Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56275
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 4, 5, 5, 1
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

Gen kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak düzenleme için basit ve etkili mikroenjeksiyon protokol sunulmuştur. Bu protokol için RNA'ların rehberlik ve Cas9 protein tek hücreli embriyo sarısı microinjected. Bu protokol iki kanal yayın balığı bağışıklık ile ilgili genlerin knocking tarafından doğrulandı.

Abstract

Kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, Komple genom, kanal yayın balığı gen işlev eğitim için daha büyük fırsatlar için önde gelen Sıralı. Gene nakavt bu gen fonksiyonları içinde vivoçalışmada kullanılmaya başlanmıştır. Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced güçlü bir araç genomik DNA dizileri gene işlevi değiştirmek için düzenlemek için kullanılan bir sistemdir. Geleneksel bir yaklaşım içine tek hücreli embriyo mikroenjeksiyon ile CRISPR/Cas9 mRNA tanıtmak olmuştur iken, bu yayın balığı yavaş ve verimsiz bir işlemde olabilir. Burada, mikroenjeksiyon kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 protein ile detaylı bir protokol açıklanmıştır. Kısaca, yumurta ve sperm toplanan ve daha sonra suni döllenme gerçekleştirilen vardı. Döllenmiş yumurta Holtfreter'ın solüsyon içeren bir petri için transfer edildi. Enjeksiyon hacmi kalibre edilmiş ve daha sonra geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM 1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen tek hücreli embriyo sarısı microinjected RNA'ların / Cas9 hedefleme rehberlik. Gen nakavt başarılı olduğu indels DNA sıralama tarafından teyit edildi. Tahmin edilen protein sıra değişiklikler nedeniyle bu mutasyonlar frameshift dahil ve protein erken kodon nedeniyle kesildi.

Introduction

Mikroenjeksiyon, DNA, RNA, protein ve oluştururlar gibi bir madde küçük bir miktar hücreler veya embriyo ile cam kapiller1teslim etmek için kullanılan ortak bir laboratuvar tekniktir. Mikroenjeksiyon bir microinjector, micromanipulator ve mikroskop2de dahil olmak üzere özel ekipman Kurulumu kullanılarak gerçekleştirilir. Teknik genetik transgenics, gen Renkleri çakıştırmama ve gen terapisi, nesil hücre içi bileşenleri3,4 dinamiklerini anlamak amacıyla aracılığıyla birçok organizmalar değiştirmek için araştırmacılar tarafından kullanılan , 5.

Kanal yayın balığı (Ictalurus punctatus) su ürünleri en popüler yayın balığı türler ve eğlence balıkçılık faaliyetleri Amerika Birleşik Devletleri olduğunu. İşlevsel genomik kanal yayın balığı eğitim için artan bir ihtiyaç ve kanal yayın balığı tam genomunun sıralama genom düzenleme araçları6,7son gelişmeler yarar artırır. Gen işlevini anlama sadece yayın balığı üzerinde yürütülen araştırma zenginleştirmek istiyorsunuz değil, ama aynı zamanda daha etkili genetik geliştirme programları için yayın balığı sanayi geliştirmek için neden olabilir. İlgi belirli bir özellik için kritik gen tanımlandıktan sonra onlar genetik olarak yararlı allelleri oluşturmak için genom düzenlemeyi kullanarak yayın balığı üretimi seçimi için zararlı gen aktarımı, bastırmak bu gen artırmak için kullanılabilir transgenesis veya bu seçeneklerin bir bileşimini yararlı gen. Bir balık farklı türlerden farklı ticari olarak yararlı özellikleri için en iyi genler birleştirerek büyük ölçüde verimlilik ve karlılık balık üretim işlemleri8artıracak.

Gene nakavt gen fonksiyonları içinde vivoçalışmaya doğrudan bir yöntemdir. Mutasyonlar DNA düzeyinde etkileri çalışmanın farklı generations kolaylaştıracaktır gelecek nesiller tarafından devralınır. Farklı genom düzenleme araçları gelişmiş dahil olmak üzere çinko parmak enzimler (ZFNs), transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs) edilmiş ve düzenli olarak interspaced kısa palindromik tekrarlar/CRISPR-ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9 kümelenmiş ) sistem9,10,11,12.

CRISPR/Cas9 sistem genomik DNA dizileri gene nakavt balık RNA güdümlü siteye özgü DNA bölünme5,13arası da dahil olmak üzere düzenlemek için kullanılan güçlü ve etkili bir araçtır. Genom ve bir DNA endonükleaz enzimi, Cas9 hedeflenen sırayla belirleyen bir Kılavuzu RNA (gRNA), sistem oluşur. CRISPR/Cas9 sistem genom herhangi bir sırayla ZFNs ve TALENs çeşitli avantajlar ile hedef için tasarlanmış olması: (1) daha düşük (2) kolay (3) daha özel bağlayıcı Guide RNA hedef sıra için mühendislik maliyet ve hedef kapalı mutasyonlar (4) azaltılmış birden çok dizileri aynı time (5) yüksek mutagenesis oranda TALENs ve (6) geliştirilmiş germline iletim hızıyla mutasyonlar için ilâ 6-fold ZFNs TALENs ve14içinkarşılaştırıldığında mutasyona uğramış değil genlerdeki farklı gRNA ile hedef alınabilmesi, 15,16,17,18.

