión para microinyección abriendo el cilindro de nitrógeno y ajustar el regulador de presión.
    Nota: El volumen de inyección puede verse afectado por la presión, el diámetro de la abertura de la aguja y la duración de la inyección. Para determinar el volumen a inyectar, inyectar una gota de aceite mineral a un hemocitómetro. Si es necesario, puede ajustarse la presión, la duración de la inyección y el diámetro de la aguja para aumentar o disminuir el volumen de la inyección. Inyectar varias veces el aceite mineral para volumen constante.

5. microinyección de embriones de bagre

  1. Aplicar una capa muy fina de manteca a un plato de Petri limpia 100 mm vegetal.
  2. Usando una etiqueta de plástico engrasado de la planta, transferencia de 50-100 huevos de la sartén de la fertilización a la caja Petri y cúbralos con la solución de Holtfreter (tabla de materiales). Alinee los huevos uno contra otro en una sola capa. Esta alineación debe mantener los huevos en su lugar durante el proceso de microinyección.
  3. Coloque la placa de Petri con los huevos sobre la platina del microscopio y sosténgala con una mano. Baje la aguja con la otra mano (figura 3) hasta que perfora el corión y la yema en un único movimiento suave. La punta de la aguja debe ser lo más cerca posible al blastodisc antes de entregar el material de inyección.
    1. Presione el pedal para entregar el material de inyección en la yema de huevo. Si el blastodisc no es claramente visible, el material de inyección puede transmitirse en diferentes lugares de la yema. Para ello, se inserta la aguja hasta el final de la yema, y luego presionando el pedal y retirar la aguja se realizan simultáneamente para difundir el material de inyección a través de diferentes áreas de la yema. Hasta 50 nanolitros se puede inyectar en la yema de bagre de canal embriones, sin embargo, la cantidad de proteína de gRNA/Cas9 debe optimizarse para que cada gen lograr los mejores resultados para mutación tasa y embrión de supervivencia32.
  4. Retraer la aguja suavemente para no dañar el huevo. Mueva la caja Petri para inyectar otro huevo con el mismo procedimiento. Evitar el movimiento de la caja Petri durante el proceso de inyección ya que puede dañar el huevo o romper la aguja. Retirar los huevos que están roto o dañados debido a la microinyección. La inyección puede iniciarse a los 15-20 min después de la fertilización y continuar siempre y cuando los embriones están todavía en la etapa de una célula (hasta unos 60-90 min después de la fertilización).
  5. Coloque los embriones inyectados en solución de Holtfreter con 10 ppm de doxiciclina y continua aireación suave para 6 – 7 días hasta la eclosión de40. Cambiar la solución diariamente y eliminar embriones muertos.

6. mutación detección

  1. Al azar, recoger varios embriones inyectados en la fertilización post de 72 h, quitar la yema de huevo y extracto de ADN genómico. Son embriones de 3 – 5 no como control.
    Nota: El ADN genómico puede extraerse de embriones después del retiro de cáscaras de huevo y yema de huevo el material con digestión proteinasa K y etanol precipitación32.
  2. Amplifican un segmento de ADN que flanquean los objetivos genómicos para el gRNA de cada gen, donde se espera que las mutaciones ocurren con una alta fidelidad de la polimerasa de Taq32. Para TICAM 1, los cebadores 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (adelante) y 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (atrás) fueron utilizados para amplificar un 750 bp mientras que para RBL, los cebadores 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (adelante) y 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (atrás) se utiliza para amplificar un segmento 375 de bp del gen RBL.
    1. Utilice la siguiente reacción de PCR: hasta 20 μl de agua de grado de polimerización en cadena; 1 x alta fidelidad tampón de reacción de enzima Taq con MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 0,4 μm de cada uno de la cartilla de adelante y atrás del mismo grupo, 100-300 ng de ADN genómico y 1,25 unidades de mezcla de enzimas Taq de alta fidelidad. Realizar ciclismo condiciones PCR: desnaturalización inicial a 94 ° C por 3 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C por 30 s, recocido a 60 ° C por 55 s para TICAM y 40 s de RBL, extensión a 72 ° C por 1 min/kb; y extensión final a 72 ° C durante 10 minutos.
  3. Detectar los embriones mutantes utilizando un método de detección de mutación como secuenciación de productos PCR purificados, ensayo de detección de mutación de topógrafo, análisis de movilidad del heterodúplex, pérdida del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción, o cualquier otro método de detección de mutación que es apropiado para el objetivo. En este protocolo, detectar embriones mutantes mediante el ensayo de detección de mutación de topógrafo para TICAM 1 y pérdida de enzima de restricción que SAPI cortar sitio así como la secuenciación de productos PCR purificados para el gen RBL.
  4. Para identificar alelos del mutante, clonar los productos PCR y secuencia vectores de colonias individuales. Los alelos del mutante presentados en la figura 4 y figura 6 vinieron de embriones inyectados. Productos PCR de seis microinyectados y embriones control 3 para cada gen se agruparon en dos tubos separados, uno de los embriones microinyectados y el otro para embriones control, rápidamente clonados y 86 vectores TICAM 1 y 48 vectores de gen RBL secuenciados, incluyendo 8 secuencia de reacciones de 3 embriones no de control para cada gen.
  5. Para identificar diferentes alelos del mutante, comparar las secuencias de los embriones mutantes para la secuencia de tipo salvaje usando cualquier herramienta de alineación de secuencia de DNA como ráfaga o T-café.

