Summary
Este manuscrito descreve um modelo murino de osteólise raspagem por exposição a partículas CoCrMo, que constitui um modelo animal ideal para avaliar as interações entre as partículas de desgaste e várias células no afrouxamento asséptico.
Abstract
A osteólise induzida por partículas de desgaste é a principal causa de afrouxamento asséptico em artroplastia falha, mas o mecanismo subjacente permanece obscuro. Devido ao tempo de follow-ups necessário para a detecção e a ocorrência esporádica, é difícil avaliar a osteólise induzida por ofparticle de patogênese em casos clínicos. Daí, modelos animais ideais são necessários para estudos adicionais. O modelo murino de raspagem osteólise estabelecido pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta eficaz e válida para avaliar as interacções entre partículas e várias células no afrouxamento asséptico. Neste modelo, partículas CoCrMo primeiro foram obtidas por alto vácuo três-elétrodo corrente e resuspended em tampão fosfato salina em uma concentração de 50 mg/mL. Em seguida, 50 µ l da suspensão resultante foi aplicado para o meio do calvaria murino após o ponto de separação entre o periósteo craniana por dissecação. Depois de duas semanas, os ratos foram sacrificados e calvaria foram colhidas; avaliações qualitativas e quantitativas foram realizadas pela hematoxilina e eosina manchando e micro computadorizada. Os pontos fortes deste modelo incluem a simplicidade do procedimento, avaliação quantitativa da perda óssea, rapidez de desenvolvimento de osteólise, potencial uso de transgénico ou modelos de nocaute e um custo relativamente baixo. No entanto, este modelo não para ser usado para avaliar a força mecânica e efeitos crônicos de partículas no afrouxamento asséptico. Modelo murino osteólise raspagem gerado pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta ideal para avaliar as interações entre as partículas de desgaste e várias células, por exemplo, macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos, no afrouxamento asséptico.
Introduction
Afrouxamento asséptico é a causa mais comum de artroplastia total de quadril (THA) e falha de total de joelho (ATJ) de artroplastia, que requer cirurgia de revisão1. No entanto, o mecanismo subjacente permanece incerto2. Um seguimento longo é necessário para detectar a osteólise induzida por partículas, cuja ocorrência é rara; Portanto, é um desafio para explorar sua patogênese em casos clínicos. Daí, mais estudos focando mecanismos celulares e tecidos complexos requerem que ambos experimentos na vivo em usam modelos de osteólise induzida por partículas e ensaios em vitro em células relacionadas ao osso homeostase3. Um válido modelo animal é importante para revelar os efeitos de partículas de desgaste na perda óssea, fornecendo evidências para mais celulares ensaios.
Um modelo murino de osteólise raspagem construído pela exposição a partículas CoCrMo é um método eficaz e válido para avaliar as interacções entre partículas e várias células no afrouxamento asséptico. Neste modelo, CoCrMo partículas causam osteólise raspagem por indução de citocinas inflamatórias em macrófagos, ativação de osteoclastos, inibindo a proliferação de osteoblastos e promover apoptose de osteoblastos.
Apenas leva duas semanas para estabelecer esse modelo. Osteólise pode ser visualizada e quantificada por hematoxilina e eosina (H & E) coloração e micro computado tomografia computadorizada (micro-CT)2. Além disso, este modelo tem um relativamente baixo custo e transgênico e nocaute mouse modelos podem ser usados para um grande número de compostos em várias doses3de tela.
O procedimento para estabelecer e avaliar este modelo é simples. Primeiro, CoCrMo partículas foram obtidas por alto vácuo três-elétrodo corrente e resuspended em tampão fosfato salino (PBS), em uma concentração de 50 mg/mL. Em seguida, 50 µ l da suspensão resultante foi aplicado para o meio do calvaria murino após o ponto de separação entre o periósteo craniana por dissecação. Os ratos foram sacrificados após duas semanas, e foram colhidas amostras de calvaria; análises qualitativas e quantitativas foram realizadas por H & E mancha de andmicro-CT.
