Summary
Dette manuskriptet beskriver en murine calvarial osteolysis modell av eksponering for CoCrMo partikler, som utgjør en ideell dyr modell for vurdering av samspillet mellom slitasje partikler og ulike celler i aseptiske løsne.
Abstract
Slitasje partikkel-indusert osteolysis er en viktig årsak til aseptiske løsne kirurgi feil, men den underliggende mekanismen er fortsatt uklart. På grunn av lang oppfølging nødvendig for deteksjon og sporadiske forekomst, er det utfordrende for å vurdere patogenesen ofparticle-indusert osteolysis i kliniske tilfeller. Derfor kreves optimal dyremodeller for videre studier. Murine modell av calvarial osteolysis etablert av eksponering for CoCrMo partikler er en effektiv og gyldig verktøyet for vurdering av samspillet mellom partikler og ulike celler i aseptiske løsne. I denne modellen, ble CoCrMo partikler først innhentet av høy-vakuum tre elektrode likestrøm og resuspended i fosfat-bufret saltvann i en konsentrasjon av 50 mg/mL. Deretter ble 50 µL av resulterende suspensjon brukt til midten av de murine calvaria etter separasjon av den kraniale periosteum av skarpe disseksjon. Etter to uker, musene ble ofret, og calvaria eksemplarer ble høstet; kvalitativ og kvantitativ evalueringene ble utført av hematoxylin og eosin flekker og mikro beregnet tomografi. Styrken i denne modellen inkluderer prosedyren enkelhet, kvantitativ vurdering av bentap, hurtighet i osteolysis utvikling, potensielle bruk transgene eller knockout modeller og en relativt lav kostnad. Men denne modellen kan ikke brukes til å vurdere mekanisk kraft og kroniske virkninger av partikler i aseptiske løsne. Murine calvarial osteolysis modell generert av eksponering for CoCrMo partikler er et ideelt verktøy for vurdering av samspillet mellom slitasje partikler og ulike celler, f.eks, makrofager, fibroblaster, osteoblasts og osteoklast i aseptiske løsne.
Introduction
Aseptiske løsner er den vanligste årsaken totale hip kirurgi (THA) og totalt kneet kirurgi (TKA) feil, som krever revision kirurgi1. Den underliggende mekanismen er imidlertid uklart2. En lang oppfølging er nødvendig for å oppdage partikkel-indusert osteolysis, hvis forekomst er sjelden; Derfor er det utfordrende for å utforske sin patogenese i kliniske tilfeller. Derfor krever videre studier med fokus på komplekse cellular og vev mekanismer både i vivo eksperimenter i bære partikkel-indusert osteolysis modeller og i vitro analyser i celler knyttet til bein homeostase3. En gyldig dyremodell er viktig i avslørende effekten av slitasje partikler på bentap, gir bevis for ytterligere mobilnettet analyser.
Murine calvarial osteolysis modell bygget av eksponering for CoCrMo partikler er en effektiv og gyldig metode for vurdering av samspillet mellom partikler og ulike celler i aseptiske løsne. I denne modellen forårsake CoCrMo partikler calvarial osteolysis ved inducing inflammatoriske cytokiner i makrofager, aktivere osteoklast, hemmer osteoblast spredning og fremme osteoblast apoptose.
Det tar bare to uker å etablere denne modellen. Osteolysis kan visualisere og kvantifisert ved hematoxylin og eosin (H & E) flekker og mikro beregnet tomografi (mikro-CT)2. Dessuten, har denne modellen en relativt lav pris, og transgene og knockout mus modeller kan brukes til en rekke forbindelser på ulike doser3-skjermen.
Prosedyren for å etablere og evaluere denne modellen er enkel. Først ble CoCrMo partikler innhentet av høy-vakuum tre elektrode likestrøm og resuspended i fosfat-bufret saltvann (PBS) i en konsentrasjon av 50 mg/mL. Deretter ble 50 µL av resulterende suspensjon brukt til midten av de murine calvaria etter separasjon av den kraniale periosteum av skarpe disseksjon. Mus ble ofret etter to uker, og calvaria prøver ble høstet; kvalitative og kvantitative analyser ble utført av H & E flekker andmicro-CT.