Ana alternatif mikroenjeksiyon için çoğalmasıyla, elektrik darbeleri embriyo veya hücre membran geçirgenliği ve biyolojik moleküllerin19,20alımını artırmak için uygulanan bir yöntemdir. Birkaç transgenik balık çoğalmasıyla medaka (Oryzias latipes), Zebra balığı (Danio rerio), chinook somon (Oncorhynchus tshawytscha), kanal yayın balığı, çipura (Sparus sarba) gibi kullanarak oluşturulan ve ortak sazan (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Elektroporasyon plazmid DNA, RNA ve Cas9 protein gen nakavt için teslim etmek için kullanılmıştır. Memeli hücrelerinde, Cas9/gRNA plazmid DNA, Cas9 mRNA/gRNA ve Cas9 protein/gRNA kompleksleri elektroporasyon kullanarak teslim edildi ve mutagenesis gore Cas9 protein/gRNA kompleksleri çoğu elektroporasyon test koşulları27için kullanarak en yüksek. Ascidian Kordalılar (Ciona intestinalis), electroporated birden çok gen28nakavt ikna etmek için döllenmiş yumurta içine TALENs yapıları ifade edildi. Plazmid yapıları ifade ZFNs electroporated Lüteinizan kanal yayın balığı29nakavt olduğunu. Ancak, bir kez hücre içine tanıttı, plazmid yapıları için RNA transkripsiyonu ve büyük olasılıkla için RNA'ın mikroenjeksiyon göre mutagenesis zaman erteleyecek istenen DNA dizisi hedefleyebilirsiniz önce işlevsel proteinler için tercüme gerekir / protein. Bir embriyo geliştiriyor, gecikmeli mutagenesis enjekte kurucuları mozaizm artar. Buna ek olarak, transgenik ifade mutagenesis verimliliği düşürücü mikroenjeksiyon ile mümkün ifade seviyesine ulaşmak mümkün değildir.

Hücrelere genom düzenleme araçları tanıtmak için bir araç olarak mikroenjeksiyon çoğalmasıyla birçok avantajı vardır. Molekülleri düzenleme genom güvenilir bir şekilde hücreleri veya mikroenjeksiyon30ile embriyo içine tanıttı olabilir. Daha az enjeksiyon malzeme gereklidir. Enjekte malzeme miktarlarını belirlemek kolaydır. Daha yüksek mutasyon oranları düşük mozaizm kurucusu balık ile olabilir hangi-cekti geliştirmek germline iletim F1mutasyonların elde. Daha az kurucusu balık daha yüksek mutasyon oranı nedeniyle ilk nesil üretmek için çözümlenmesi gerekir. Elektroporasyon içinde daha fazla kurucusu balık analiz edilecek olan maliyeti artacak gerekir. Ancak, bu daha fazla embriyo31,32enjekte edilerek üstesinden gelebilir rağmen kanal yayın balığı microinjected embriyo yaşama electroporated olanlar, düşüktür. Kanal yayın balığı, yumurta sarısı microinjected embriyo 16'dan bağlı olarak hedef genlerin % 55 arasında değişiyordu yaşama ve gRNA/Cas9 protein32doz.

Yayın balığı embriyo düzenli mikroenjeksiyon teknik olarak talep ediyor ve zaman alıcı ancak, hızlı ve verimli CRISPR/Cas9 protein mikroenjeksiyon protokolü için kanal yayın balığı embriyo sunulur. CRISPR/Cas9 protein çözüm bir hücre embriyo sarısı enjekte edilir beri bu iletişim kuralı daha az zaman ve uzmanlık gerektirir. Döllenmiş yumurta yüzlerce 1 h (yaklaşık zaman gerçekleşmesi ilk hücre bölünmesi gerekli) enjekte edilir. Protokol doğrulamak için iki hastalığı duyarlılık ile ilgili gen kanal yayın balığı, geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen nakavt. TICAM 1 toll benzeri reseptör (TLR) 3 tarafından başlatılan sinyal yolu ilgilenmektedir. Kanal catfish TICAM 1 önemli ölçüde downregulated mavi kedi balığı, bir tür dirençli E. ictaluri33içinde iken bakteriyel meydan okuma ile Edwardsiella ictaluri, takip upregulated oldu. RBL oynar önemli bir rol ile Flavobacterium columnare, columnaris hastalığı, hastalığının erken enfeksiyon akut nerede ve sağlam upregulation göre columnaris duyarlı kanal yayın balığı gerginlik kaydedildi bir columnaris dirençli34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu yapılan balık genetik araştırma birimi, E. W. kabuk balıkçılık Araştırma Merkezi, Auburn Üniversitesi, AL. Deneme başlatılmadan önceki bu deneyde kullanılan tüm deneysel protokoller Auburn Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (AU-IACUC) tarafından kabul edildi. Bir liste bu deneyde kullanılan malzemeleri ve Ekipmanları Malzemeleri tablosunda bulunabilir. Aşağıdaki adımlar ve yordamlar için hazırlık ve mikroenjeksiyon kanal yayın balığı tek hücreli embriyo şekil 1' de gösterildiği gibi vardır.