Um modelo murino de osteólise raspagem construído pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta ideal para avaliar as interações entre partículas CoCrMo e várias células, como macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos, no afrouxamento asséptico.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Nanjing e institucional Cuidado Animal.
1. CoCrMo partícula preparação
- Obter partículas CoCrMo usando um alto vácuo fabricadas três-elétrodo corrente4. Liga CoCrMo lugar no instrumento sob vácuo de Pa 10-3 , 0,04 MPa argônio e hidrogênio 3:2 (v/v) e 650 cátodo A atual.
- Medir os diâmetros das partículas CoCrMo.
- Adicione 1 mg de CoCrMo partículas em 1,5 mL de etanol anidro.
- Resuspenda CoCrMo partículas em etanol anidro por agitação ultra-sônica em 28 kHz e 600 W por 5 min.
- Aplique uma gota (cerca de 20 µ l) da suspensão resultante na tabela objetiva de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Capture a série de fotos TEM 200 kV tensão de aceleração e 0,24 resolução nm.
- Use o software fornecido para calcular a distribuição de tamanho de diâmetro e partícula média em micrografias TEM.
- Descontaminar endotoxinas
- 50 g de partículas por 15 min a 121 ° C e 15 libras por polegada quadrada de autoclave.
- Detecção de endotoxinas por um ensaio quantitativo de Limulus métodos Lysate (LAL) (< 0,25% EU/mL foi considerado para indicar a ausência de endotoxinas)5.
- Resuspenda as partículas em tampão fosfato salino (PBS), em uma concentração de 50 mg/mL como solução6.
2. construção do modelo de osteólise raspagem
- Anestesia a 6 semana de idade withpentobarbital de (seis ratos por grupo) de camundongos C57BL/J6 (50 mg/kg). Use o teste do beliscão para avaliar o nível de anestesia. Evitar a secagem dos olhos com soro fisiológico normal.
- Coloque os ratos de bruços. Retire a pele sobre o crânio com uma máquina de barbear e desinfectar a pele usando bolas de algodão médico contendo 75% de etanol.
- Para a localização do ponto, identifica dois pontos, incluindo os pontos médios entre os dois olhos e ouvidos, respectivamente. Em seguida, determinar a linha entre as duas acima pontos e faça uma incisão na pele ao longo da linha acima com uma tesoura (figura 1A).
- Remova o periósteo craniano a calvaria com um bisturi (figura 1B)6.
- Sutura de pele em ambas as extremidades com sutura interrompida simples.
- Faça uma linha de sutura no meio da incisão sem atar. Segure as duas extremidades da linha de sutura.
- Incorpore 50 µ l de suspensão de partículas de CoCrMo (50 mg/mL, em PBS) no meio do calvarias (Figura 1)2.
- Nó o último ponto dentro simples sutura interrompida (Figura 1).
- Manter os ratos por mais 2 semanas.
3. avaliação do modelo de osteólise raspagem por Microtomografia
- Sacrifica os ratos com dióxido de carbono. Decapitar os ratos no plano horizontal. Remova o tecido de cérebro no interior e a pele e pelo do lado de fora. Colha o calvarias para novas experiências.
- Limpe suavemente todo o tecido mole sobre o calvaria com uma pinça. Corrigi o calvarias apuradas em paraformaldeído 4% a 4 ° C por 24 h. mergulhar o calvarias em PBS 24 h antes de micro-CT varredura.
- Analisar o calvarias de ratos por micro-CT de alta resolução com uma resolução isométrica de 18 µm e as configurações de energia de raios-x de 45 kV e 550 mA.
- Realizar a reconstrução tridimensional de dados micro-CT com o software.
- Qualitativa e análise quantitativa.
- Primeiro, selecione a região quadrada ao redor da sutura mediana como a região de interesse.
- Em segundo lugar, medir a densidade mineral óssea (DMO), volume/total de osso volume (BV/TV), número trabecular (Tb.N), espessura trabecular (Tb.Th), separação/espaçamento trabecular (Tb.Sp) e percentual de porosidade total com o software fornecido para micro-CT.
- Em terceiro lugar, compare os três grupos para várias medições por One-Way ANOVA. Para post-hoc de análise de variância, aplica o método de Bonferroni2.