Murine calvarial osteolysis modell bygget av eksponering for CoCrMo partikler er et ideelt verktøy for vurdering av samspillet mellom CoCrMo partikler og ulike celler, som makrofager, fibroblaster, osteoblasts og osteoklast i aseptiske løsne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) i Nanjing universitet.
1. CoCrMo partikkel forberedelse
- Få CoCrMo partikler ved hjelp av en fabrikkert høy-vakuum tre elektrode likestrøm4. Plass CoCrMo legering i apparatet under 10-3 Pa vakuum, 0.04 MPa argon og hydrogen 3:2 (v/v), og 650 A katoden gjeldende.
- Måle diameter av CoCrMo partikler.
- Legge til 1 mg av CoCrMo partikler i 1,5 mL av vannfri etanol.
- Resuspend CoCrMo partikler i vannfri etanol av ultralyd risting 28 kHz og 600 M i 5 min.
- Bruke en dråpe (ca 20 µL) av resulterende suspensjon på tabellen objektive transmission elektron mikroskop (TEM). Fange serie TEM bilder på 200 kV akselerasjon spenning og 0,24 nm oppløsning.
- Bruk den medfølgende programvaren til å beregne gjennomsnittlig diameter og partikkel størrelsesDistribusjon i TEM micrographs.
- Dekontaminere endotoxins
- Autoclave 50 g av partikler i 15 min 121 ° C og 15 psi.
- Oppdage endotoxins av en kvantitativ Limulus Amebocyte Lysate (LAL) analysen (< 0,25% EU/mL ble ansett som indikerer endotoxin fravær)5.
- Resuspend partikler i fosfat-bufret saltvann (PBS) i en konsentrasjon av 50 mg/mL som lagerløsning6.
2. bygging av Calvarial Osteolysis modell
- Bedøve 6 uke gamle C57BL/J6 mus (seks mus per gruppe) withpentobarbital (50 mg/kg). Bruk knip-testen til å vurdere bedøvelse. Hindre tørking av øyne med vanlig saltvann.
- Plasser mus i liggende stilling. Fjern pelsen på kraniet med en barbermaskin og rense huden med medisinsk bomull baller som inneholder 75% etanol.
- For punkt lokalisering, identifisere to poeng, inkludert midtpunktene mellom to øyne og ører, henholdsvis. Deretter bestemme linjen mellom to ovennevnte punkter og incise huden langs det over linjen med saks (figur 1A).
- Fjern den kraniale periosteum fra calvaria med en skalpell (figur 1B)6.
- Sutur hud på begge ender med enkel avbrutt Sutur.
- Lage en Sutur linje gjennom midten av innsnitt uten knuter. Hold de to endene av Sutur linjen.
- Bygge inn 50 µL av CoCrMo partikkel suspensjon (50 mg/mL, i PBS) i calvarias (figur 1 c)2.
- Knute hekler siste maske i enkel avbrutt Sutur (figur 1 d).
- Opprettholde mus for enda to uker.
3. evaluering av Calvarial Osteolysis modell av mikro-CT skanning
- Ofre mus med karbondioksid. Halshugge musene vannrett. Fjern hjernevev inne og huden og pels utenfor. Høste calvarias for ytterligere eksperimenter.
- Forsiktig rydde opp alle bløtvev på calvaria med pinsett. Fikse de ryddet calvarias i 4% paraformaldehyde på 4 ° C for 24 h. Immerse calvarias i PBS 24 h før mikro-CT skanning.
- Analysere mus calvarias ved høy oppløsning mikro-CT på en isometrisk oppløsning på 18 µm og X-ray strømsparingsinnstillingene 45 kV og 550 mA.
- Utføre tredimensjonal gjenoppbyggingen av mikro-CT data med programvaren.
- Kvalitative og kvantitative analyser.
- Først Velg square regionen rundt det midtlinjen suture som område av interesse.
- Dernest, måle beinmineraltetthet (BMD), bein volum/totalt volum (BV/TV), trabekulært nummer (Tb.N), trabekulært tykkelse (Tb.Th), trabekulært separasjon/avstand (Tb.Sp) og andelen totale porøsitet med medfølgende programvare for mikro-CT.