1. kara kara hisse senedi seçimi ve yumurtlama

  1. Sağlıklı kanal yayın balığı damızlık stok zorlanma veya ilgi genetik satır'ı seçin. Kanal yayın balığı ve erkeklerde iyi ikincil cinsiyet özellikleri göstermelidir.
  2. Bedenlerini iyi gelişmiş genital papilla ile geri kalanı daha geniş geniş bir kas kafa var erkek seçin. Koyu renk, yara izi ve bölgesel mücadele üzerinden yaralar da cinsel hazırlık belirtileridir. Vücutlarını geri kalanından daha dar kafaları kadın seçin ve yumuşak, elle tutulur, çok yönlü karın var. Doğruluk ve balık ilk işleme sırasında stres önlemek için kadın 2-3 gün önce yumurtlama için hazır inceleyerek beslemekten.
  3. Balık hızlı bir şekilde, ama dikkatli bir şekilde işleme gerçekleştirin. İşleme stresi azaltmak için işleme kadın çantaları (32 mm boyut mesh) yumurtlama içinde balık tutarken gerektiren tüm yordamları gerçekleştirin.
  4. Yumurtlama ikna etmek için sadece hormon enjeksiyonu daha önce kadın vücut ağırlığını ölçmek.
  5. Yumurtlama çanta içinde dişi tank ile sürekli su akışı ve yeterli havalandırma bir akış içinde asmak.
  6. Aseptik, 14 G iğne Lüteinizan hormon analog (LHRHa) implant bırakmadan 85 µg/kg olan implanter yükleyin. Enjeksiyon yeri (sırt kas) enjeksiyon önce % 0,9 steril serum fizyolojik solüsyonu ile yıkayın. İmplanter 45 ° açıyla yerleştirin ve implant bırakın. İğne ve kuvvetli darbe enjeksiyon yeri daha önce % 70 etanol ıslatılmış bir pamuk ile geri alıyorum.
  7. 15-20 cm su yüzeyinin altında su böylece balık tamamen içinde batık yeri tankı yumurtlama çantada. Yeterli havalandırma (yukarıda 5 ppm çözünmüş oksijen) ve iyi su kalitesi yüksek kaliteli yumurta yumurtlama için önemlidir.
  8. Derecesi-saat (h) ilişki35kullanarak su sıcaklığı dayalı yumurtlama zamanı tahmin. Derecesi-h tepki süresi hormonu enjeksiyon ve yumurtlama (h) arasındaki süre = * su sıcaklığı (° C). Örneğin, 900-1000, derece-h tepki süresi için bir erkek hormonu enjeksiyon zaman 25 ° C'de 36-40 h spawn bekleniyor Genellikle, yumurta için ilk onay 36 h hormonu enjeksiyon sonra ve daha sonra 4 h aralıklarla yapılır.
  9. Yumurtlama için kontrol etmek için yumurtlama çantanın içine eklenen yumurta için arıyoruz iken su yüzeyi üzerinde yumurtlama çanta yavaşça kaldır. En az 10 yumurta görmek bu dişinin yumurtlama ve el sıyırma için hazır olduğunu gösterir.

2. sperm hazırlama

Not: Sperm bir kaç saat önce beklenen yumurtlama zaman hazır olun.

  1. Anestezi sperm motilitesi üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir beri anestezi, başsız bir vurmalı darbe tarafından erkekler ötenazi.
  2. Testisler küçük bir tartı tavada toplamak, herhangi bir dokuyu ve gerekirse 50-mL % 0,9 serum fizyolojik kan, kaldırmak için ile yıkayın. İyi gelişmiş testis birçok villiform projeksiyonlar ( Şekil 2) ile beyazdır.
  3. Testis ağırlığını belirlemek.
  4. Sperm çözüm yumurta döllenme için hazırlamak için testis forseps kullanarak bir 100 cm2 100 µm kafes Center'a aktarın. Testis testis içinde ezmek ile mesh katlayın ve sperm 50 mL toplama tüp içine filtre. Bu testisler başparmak ile toplama tüp kenarında karşı kafes içinde basınç uygulayarak yapılabilir. % 0,9 serum fizyolojik çözüm kafes toplama tüp içine sperm yıkama için kullanın. Tuzlu çözüm 10 mL/g testis eklenebilir.
  5. Sperm konsantrasyonu belirlemek, canlılık ve hareket kontrol et.
    Not: Bir hemasitometre kullanarak milt bilinen seyreltilmiş hacmi sperm hücrelerinde sayarak konsantrasyon belirlenebilir. Alternatif olarak, sperm yoğunluğu bir Spektrofotometre kullanarak milt optik yoğunluk değerlendirerek tahmin edilebilir. Bu yöntemde, 505 nm dalga boyu emme önceden sperm36farklı konsantrasyonlarda emilimi için hazırlanmış bir kontrol listesi karşılaştırılır. Sperm motilitesi mikroskop altında sperm aktive edilene kadar sperm hareketi (hareketliliği süresi olarak da adlandırılır)37kesilmesi zaman olarak kontrol edilebilir. Sperm canlılığı birikmiş sperm günahı kalır iken hangi tek uygun sperm hücresi, leke sperm trypan mavi, gibi seçici boyalar ile boyama tarafından belirlenebilir. Ancak, bu mikroenjeksiyon işlemleri için bu testisler iyi gelişmiştir eğer gerekli değildir.
  6. Sperm % 0,9 serum adım 2,5 4 ° C'de depolayın ve hazırlık sonra 24 saat içinde kullanın.