4. avaliação do modelo de osteólise raspagem pela coloração H & E
- Descalcificar amostras de calvaria em 15% ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-PBS a 4 ° C. Modificar a solução de descalcificação a cada dia por 3 semanas.
- Incorporar as amostras descalcificadas em parafina para um 2 x 1 cm x 1 cubo de cm e corte-os em 2 seções de µm na área de deposição de partículas.
- Manchar as seções com hematoxilina e eosina conforme descrito anteriormente7.
- Capture o micrografias do pathomorphism global por microscopia de luz.
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Representative Results
As partículas de CoCrMo in-house nanoescala produzidos foram em torno de 50 nm (erro padrão de 3,56) de diâmetro, conforme quantificada pela TEM (Figura 2). Após a exposição do rato calvarias a CoCrMo partículas, os animais (n = 6 por grupo) foram mantidas por mais duas semanas. Dentro de duas semanas, a incisão raspagem foi completamente curada, e a sutura pode cair. Qualquer infecção local ou pseudartrose maio afetam a avaliação de perda óssea. Após o sacrifício de rato, foram colhidas amostras de calvaria. Então, todo o tecido mole delicadamente foi esclarecido, e micro-CT foi usado para quantificar a perda óssea. De reconstrução tridimensional de imagens e fotografias coronais representativas em secção transversal, perda óssea significativa foi observada em camundongos tratados com partículas CoCrMo (Figura 3). (BMD) da densidade mineral do osso, osso volume total volume (BV/TV), número trabecular (Tb.N) e espessura trabecular (Tb.Th) foram significativamente reduzidos, enquanto a porosidade total e separação/espaçamento trabecular (Tb.Sp) aumentaram significativamente no CoCrMo grupo em comparação com os grupos de operação de controle e sham (Figura 4). Teste t de Student foi utilizado para avaliar as diferenças entre grupos e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Além disso, H & E mancha de seções de calvaria confirmou a perda óssea em ratos tratados com partículas CoCrMo (Figura 5).
Figura 1 : Esquemático do modelo do rato de osteólise induzida por partículas (PIO). O lado esquerdo mostra a posição do mouse na modelagem. Localização de pontos (A) . Determinar os pontos médios entre os dois olhos e ouvidos, respectivamente e faça uma incisão na pele ao longo da linha entre eles. (B) expor e remover o periósteo cranial da calvaria. (C) incorporar CoCrMo suspensão de partículas no meio da calvaria. (D) da sutura da pele em simples sutura interrompida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Transmissão microscopia eletrônica de varredura de CoCrMo partículas. (A) imagens de microscopia eletrônica de transmissão representativas de CoCrMo partículas. (B) a distribuição granulométrica das partículas CoCrMo foi quantificada com o software. Cada barra representa a frequência normalizada para o número total de partículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise de micro-CT com reconstrução 3-dimensional das amostras dos ratos controle e aqueles tratados com PBS (operação de Souza) e partículas CoCrMo. Linha horizontal branca indica o local da imagem transversal. A seta branca indica perda óssea no grupo de implantação CoCrMo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análise quantitativa das imagens de micro-CT após reconstrução tridimensional. Quantificação de osso densidade mineral (BMD) (A), volume ósseo de volume/total (BV/TV) (B), percentual de porosidade total (C), número trabecular (Tb.N) (D), espessura trabecular (Tb.Th) (E)e trabecular separação/espaçamento (Tb.Sp) (F), em mean±standard erro. Teste t de Student foi utilizado para avaliar as diferenças entre os grupos, com p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. * *, P < 0,01; , P < 0,001. n = 6 ratos por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Imagens representativas de H & E mancha de amostras calvaria (10 ×) de ratos controle e aqueles tratadocom com PBS (operação de Souza) e partículas CoCrMo. Seta vermelha indica a osteólise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há dois métodos principais para a osteólise induzida por partículas de desgaste em ratos: o modelo de ar-bolsa e o modelo de osteólise raspagem. No modelo de bolsa de ar, uma bolsa de ar gerada por via subcutânea é estabelecida, seguido pela introdução de partículas de desgaste e implantação para o