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Representative Results

Para demostrar la eficacia del Protocolo de microinyección, fueron microinyectados gRNAs diseñados para atacar el bagre de canal toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene.

TICAM 1
Secuencia de la DNA de vectores de las colonias individuales de productos PCR combinados, clonados revelaron las mutaciones indel inducidas en gen TICAM 1. La tasa de mutación fue 79% en los 24 individuos analizados. Ejemplos de mutaciones se ilustran en la figura 4 y figura 5. Efectos de indel mutaciones en el gene de TICAM1 codificación secuencia de bagre de canal en la proteína prevista longitud y secuencia en comparación con la secuencia de tipo salvaje se ilustran en la tabla 1. Mutaciones de la canceladura dio lugar a la eliminación de unos pocos a varios aminoácidos de la proteína prevista, a cambiar el marco de lectura abajo y terminar prematuramente la traducción (tabla 1).

En la mayoría de los casos, más del 80% de la secuencia de la proteína prevista se truncó debido a un codón de parada prematuro. En estos casos, la longitud del polipéptido predicha varió de 91 a 106 residuos de aminoácidos (tipo salvaje TICAM 1 tiene 520 residuos de aminoácidos). Mutaciones con proteína extremadamente truncada se esperan que produzca una proteína no funcional. En el caso de los 87 bp mutación de la canceladura (tabla 2, figura 4), fueron retirados 29 aminoácidos de la proteína sin cambiar el marco de lectura. Las consecuencias funcionales de tales mutaciones deben evaluarse experimentalmente.

RBL
Secuencia de la DNA de vectores de las colonias individuales de productos PCR combinados, clonados confirmó la presencia de mutaciones indel (figura 6). La tasa de mutación fue 88% en los 40 individuos analizados. Eliminaciones entre 5 bp a 183 bp, mientras que a 20 bp fueron insertados. Curiosamente, las eliminaciones de bp 183 completamente removido del 1 intrón exón 2 y 19 PB del intrón 2. Teóricamente, esto debe influir en el empalme del gen RBL ya que han sido mutados los sitios de empalme.

Las mutaciones Indel tenían efectos variables en la secuencia de la proteína prevista en comparación con la secuencia de la proteína de tipo salvaje (residuos de aminoácidos 308) (tabla 2). Más del 70% de indels dio lugar a una proteína truncada predijo que es 10% o menos de la longitud de la proteína de tipo salvaje. En algunos indels (número 4, 5 y 6 de mutación), el polipéptido predicho fue menos de 10 aminoácidos. Sólo 2 casos (número 2 y 3) dio lugar a la eliminación de 2 y 4 aminoácidos en la proteína prevista sin cambiar el marco de lectura que puede o no puede afectar a la función de la proteína.