3. yumurta toplama ve gübreleme

  1. Sebze kısalma bir 20 cm çapında pan yumurtlama temiz kuru çok ince bir tabaka uygulayın.
  2. Arabelleğe alınan tricaine metan Sülfonat sodyum bikarbonat ile 100 ppm içeren anestezik çözüm dişi koyun (nihai çözüm pH 7,0 olmalıdır) Balık tamamen imzalat38olana.
    Uyarı: Tricaine metan Sülfonat Eğer inhale, hafızanın veya deri yoluyla emilir rahatsız edici olabilir.
  3. Dikkatle, Balık yumurtlama çantasından çıkartın ve o anestezik çözüm yıkamak için % 0,9 serum içinde eğim. Balık tamamen temiz bir havlu, Balık vücut yüzeyi mukus tabakasının kaldırılması kaçınarak kullanarak kapalı kuru.
  4. Sebze kısalma yüzgeçleri pelvik el sıyırma sırasında ek yumurta önlemek için de dahil olmak üzere havalandırma, çevresini uygulanır.
  5. El şerit yumurtaları yumurtlama yağlanmış tavaya yumurtalık için hafif basınç uygulayarak. İyi yumurta serbestçe akışı, altın sarısı renkte olmalı ve çok az var veya yok kümeleri veya kan pıhtılaşması (Şekil 2). Su micropyle kapatma teşvik ettiği gibi arasında yumurta ve gübreleme önce su temasından kaçının.
  6. Mikroenjeksiyon için yumurtaları döllemek için yumurtlama pan yağlanmış bir 200 – 300 yumurta aktarın. Yağlanmış plastik bitki Etiketler bir kaşık yumurta için yumurtlama pan yağlanmış aktarmak için kullanılabilir. 1-2 mL (Kimden adım 2.5) sperm çözüm yumurtalara ekleyin ve karışımı yavaşça. Sperm yumurta oranı yaklaşık 11.000 sperm/yumurta olmalıdır.
  7. Yumurtalara sperm ve yumurta etkinleştirmek için tatlı su ekleyin. Biraz yumurta karşılamak için yeterli su ekleyin. 30 s. gübreleme 1-2 dk içinde oluşması için yavaşça yumurta girdap. Tek bir katmanda düzenlenmiş olan yumurtaları döllemek önemlidir. Yayın balığı yumurta her embriyo çoklu katmanlar microinject önlemek üzere diğer uygun.
  8. Döllenmiş yumurta daha tatlı su ekleyin ve yumurta için 10-15 dk sertleşmesine.
  9. Bir kaç saat içinde döller ve kurutma önlemek için ıslak bir havlu tarafından kalan döllenmemiş yumurta içeren yumurtlama tava kapağı. Fertilizasyon kademeli bir şekilde yapılabilir, örneğin embriyo sürekli bir tedarik mikroenjeksiyon ve sigara enjekte denetim embriyolar için bir hücre aşamada emin olmak için her 30-60 dk 200 – 300 yumurta olabilir, bir dizi döllenmiş. Yumurta bunları kaldırmak üzere ıslak havlu uygun gibi ıslak havlu ve yumurtalar arasında temas kaçının. Bu iletişim kuralı, sıyırma sonra 2-3 saat içinde döllenmiş yumurta verimli bir şekilde microinjected ve yumurta olarak benzer başarı hemen sıyırma sonra döllenmiş vardı.

4. iğne çekerek ve yükleme

  1. 1.0 mm OD borosilikat cam kapiller 2 iğneler (şekil 3) çek. İğneler çeşitli kesiler yapılmış sünger parçası ile bir kağıt kutusu saklayın. İğne bozulmaması için sünger çapını iğne kök uzunluğundan daha küçük olmalıdır.
  2. İğne ucu keskin bir nesne kullanarak ibre en ince bölgenin küçük bir parça kırarak açın. Alternatif olarak, iğne mikroskop altında Forseps ile uç bölgesi en ince pinching tarafından açın.
  3. Enjeksiyon çözüm gRNA(s) Cas9 protein ile karıştırarak hazırlayın. Diğer türlü RNA ya da protein aynı yordamı ile enjekte edilir. Bu protokol için gRNAs hedef kanal yayın balığı bağışıklık ilgili genlerin, geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen için iki tasarlanmış ve Şah ve arkgöre hazırlanmış. yüksek sadakat Taq polimeraz32,39kullanımı ile. EXoN 1 RBL gen protospacer bitişik motifi (PAM) sıra için altı çizili (şekil 6) 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' TICAM 1 gen (şekil 4) ve 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' gRNAs için genomik hedefi oldu.
    1. PATLAMA Kılavuzu RNA hedeflerine karşı kanal yayın balığı genom sıra ve bu potansiyel hedef kapalı site ile seçin.
    2. Fenol kırmızı renk gRNA/Cas9 protein Toplam hacim üçte biri kadar karıştırın ekleyin.
    3. Her embriyo 50 ile enjekte edilir nükleaz boş su ile gRNA/Cas9 protein karışımı nihai toplama ayarlamak yaklaşık 2.5 ng gRNA ve 7,5 ng Cas9 protein içeren nL. Karışımı 10 dakika buz kullanmadan önce kuluçkaya.
  4. Bir microloader ile 5-10 µL gRNA/Cas9 karışımı microloader iğne kök yerleştirip karışımı yavaş yavaş microloader ucu (şekil 3) geri çeker iken kovma enjeksiyon iğne yükleyin. İçinde hava kabarcıkları yakalama kaçının.
  5. İğne micropipette sahibine eklemek ve sıkı bir bağlantı sağlamak ve sahibi için micromanipulator ekleyebilirsiniz. Ücretsiz kararlı hareket emin olun. Basınç mikroenjeksiyon için azot silindir açılış ve basınç regülatörü yaparak uygulayın.
    Not: Enjeksiyon hacmi etkilenebilir basınç, iğne diyafram çapı ve enjeksiyon süresi tarafından. Enjekte, bir damla mineral yağı enjekte için birim belirlemek için bir hemasitometre yerleştirilir. Gerekirse, basınç, iğne ve iğne çapı süresi enjeksiyon hacmi azaltmak veya artırmak için ayarlanabilir. Birden çok kez tutarlı cilt sağlamak için mineral yağ enjekte.