osso tecido8. A parede da bolsa imita o periósteo no afrouxamento asséptico. No entanto, a implantação de osso é nonvascular sem nenhuma atividade biológica, o que torna difícil avaliar interações diretas entre partículas e o tecido ósseo. O modelo de osteólise raspagem tem várias vantagens sobre a contraparte de ar-bolsa. Primeiro, partículas de desgaste são diretamente expostas a calvaria, tornando possível avaliar as interações entre as partículas de desgaste e osso homeostase, incluindo a reabsorção óssea e osteoblastos, osteoclasto e macrófago atividades9,10 . Em segundo lugar, as medições quantitativas de perda óssea estão disponíveis, permitindo a avaliação de várias abordagens genéticas potenciais e agentes biológicos na de prevenção de perda óssea11. Em terceiro lugar, é possível avaliar a relação entre as partículas de desgaste e perda óssea em várias origens genéticas, incluindo transgénicos e gene nocaute ratos12,13. Em quarto lugar, ele pode ser usado para um grande número de compostos em várias doses de tela. No entanto, a taxa de sucesso do modelo de osteólise traditionalcalvarial é relativamente baixa, e usando a Histomorfometria óssea para medir osteólise faz os resultados menos objectiva1.
Para melhorar a taxa de sucesso do modelo e render resultados mais objetivos, várias modificações foram feitas. Primeiro, partículas de nanoescala foram usadas para melhorar as interações entre a calvaria e partículas de desgaste. Com efeito, as interações entre partículas de nanoescala e o calvaria é reforçada em comparação com comercialmente partículas da liga, com um diâmetro médio de 1,5 µm14,15. Em segundo lugar, uma área de2 1,0 cm sobre o calvaria foi delineada para obter a exposição adequada do calvaria. Em terceiro lugar, o micro-CT de reconstrução tridimensional foram usados para quantificar a perda óssea.
Existem várias limitações no modelo de presente. Equipamento de primeiro, micro-CT para os ratos não é amplamente disponível para pesquisadores e técnicos são necessários para a reconstrução tridimensional e digitalização. Em segundo lugar, as nanopartículas CoCrMo usadas no presente modelo não estão disponíveis comercialmente, e sua produção conta com apoio de técnicos de ciência dos materiais. Em terceiro lugar, este modelo não representa os efeitos crônicos de partículas na massa óssea e carece de fatores não-biológicos relacionados a osteólise, tais como a pressão do fluido oscilatório ou forças mecânicas. A eficácia do modelo poderia ser aumentada significativamente com a ajuda das partículas de nanoescala e exposição suficiente da calvaria. Perda óssea pode ser quantificada, e dados mais objetivos obtidos com micro-CT.
Um modelo murino de osteólise raspagem estabelecido pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta ideal para avaliar as interações entre partículas CoCrMo e diferentes células como macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos no afrouxamento asséptico. Além disso, uma série de medicamentos pode ser testada de seus efeitos no afrouxamento asséptico, usando este modelo.
Há muitas etapas críticas deste procedimento. O primeiro é a aplicação de nanopartículas CoCrMo com um diâmetro médio de 50 nm. Em segundo lugar, a exposição adequada do calvaria foi alcançada. Uma área de2 1,0 cm sobre o calvaria era suficiente neste modelo, e o periósteo sobre a calvaria deve ser dissecado cuidadosamente e completamente. Uma dicotomia clara o periósteo intensifica as interações entre as partículas e calvaria. Em terceiro lugar, uma medida quantitativa da perda óssea por micro-CT é possível. Medições quantitativas de perda óssea de três reconstrução tridimensional, tais como o BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp e percentual de porosidade total, tornam mais fácil de distinguir diferenças de perda óssea em vários tratamentos e fornecerem evidências sólidas de osteólise em comparação com a Histomorfometria óssea tradicional.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81572111), clínica de ciência e tecnologia projeto Fundação da província de Jiangsu (BL2012002), projeto de pesquisa científica de Nanjing (201402007), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (BK20161385) e a Fundação especial da Associação médico chinês (2015COS0810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
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