- For det tredje, Sammenlign de tre gruppene for ulike målinger ved veis VARIANSANALYSE. Bruk den Bonferroni-metode2post hoc variansanalyse.
4. evaluering av Calvarial Osteolysis modell av H & E flekker
- Avkalke calvaria prøver i 15% ethylene diamine tetraacetic syre (EDTA)-PBS på 4 ° C. Endre Avkalking løsningen hver dag i 3 uker.
- Bygg inn decalcified prøvene i parafin for en 2 cm x 1 cm x 1 cm-kuben, og skjær dem i 2 µm seksjoner i området av particle deponering.
- Stain delene med hematoxylin og eosin som tidligere beskrevet7.
- Ta micrographs av den generelle pathomorphism av * lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Internt produsert nanoskala CoCrMo partikler var rundt 50 nm (standardfeil for 3.56) i diameter, som kvantifisert ved TEM (figur 2). Etter eksponering for musen calvarias CoCrMo partikler, dyrene (n = 6 per gruppe) ble opprettholdt for en annen to uker. De to ukene calvarial innsnitt var fullstendig helbredet og suture kan falle. Noen lokale infeksjon eller nonunion kan påvirke bein tap vurdering. Etter musen offer, ble calvaria prøver høstet. Deretter alle bløtvev var forsiktig ryddet og mikro-CT ble brukt om å kvantifisere bentap. Fra både tredimensjonale rekonstruksjon bilder og representant koronale fotografier med tverrsnitt, ble signifikant bentap observert i mus behandlet med CoCrMo partikler (Figur 3). Ben mineral tetthet (BMD), bein volum/totalt volum (BV/TV), trabekulært nummer (Tb.N) og trabekulært tykkelse (Tb.Th) ble betydelig redusert, mens totale porøsitet og trabekulært separasjon/avstand (Tb.Sp) ble betydelig økt i CoCrMo gruppen sammenlignet med kontroll og humbug operasjonen gruppene (Figur 4). Student t-test ble brukt til å vurdere forskjellene mellom grupper og p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Videre bekreftet H & E farging av calvaria bentap i mus behandlet med CoCrMo partikler (figur 5).
Figur 1 : Skjematisk av partikkel-indusert osteolysis (pad) musemodell. Den venstre siden viser musen plasseringen i modellering. (A) peker lokalisering. Bestemme midtpunktene mellom to øyne og ører, henholdsvis, og incise huden langs linjen mellom dem. (B) avdekke og fjerne den kraniale periosteum fra calvaria. (C) bygge CoCrMo partikkel fjæring i på calvaria. (D) Sutur huden i enkel avbrutt Sutur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Overføring elektronmikroskop skanning av CoCrMo partikler. (A) representant overføring elektronmikroskop bilder av CoCrMo partikler. (B) partikkel størrelsesDistribusjon av CoCrMo partikler ble kvantifisert med programvaren. Hver stolpe representerer frekvens normalisert til antall partikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Micro-CT analyse med 3-dimensjonale rekonstruksjon av prøver fra kontroll mus og de behandlet med PBS (humbug operasjon) og CoCrMo partikler. Den hvite vannrette linjen indikerer plasseringen av tverrsnittet bildet. Den hvite pilen viser bentap i gruppen CoCrMo implantasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Kvantitativ analyse av mikro-CT-bildene etter 3-dimensjonal modell. Kvantifisering av Ben mineral tetthet (BMD) (A), bein volum/totalt volum (BV/TV) (B), andelen totale porøsitet (C), trabekulært nummer (Tb.N) (D), trabekulært tykkelse (Tb.Th) (E), og trabekulært separasjon/avstand (Tb.Sp) (F), mean±standard feil. Student t-test ble brukt til å vurdere forskjellene mellom grupper, med p < 0,05 ansett som statistisk signifikant. **, P < 0.01; , P < 0,001. n = 6 mus per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant bilder av H & E flekker av calvaria prøver (10 ×) fra kontroll mus og de behandlet med PBS (humbug operasjon) og CoCrMo partikkel. Rød pil angir osteolysis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er to hovedmetoder for slitasje partikkel-indusert osteolysis i mus: air-pose modellen og calvarial osteolysis modellen. I luft-veske modell, er en subcutaneously generert luft-veske etablert, etterfulgt av slitasje partikkel introduksjon og implantasjon i bein vev8. Veske veggen etterligner periosteum i aseptiske løsne. Bein implantasjon er imidlertid nonvascular uten biologisk aktivitet, som gjør det vanskelig å vurdere direkte interaksjoner mellom partikler og benvevet. Calvarial osteolysis-modellen har flere fordeler sammenlignet med luft-veske motparten. Først er slitasje partikler direkte utsatt for calvaria, gjør det mulig å vurdere interaksjoner mellom slitasje partikler og bein homeostase, inkludert benresorpsjon, og osteoblast, osteoclast og macrophage aktiviteter9,10 . Dernest er kvantitative målinger av bentap tilgjengelig, slik at vurdering av ulike potensielle genetisk tilnærminger og biologiske midler i bein tap forebygging11. For det tredje, er det mulig å måle forholdet mellom slitasje partikler og bentap i ulike genetisk bakgrunner, inkluderer transgene og gene knockout mus12,13. Det fjerde, den kan brukes til skjermen et stort antall forbindelser på ulike doser. Men suksessen av traditionalcalvarial osteolysis modellen er relativt lav, og bruke bein histomorphometry for å måle osteolysis gjør resultatene mindre objektive1.