5. Yayın balığı embriyo mikroenjeksiyon

  1. Sebze kısalma 100 mm temiz Petri kabına için çok ince bir tabaka uygulayın.
  2. Yağlanmış plastik bitki etiket kullanma, 50-100 yumurta döllenme tava Petri kabına aktarmak ve onları Holtfreter'ın çözüm (malzemeler tablo) ile kaplayın. Birbirlerine karşı yumurta tek bir katmanda hizalayın. Bu hizalama yumurtaların mikroenjeksiyon işlemi sırasında yerde tutmak gerekir.
  3. Petri kabına yumurta ile mikroskop sahnesinde yerini ve tek elle tutun. Bir tek düzgün hareket koryon ve sarısını deliyor dek Öte yandan (şekil 3) iğneyle indirin. İğne ucu enjeksiyon malzeme teslim etmeden önce blastodisc için mümkün olduğunca yakın olmalıdır.
    1. Sarısı enjeksiyon malzeme sunmak için pedal düşürmek. Blastodisc açıkça görünür değilse, enjeksiyon malzemesi sarısı, farklı konumlarda içine yayılmış. Bunu yapmak için iğne kadar sarısı sonuna eklenir, sonra pedal iç karartıcı ve iğne çekilmesi aynı anda yumurtalı farklı alanları ile enjeksiyon malzeme yaymak için yapılır. 50 nanoliters kadar kanal yayın balığı sarısı embriyo, ancak enjekte edilebilir, gRNA/Cas9 protein miktarı her gen mutasyon oranı ve embriyo hayatta kalma32için en iyi sonuçları elde etmek için optimize edilmiş olması gerekiyor.
  4. İğne sorunsuz geri çek yumurta zarar için. Başka bir yumurta ile aynı yordamı enjekte Petri kabına taşıyın. Bu yumurta zarar verebilir veya iğne kırabilir Petri kabına hareketi enjeksiyon işlemi sırasında önlemek. Yırtıldı veya mikroenjeksiyon nedeniyle zarar yumurta kaldırın. Enjeksiyon 15-20 dk sonra gübreleme başlatılabilir ve embriyo (kadar yaklaşık 60-90 dakika sonra fertilizasyon) hala bir hücre aşamasında olduğu sürece devam etmek.
  5. Enjekte embriyo Holtfreter'ın çözüm doksisiklin ve40çıkım kadar 6-7 gün boyunca sürekli nazik havalandırma 10 ppm ile geri koyun. Çözüm her gün değiştirin ve ölü embriyo kaldırın.

6. mutasyon algılama

  1. Rastgele, birkaç enjekte embriyo 72 h sonrası döllenme, toplamak, sarısı kaldırmak ve genomik DNA ayıklayın. 3-5 sigara enjekte embriyo bir denetim içerir.
    Not: Genomik DNA embriyo yumurta kabukları ve sarısı malzeme İndinavir K sindirim ve etanol yağış32kullanarak çıkarıldıktan sonra elde edilebilir.
  2. GRNA nerede mutasyonlar yüksek sadakat Taq polimeraz32kullanarak gerçekleşmesi beklenen her gen için genomik hedefler kanat bir DNA kesimi yükseltmek. TICAM 1, astar 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG için 3' (İleri) ve 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (ters) bir 750 yükseltmek için kullanılan bp RBL iken, astar 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA için 3' (İleri) ve 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (tersi) için kullanılan RBL gen 375 bp segmentten yükseltmek.
    1. Aşağıdaki PCR reaksiyon kullanın: 20 µL PCR sınıf su; 1 x yüksek sadakat Taq enzim reaksiyon arabellek MgCl2, 0.2 mM dNTP ile karıştırın, her biri aynı, 100-300 ng genomik DNA ve yüksek sadakat Taq enzim karışımı 1,25 birimleri ileriye ve geriye doğru astar için 0.4 µM. PCR bisiklet koşullarını gerçekleştirmek: ilk denatürasyon 94 ° c 3 dakika; denatürasyon 94 ° C'de 35 döngüleri için 30 55 60 ° C'de tavlama s, s TICAM için ve 40 s için RBL, uzantısı 72 ° c için 1 dk/kb; ve 10 dk 72 ° C'de son uzantısı.
  3. Sıralama arıtılmış PCR ürünleri, surveyor mutasyon algılama tahlil, heteroduplex hareketlilik tahlil, restriksiyon enzimi tanıma sitesi kaybı gibi bir mutasyon algılama yöntem veya herhangi bir diğer mutasyon algılama yöntemi kullanarak mutant embriyo tespit hedef için uygun. Bu protokol için mutant embriyo TICAM 1 ve sıralama RBL gen için saflaştırılmış PCR ürünlerinin yanı sıra restriksiyon enzimi sapı site kesmek kaybı için arazi mutasyon algılama tahlil kullanarak bulmak.
  4. Mutant gen tanımlamak için PCR ürünleri ve sıra vektörel çizimler bireysel kolonilerden klonu. Şekil 4 ve şekil 6 ' da sunulan mutant gen enjekte embriyo geldi. PCR ürünleri altı microinjected ve her gen için 3 kontrol embriyo iki ayrı tüp, bir microinjected embriyo ve 86 vektörel çizimler ve diğer denetim embriyolar, hızla klonlanmış için içinde TICAM 1 ve 8 de dahil olmak üzere sıralı, RBL gen için 48 vektörel çizimler için havuza alınmış Her gen için 3 kontrol sigara enjekte embriyo reaksiyonlardan sıralanıyor.
  5. Farklı mutant gen tanımlamak için mutant embriyo gelen dizileri patlama veya T-kahve gibi herhangi bir DNA dizisi hizalama araç kullanarak vahşi tipi kol için karşılaştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikroenjeksiyon protokolünün etkinliği göstermek için kanal yayın balığı otoyol/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen hedeflemek için tasarlanmış gRNAs microinjected.