BI-alélicos mutaciones fueron inducidas con dos otros gRNAs (Elaswad et al., inédito) donde ambos cromosomas fueron transformados en algunos embriones y no se detectaron alelos de tipo salvaje. Con electroforesis en gel de los productos PCR, estos embriones tenían solamente una venda que era más corta que la banda de tipo salvaje (canceladura de más de 200 puntos). Secuencia de la DNA de los productos PCR clonadas confirmó la presencia de una alelo mutado en todos los vectores ordenados de un embrión (mutación homocigótica biallelic) mientras que los dos alelos del mutante se produjo en otros embriones (mutación heterozigótica biallelic). En algunos otros embriones que fueron mosaico para la mutación, mutante (hasta 4 alelos) y alelos de tipo salvaje fueron detectados por la secuencia de la DNA de los productos PCR clonadas.

Figure 1
Figura 1 : Un resumen de los procedimientos de microinyección para bagre de canal de una célula (punctatus de Ictalurus) embriones con proteína de gRNA/Cas9 para noquear a toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa gen de lectinas (RBL) enlace. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Los testículos y los huevos de bagre de canal, Ictalurus punctatus . (A) bien desarrollados los testículos de los machos de bagre de canal son de color blancos con muchas proyecciones viliformes. (B) buenos huevos de las hembras de bagre de canal son amarillo dorado en color con mínima o sin coágulos de sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Microneedle tirando, carga y microinyección de bagre de canal de una célula, Ictalurus punctatus , embriones. (A) aguja tirando con un extractor de aguja vertical. Estructura de la aguja y el diámetro son afectados por el calor del filamento calefactor y la fuerza electromagnética. Microneedle (B) carga con la mezcla CRISPR/Cas9 usando una punta de microloader. (C) disposición de embriones de bagre de canal en caja Petri de 100 mm que contiene solución de Holtfreter. Microneedle se baja hasta que toca y penetra en el óvulo. (D) magnifica sección del panel C muestra el proceso de perforación el huevo. Nota la punta de la aguja presiona la membrana coriónica hacia adentro pero no ha penetrado todavía. Embriones inyectados con el material de inyección rojo dentro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : CRISPR/Cas9 indujo mutaciones en toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor codificación secuencia de bagre de canal, Ictalurus punctatus . Secuencia de azul representa el motivo adyacente protospacer (PAM) mientras que la secuencia verde representa el objetivo del gRNA. Doble rotura de filamento inducida por proteína Cas9 esperaba que ocurra en el lugar de los 2 triángulos rojos. Las mutaciones se asignan a números del 1 al 8. Mutaciones de la canceladura están representadas por una línea discontinua en la que cada guión corresponde a un nucleótido que se ha eliminado. Secuencias de rojo son inserciones púrpura representa la mutación de la substitución. Fracciones de 78 representan el número de alelos mutados en la secuencia de reacciones (por ejemplo, 3/78 significa que un alelo se detectó en 3 reacciones de secuenciación de un total de 78 reacciones) 78. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Mutaciones Indel en el bagre de canal, Ictalurus punctatus , toll/interleukin-1 receptor que contiene el dominio adaptador molécula (TICAM1) gene secuencia de codificación inducida por microinyección de gRNA/Cas9 proteínas en embriones de una célula de bagre de canal según lo revelado por cromatograma de secuenciación de DNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : CRISPR/Cas9 indujo mutaciones en gene de ramnosa obligatorio lectinas (RBL) de bagre de canal, Ictalurus punctatus . Exonic secuencias son mayúsculas mientras que secuencias intrónicas son minúsculas. Secuencia de azul representa el motivo adyacente protospacer (PAM) mientras que la secuencia verde representa el objetivo del gRNA. Una rotura de doble cadena inducida por Cas9 proteína se esperaba que se producen en el lugar de los 2 triángulos rojos. Las mutaciones se asignan a números del 1 al 9. Mutaciones de la canceladura están representadas por una línea discontinua en la que cada guión corresponde a un nucleótido que se ha eliminado. Secuencias de rojo son inserciones. Fracciones de 40 representan el número de alelos mutados en 40 secuencias de reacciones p. ej. 2/40 significa que un alelo se detectó en 2 reacciones de secuenciación de un total de 40 reacciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mutación de Inserción Eliminación Cambio neto (Δ) Longitud de la proteína (aminoácidos) Cambiado del mutágeno ' frameshift ' Codón de parada prematuro Secuencia de la proteína prevista
WT 0 0 0 520 No No MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST
ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS
PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF
RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG
GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ
ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS
STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL
LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL
LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM
AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW
LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ
HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS
PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM
TVGGGVDSGDEDNF
(GenBank: NP_001187154.1
1 0 5 -5 104 Sí Sí MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS
HNQ
2 5 40 -35 94 Sí Sí MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS
GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF
KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ
3 0 87 -87 491 No Sí MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE
AKPSSPLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQ
LEKFKFRQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFL
SIPSGGGKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSF
STEKQASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKS
RLESISSTIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSA
YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN
TVIPLLPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDT
FEKMAKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREK
QQWLQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQ
QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP
SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST
MTVGGGVDSGDEDNF
4 3 131 -128 95 Sí Sí MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG
5 1 0 1 106 Sí Sí MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
6 1 0 1 106 Sí Sí MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
7 14 0 14 100 Sí Sí MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA
8 35 9 26 91 Sí Sí MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV

Tabla 1: Efectos de mutaciones indel en toll/interleukin 1 gene del receptor del dominio-que contienen adaptador molécula (TICAM1) codificación secuencia de bagre de canal, Ictalurus punctatus, en predicen longitud de proteína (aminoácidos) y la secuencia en comparación con la naturaleza tipo de secuencia (WT).

Mutación de Inserción Eliminación Cambio neto (Δ) Longitud de la proteína (aminoácidos) Cambiado del mutágeno ' frameshift ' Codón de parada prematuro Secuencia de la proteína prevista
WT 0 0 0 308 No No MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR
LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT
NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE
IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL
SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT
VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT
DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE
EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
(GenBank: AHJ14694.1) 53
1 0 5 -5 29 Sí Sí MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
2 0 6 -6 306 No No MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT
CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN
CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI
EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT
LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL
TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR
TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC
EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
3 0 12 -12 304 No No MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE
TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA
LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK
YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA
NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA
AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI
CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST
TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS
SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
4 0 16 -16 6 Sí Sí MMLFLN
5 0 183 -183 8 No Sí MMLFLKRI (suponiendo que no se altera el empalme)
6 1 183 -182 5 Sí Sí MMLFL (suponiendo que no se altera el empalme)
7 1 0 1 31 Sí Sí MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
8 1 0 1 31 Sí Sí MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
9 20 0 20 18 Sí Sí MMLFLKASSHISSSASSP

Tabla 2: Efectos de mutaciones indel en la ramnosa vinculante gen lectina (RBL) de bagre de canal, Ictalurus punctatus, predijeron la longitud de la proteína (aminoácidos) y la secuencia en comparación con la secuencia de tipo salvaje (WT).

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Discussion

Se presentó un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal para lograr el golpe de gracia del gene. Inyección de proteína CRISPR/Cas9 en la yema de huevo es mucho más sencilla, ahorra tiempo y no requiere formación amplia en comparación con microinjecting el blastodisc del embrión de una célula, que es la técnica común para la mayoría de la transferencia de genes y gene edición con pescado 30 , 42. el protocolo actual demostró para ser exitoso en la inducción de indels en bagre de canal genes TICAM 1 y RBL. Estos procedimientos fiables y eficaces sentar las bases para la generación de nocauts de futuras gene en bagre de canal. El protocolo puede ser modificado para apuntar otros genes en el genoma de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9, o para la adaptación de otras tecnologías de gene para bagre, como tol2 mediada por transgénesis. También vale la evaluación en otras especies de bagres como el bagre azul (I. furcatus), que son comercialmente importantes y sus huevos parecen ser más sensibles al manejo de huevos de bagre de canal. Sin embargo, si otros gRNAs o sustancias biológicamente activas tales como DNA o mRNA que se inyecta, el protocolo deba ser optimizada para determinar las mejores condiciones.

En los protocolos para la microinyección de embriones de peces, procedimientos de microinyección podrían dividirse en dos categorías principales: inyección en las células embrionarias y la inyección en la yema de huevo. En medaka, morfolinos se inyectan en el citoplasma de una célula de embriones para el estudio de varios procesos de desarrollo en vivo41. En bagre de canal, CRISPR/Cas9 mRNA del gen de GnRH fueron microinyectados en el blastodisc de una célula embriones30. En el espinoso (Gasterosteus aculeatus), blastómeros fueron microinyectados para generar transgénicos y gene knockouts42. Por otra parte, embriones de pez cebra una célula fueron inyectados de yema con morfolinos para manipular la proteína corazón de cristal (Heg), que demostró para ser efectiva43. Estos 2 tipos de enfoque tienen sus ventajas y desventajas, pero si ambos resultan tener la misma eficacia para la misma especie, microinyección de yema de huevo de una célula de embriones sería preferido por varias razones.