For å forbedre suksessrate på modellen, og gjøre resultatene mer objektiv, er flere endringer gjort. Først ble nanoskala partikler brukt til å forbedre samspillet mellom calvaria og slitasje partikler. Faktisk samspillet mellom nanoskala partikler og calvaria er forbedret sammenlignet med kommersielt legering partikler, med en gjennomsnittlig diameter på 1,5 µm14,15. Dernest var en 1,0 cm2 område på calvaria avgrenset for å oppnå tilstrekkelig eksponering av calvaria. For det tredje, mikro-CT og tredimensjonale gjenoppbygging ble brukt om å kvantifisere bentap.
Det er flere begrensninger i dagens modell. Første, mikro-CT utstyr for mus er ikke allment tilgjengelig for forskere og teknikere er nødvendig for skanning og tredimensjonale gjenoppbygging. Dernest CoCrMo nanopartikler brukt i den nåværende modellen er ikke kommersielt tilgjengelig, og produksjonen er avhengig av støtte fra materialkunnskap teknikere. For det tredje, denne modellen representerer ikke kroniske virkninger av partikler på benmasse, og mangler ikke-biologiske faktorer knyttet til osteolysis, for eksempel oscillasjon væsketrykk eller mekaniske krefter. Effekten av modellen kan økes betraktelig med hjelp av nanoskala partikler og nok eksponering av calvaria. Bentap kan kvantifiseres og mer objektive data innhentet med mikro-CT.
Murine calvarial osteolysis modell av eksponering for CoCrMo partikler er et ideelt verktøy for å vurdere samspillet mellom CoCrMo partikler og andre celler som makrofager, fibroblaster, osteoblasts og osteoklast i aseptiske løsne. I tillegg kan en rekke medisiner testes av deres effekter på aseptiske løsne bruker denne modellen.
Det er mange viktige trinnene i denne fremgangsmåten. Først er anvendelsen av CoCrMo nanopartikler med en gjennomsnittlig diameter på 50 nm. Dernest ble tilstrekkelig eksponering av calvaria oppnådd. Et 1.0 cm2 område på calvaria var nok i denne modellen, og periosteum på calvaria bør være dissekert nøye og fullstendig. En klar Disseksjon av periosteum forsterker samspillet mellom partikler og calvaria. For det tredje, en kvantitativ måling av bentap av mikro-CT er mulig. Kvantitativ måling av bentap fra tre-dimensjonale gjenoppbygging, som BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp og andelen totale porøsitet, gjør det enklere å skille bein tap forskjeller i ulike behandlinger, og gir solid bevis på osteolysis sammenlignet med den tradisjonelle Ben histomorphometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (81572111), klinisk vitenskap og teknologi prosjektet Foundation av Jiangsu provinsen (BL2012002), vitenskapelig forskning prosjekt av Nanjing (201402007), Natural Science Grunnlaget for Jiangsu provinsen (BK20161385), og spesielle grunnlaget for kinesisk lege Association (2015COS0810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