TICAM 1
DNA sıralama vektörlerin havuza alınan, klonlanmış PCR ürünleri bireysel kolonilerden TICAM 1 gen indüklenen Indel mutasyonlar saptandı. Mutasyon oranı % 79 24 bireylerde analiz yapıldı. Mutasyonlar örnekleri şekil 4 ve şekil 5gösterilmiştir. Kanal yayın balığı dizisi kodlama TICAM1 gen Indel mutasyonların etkileri tahmin edilen protein uzunluğu ve vahşi türü dizisine göre sıra Tablo 1' de gösterilmiştir. Silme mutasyonlar önde gelen akış aşağı okuma çerçevesi değiştirme ve çeviri (Tablo 1) zamanından önce sona erdirmek için birkaç birkaç amino asitler için tahmin edilen protein kaldırılması sonuçlandı.

Çoğu durumda, tahmin edilen protein sıra % 80'den fazla erken kodonu nedeniyle kesildi. Bu gibi durumlarda, öngörülen polipeptid uzunluğu 91 (vahşi türü TICAM 1 520 amino asit kalıntıları olan) 106 amino asit kalıntıları arasında değişiyordu. Mutasyonlar son derece kesilmiş protein ile işlevsel olmayan bir proteini üretmek için bekleniyor. 87 bp silme mutasyon söz konusu olduğunda (Tablo 2, şekil 4), 29 amino asitler protein okuma çerçevesi değiştirmeden çıkarıldı. Fonksiyonel sonuçları böyle mutasyonların deneysel olarak değerlendirilmesi gerekir.

RBL
DNA sıralama vektörlerin havuza alınan, klonlanmış PCR ürünleri bireysel kolonilerden Indel mutasyonlar (şekil 6) varlığını doğruladı. Mutasyon oranı % 88 40 bireylerde analiz yapıldı. Silme arasında değişiyordu 5 183 bp bp, ilâ 20 süre bp takılı. İlginçtir, 183 bp silme intron 1, 2 ve 19 exon bp intron 2 üzerinden tamamen kaldırıldı. Teorik olarak, bu ek yeri siteleri mutasyona uğramış bu yana RBL gen Uçbirleştirme etkilemek.

Indel mutasyon yaban tipi protein kol (308 amino asit kalıntıları) karşılaştırıldığında tahmin edilen protein serisini değişken etkileri vardı (Tablo 2). Daha--dan %70 indels % 10 olduğu tahmin edilen bir kesilmiş protein sonuçlandı veya vahşi türü protein, uzunluğundan daha az. Bazı indels (mutasyon sayı 4, 5 ve 6), öngörülen polipeptid az 10 amino asitler yapıldı. Sadece 2 olgu (sayı 2 ve 3) silinmesi öngörülen protein 2 ve 4 amino asitler veya protein işlevini etkilemez okuma çerçevesi değiştirmeden sonuçlandı.

BI allelic mutasyonlar iki diğer gRNAs ile indüklenen (Elaswad ve ark., yayınlanmamış) nerede her iki kromozom bazı embriyo mutasyona uğramış ve hiçbir vahşi türü gen tespit edildi. İle Jel Elektroforez, PCR ürünleri bu embriyoların vahşi türü grubu (200'den fazla bp silme) kısa olduğu tek bir grubumuz vardı. DNA sıralama klonlanmış PCR ürünlerinin tek bir embriyo (homozigoz biallelic mutasyon) iki mutant gen sıralı tüm vektörel çizimler mutant gen diğer embriyo (heterozigoz biallelic mutasyon) oluştu varlığını doğruladı. Mozaik mutasyon için olan bazı diğer embriyo, mutant (4 gen) ve vahşi türü gen DNA sıralama klonlanmış PCR ürünlerinin tarafından tespit edildi.