Microinyección de yema de huevo es menos invasiva que los embriones, ya que las agujas de microinyección no perforar las células embrionarias. Además, cuántos embriones se pueden inyectar en un corto período mientras que los embriones se encuentran todavía en la primera etapa de la célula. No hay necesidad para alinear los embriones en una posición determinada. Esto también ahorrar tiempo y reducir el estrés de la manipulación de embriones. En temporada de desove pescado, hay un tiempo limitado de desove en el que todos los procedimientos deben hacerse para lograr la exitosa eliminatoria. En bagre de canal, la temporada de desove dura aproximadamente 2 meses44. Por lo tanto, desarrollando un protocolo de microinyección rápida y eficaz permitirá microinyección de embriones de muchos a muchos genes en este corto período de tiempo. Afortunadamente, bagre de canal puede ser generado artificialmente para abastecer a un número suficientemente grande de embriones para microinyección superar la alta mortalidad debido a procedimientos de microinyección45. Además, se puede controlar el momento de la fertilización sean los embriones en la etapa de una célula cuando sea necesario.

Microinyección de CRISPR/Cas9 inducida indels en diferentes especies como el pez cebra, salmón del Atlántico (Salmo salar L.), tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), bagre de canal, Atlántico killis (Fundulus heteroclitus) 46y común carpín5,30,46,47,48,49,50. Además, se utilizó el sistema CRISPR/Cas9 para alterar genes en Labeo rohita carpa mediante inserción de mediada por recombinación homóloga de ADN extraño en genes específicos51. En este protocolo, indels éxito fueron inducidos en las secuencias de codificación con efectos dramáticos en la secuencia de la proteína prevista, incluyendo mutaciones del mutágeno ' frameshift ' en el codón de parada prematuro. Los efectos fenotípicos de las mutaciones todavía necesitan ser investigados. MRNAs truncados son probablemente degradadas con el absurdo-mediado mRNA decay (NMD) camino, dando por resultado la reducción o inhibición de la expresión, y si expresa, proteínas truncadas será probablemente no funcionales52,53 .

En nuestro experimento con el gen RBL, dos tipos de mutaciones (número 5 y 6) dio lugar a la eliminación de 183 bp quitar completamente la mitad del exón 1 intrón 1, exón 2 y parte del intrón 2. Teóricamente, este tipo de mutación puede alterar el splicing del pre-mRNA RBL. Las mutaciones en los sitios de empalme inhiben la capacidad del espliceosoma reconocer el exón54.

En conclusión, el desarrollo de un protocolo eficiente confiable para genes específicos en bagre de canal es crucial para el estudio de genómica funcional, especialmente después de que los recursos genómicos se han enriquecido con la reciente secuenciación del bagre de canal genoma. Los procedimientos descritos aquí son simples, rápidos pero efectivos y se ha comprobado para alcanzar con éxito el golpe de gracia del gene. Dos genes, TICAM 1 y RBL, fueron dirigidos para demostrar la eficacia de nocaut CRISPR/Cas9 mediante microinyección. Dependiendo de lo que es ser inyectado, el protocolo puede ser modificado para incluir otras sustancias biológicamente activas. Puede también ser modificado para microinject otras especies de bagres u otras especies de peces que tienen composición y estructura similar de huevo. Este protocolo de sentar las bases por golpe de gracia del gene en bagre de canal.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada por premio de USDA-NIFA 2015-67015-23488 a Roger Cone. Los autores agradecen a Dr. Ronald Phelps para la descripción de los criterios de selección común cría en el video. Ahmed Elaswad y Karim Khalil gustaría agradecer egipcio Cultural y educativa oficina en Washington para la financiación de su investigación de doctorado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

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References

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

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Genética número 131 CRISPR/Cas9 edición microinyección embriones de bagre de canal nocaut de gen mutación gen proteína indels truncada
Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, <em>Ictalurus punctatus</em>, embriones de Gene Editing
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Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D.,… More

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).

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