Figure 1
Resim 1 : Tek hücreli kanal yayın balığı mikroenjeksiyon işlemleri bir özetini (Ictalurus yılan) embriyo otoyol/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose vurmak için gRNA/Cas9 protein ile bağlayıcı lektin (RBL) Gen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Testis ve kanal yayın balığı, yumurta Ictalurus yılan . (A) kanal yayın balığı erkeklerin iyi gelişmiş testis birçok villiform projeksiyonlar ile beyazdır. (B) iyi yumurta kanal yayın balığı dişi golden-sarı renk ile çok az veya hiç kan pıhtıları var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Çekerek, Microneedle yükleme ve tek hücreli kanal yayın balığı, mikroenjeksiyon Ictalurus yılan , embriyo. (A) iğne ile bir dikey iğne çektirmenin çekerek. İğne yapısı ve çapı ısıtıcı filament ve solenoid güç ısı tarafından etkilenir. (B) Microneedle microloader bahşiş CRISPR/Cas9 karışımının ile yükleme. (C) Holtfreter'ın solüsyon içeren 100-mm Petri kabına kanal yayın balığı embriyo tanzimi. Microneedle dokunur ve yumurta deler kadar indirilir. (D) panelinin yumurta Delme işlemi gösteren C kısmında büyütülmüş. Not iğne ucu koryonik membran içe doğru iterek ancak henüz nüfuz değil. Enjekte embriyo içinde kırmızı enjeksiyon malzemesi var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : CRISPR/Cas9 indüklenen otoyol/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) Gen dizisi kanal yayın balığı, kodlama mutasyonlar Ictalurus yılan . Yeşil sıra gRNA için hedef temsil ederken mavi sıra protospacer bitişik motifi (PAM) temsil eder. Çift Cas9 protein tarafından indüklenen strand sonu 2 kırmızı üçgen sitesinde gerçekleşmesi bekleniyor. Mutasyonlar numaraları 1'den 8 atanır. Silme mutasyonlar her çizgi silinmiş bir nükleotit karşılık gelen bir Kesikli çizgi ile temsil edilir. Mor ikame mutasyon temsil ederken kırmızı dizileri eklemeler vardır. Kesirler 78 78 (Örneğin, 3/78 anlamına gelir bir gen 3 sıralama reaksiyonlardan 78 reaksiyonların içinde toplam algılandı) reaksiyonları sıralama mutasyona uğramış gen sayısını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Kanal yayın balığı Indel mutasyonlar Ictalurus yılan , geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) Gen dizisi kodlama kanal yayın balığı tek hücreli embriyo içine gRNA/Cas9 protein mikroenjeksiyon tarafından indüklenen olarak DNA sıralama Kromatografik tarafından saptandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : CRISPR/Cas9 indüklenen kanal yayın balığı, rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen mutasyonlar Ictalurus yılan . İntronic dizileri küçük harfler iken eksonik dizileri büyük harfle yazılır. Yeşil sıra gRNA için hedef temsil ederken mavi sıra protospacer bitişik motifi (PAM) temsil eder. Duble yolda mola protein 2 kırmızı üçgen sitesinde gerçekleşmesi beklenen Cas9 tarafından indüklenen. Mutasyonlar numaraları 1'den 9 atanır. Silme mutasyonlar her çizgi silinmiş bir nükleotit karşılık gelen bir Kesikli çizgi ile temsil edilir. Kırmızı dizileri eklemeler vardır. Kesirler 40 temsil reaksiyonlar örneğin 2/40 sıralama 40 yılında mutasyona uğramış gen sayısı anlamına gelir bir gen 2 sıralama reaksiyonlardan 40 reaksiyonların içinde toplam algılandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Mutasyon Ekleme Silme Net Değişim (Δ) Protein uzunluğu (amino asit) Frameshift değişti Erken kodonu Tahmin edilen protein sıra
WT 0 0 0 520 Hayır Hayır MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST
ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS
PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF
RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG
GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ
ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS
STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL
LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL
LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM
AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW
LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ
HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS
PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM
TVGGGVDSGDEDNF
(GenBank: NP_001187154.1
1 0 5 -5 104 Evet Evet MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS
HNQ
2 5 40 -35 94 Evet Evet MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS
GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF
KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ
3 0 87 -87 491 Hayır Evet MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE
AKPSSPLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQ
LEKFKFRQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFL
SIPSGGGKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSF
STEKQASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKS
RLESISSTIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSA
YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN
TVIPLLPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDT
FEKMAKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREK
QQWLQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQ
QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP
SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST
MTVGGGVDSGDEDNF
4 3 131 -128 95 Evet Evet MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG
5 1 0 1 106 Evet Evet MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
6 1 0 1 106 Evet Evet MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
7 14 0 14 100 Evet Evet MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA
8 35 9 26 91 Evet Evet MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV

Tablo 1: Tarih dizisi kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, kodlama geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen Indel mutasyonların etkileri protein uzunluğu (amino asitler) ve sıra vahşi doğaya göre tahmin yazın sıra (WT).

Mutasyon Ekleme Silme Net Değişim (Δ) Protein uzunluğu (amino asit) Frameshift değişti Erken kodonu Tahmin edilen protein sıra
WT 0 0 0 308 Hayır Hayır MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR
LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT
NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE
IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL
SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT
VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT
DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE
EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
(GenBank: AHJ14694.1) 53
1 0 5 -5 29 Evet Evet MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
2 0 6 -6 306 Hayır Hayır MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT
CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN
CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI
EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT
LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL
TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR
TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC
EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
3 0 12 -12 304 Hayır Hayır MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE
TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA
LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK
YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA
NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA
AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI
CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST
TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS
SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
4 0 16 -16 6 Evet Evet MMLFLN
5 0 183 -183 8 Hayır Evet MMLFLKRI (yapıştırma değil değiştirilmez varsayarak)
6 1 183 -182 5 Evet Evet MMLFL (yapıştırma değil değiştirilmez varsayarak)
7 1 0 1 31 Evet Evet MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
8 1 0 1 31 Evet Evet MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
9 20 0 20 18 Evet Evet MMLFLKASSHISSSASSP

Tablo 2: Kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, lektin (RBL) gen bağlama rhamnose Indel mutasyonların etkileri tahmin protein uzunluğu (amino asitler) ve sıra göre yaban tipi kol (WT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroenjeksiyon gen nakavt elde etmek için kanal yayın balığı embriyolar için detaylı bir protokol sunuldu. Enjeksiyon CRISPR/Cas9 proteinin sarısı çok daha kolaydır zaman kazandırır ve does değil istemek en gen transferi ve gen balıkla düzenleme için ortak teknik tek hücreli embriyo blastodisc microinjecting için karşılaştırıldığında kapsamlı eğitim 30 , 42. Geçerli protokol kanal yayın balığı TICAM 1 ile RBL gen indels inducing başarılı kanıtladı. Bu güvenilir ve etkili yordamları gelecek gen knockouts kanal yayın balığı içinde oluşturmak için temeller. Protokol CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak kanal yayın balığı genom veya diğer gen teknolojileri aracılı tol2 transgenesis gibi yayın balığı ile uyum sağlamak için diğer genler hedeflemek için değiştirilebilir. Ayrıca diğer yayın balığı türler gibi mavi yayın balığı (ı. furcatus), ticari açıdan önemli olan ve yumurtalarını kanal yayın balığı yumurta işleme için daha duyarlı gibi görünüyor değerlendirilmesinde değer. Ancak, diğer gRNAs veya DNA veya mRNA gibi biyolojik olarak aktif maddeler enjekte edilir ise, iletişim kuralı en iyi koşulları belirlemek için optimize edilmiş olması gerekebilir.

Mikroenjeksiyon balık embriyo protokollerde, mikroenjeksiyon yordamları iki ana kategoriye bölünmüş olabilir: embriyonik hücreleri ve sarısı içine enjeksiyon içine enjeksiyon. Medaka içinde çeşitli gelişim süreçleri içinde vivo41çalışmaya tek hücreli embriyo sitoplazma morpholinos enjekte edildi. Kanal catfish GnRH gen hedefleme CRISPR/Cas9 mRNA tek hücreli embriyo30blastodisc microinjected. Üç - spined stickleback içinde (Gasterosteus aculeatus), blastomeres transgenics ve gen knockouts42oluşturmak için microinjected. Öte yandan, tek hücreli Zebra balığı embriyo sarısı enjeksiyonlu morpholinos ile kalp etkili43olduğu kanıtlanmıştır cam (Heg), protein işlemek için idi. Yaklaşım 2 Bu tür avantaj ve dezavantajları var, ama her ikisi de aynı etkinliği için aynı tür var kanıtlamak sarısı mikroenjeksiyon tek hücreli embriyo çeşitli nedenlerden dolayı tercih edilen olurdu.

Sarısı mikroenjeksiyon embriyolar için daha az invazif olduğu mikroenjeksiyon iğneler embriyonik hücreleri delip değil. Embriyoların hala ilk hücre aşamasında iken buna ek olarak, birçok embriyo kısa bir süre içinde enjekte edilebilir. Belirli bir konumda embriyo hizalamak için gerek yoktur. Bu da zamandan tasarruf ve embriyo işleme stresi azaltmak. Sezona göre balık yumurtlama, hangi tüm yordamları başarılı nakavt ulaşmak için yapılması gereken bir yumurtlama süre var. Kanal yayın içinde balığı yumurtlama sezon için yaklaşık 2 ay44sürer. Bu nedenle, hızlı ve etkili mikroenjeksiyon Protokolü gelişmekte olan mikroenjeksiyon birçok genler bu kısa zaman diliminde hedeflemek için birçok embriyo sağlayacaktır. Neyse ki, kanal yayın balığı yapay embriyo mikroenjeksiyon mikroenjeksiyon işlemleri45nedeniyle yüksek mortalite üstesinden gelmek için yeterince büyük bir dizi sağlamak için oluşmasına neden. Buna ek olarak, gübreleme zamanı embriyo ihtiyacım olduğunda tek hücreli aşamasında olduğundan emin olmak için kontrol edilebilir.

CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon Zebra balığı, Atlantik somon (Salmo salar L.), Nil tilapia (Oreochromis niloticus), kanal yayın balığı, Atlantik killifish (Fundulus heteroclitus) de dahil olmak üzere farklı balık türlerinin indels indüklenen 5,30,46,47,48,49,50 46ve ortak sazan. Buna ek olarak, CRISPR/Cas9 sistem Labeo Aziz sazan homolog rekombinasyon aracılı yabancı DNA'ın içine ekleme hedeflenen genler51üzerinden genlerinde bozmaya kullanıldı. Bu protokol için başarılı indels kodlama dizileri frameshift erken kodonu kaynaklanan mutasyonlar da dahil olmak üzere öngörülen protein sırasındaki dramatik etkileri ile indüklenen. Bu mutasyonlar fenotipik etkileri hala araştırılması gerekir. Kesilmiş mRNA'ların azaltma veya ifade, inhibisyonu sonucu saçma-aracılı mRNA decay (NMD) yolu, aracılığıyla bozulmuş en olası değildir ve ifade edilir kesilmiş proteinler büyük olasılıkla işlevsiz52,53 .

RBL gen ile deneyimimizi, iki tür mutasyon (sayı 5 ve 6) 183 silinmesi sonuçlandı bp exon 1, intron 1, exon 2 ve intron 2 parçası yarısı tamamen kaldırma. Teorik olarak, bu tür mutasyon RBL pre-mRNA Uçbirleştirme değiştirebilir. Mutasyonlar splice sitelerdeki spliceosome exon54tanımak yeteneği inhibe.

Sonuç olarak, hedeflenen gen kanal yayın balığı içinde düzenleme için güvenilir verimli iletişim kuralı sonra özellikle kanal yayın balığı son sıralama ile genomik kaynakları zenginleştirilmiş fonksiyonel genomik, eğitim için çok önemli bir gelişmedir genom. Burada açıklanan yordamları basit, hızlı ama verimli ve başarılı bir şekilde gene nakavt elde etmek için kanıtlanmış. İki gen, TICAM 1 ve RBL, mikroenjeksiyon kullanarak CRISPR/Cas9 nakavt verimliliğini göstermek için hedef. Ne enjekte bağlı olarak, diğer biyolojik olarak aktif maddeler eklemek için iletişim kuralı değiştirilebilir. Diğer yayın balığı türler veya benzer yumurta yapısı ve kompozisyonu var diğer balık türleri microinject için de değiştirilebilir. Bu iletişim kuralı içinde kanal yayın balığı gen nakavt temellerinin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Acknowledgments

Bu araştırma için Roger Cone USDA-NIFA Ödülü 2015-67015-23488 tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr. Ronald Phelps damızlık stok seçim ölçütü video açıklaması için teşekkür ederiz. Ahmed Elaswad ve Karim Khalil Mısır kültür ve eğitim büro Washington DC'de doktora araştırma finansmanı için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

Genetik sayı: 131 CRISPR/Cas9 gen düzenleme gen nakavt mikroenjeksiyon kanal yayın balığı embriyolar mutasyon protein indels kesildi
CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, <em>Ictalurus yılan</em>, embriyo içine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D.,… More

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter