Summary
这篇手稿描述了一个小鼠颅骨骨溶解模型的接触 CoCrMo 颗粒, 这构成了一个理想的动物模型, 以评估磨损颗粒和各种细胞之间的相互作用的无菌松动。
Abstract
磨粒引起的骨溶解是关节置换术失败无菌性松动的主要原因, 但其基本机制尚不清楚。由于检测和零星发生所需的长期随访, 对临床病例 ofparticle 性骨溶解的发病机制进行评估具有挑战性。因此, 需要进行进一步研究的最佳动物模型。通过接触 CoCrMo 颗粒建立的小鼠颅骨骨溶解模型, 是评价无菌松动中颗粒与各种细胞相互作用的有效和有效的工具。在该模型中, CoCrMo 粒子首先获得高真空三电极直流和悬浮在磷酸盐缓冲盐水浓度为50毫克/毫升。然后, 50 µL 的结果被应用到小鼠颅骨的中间后, 通过尖锐解剖分离颅骨骨膜。两周后, 小鼠被献祭, 颅骨标本被收割;定性和定量评价是由苏木精和伊红染色和微计算机断层扫描进行的。该模型的优点包括程序简单性、骨质丢失定量评价、骨溶解快速发展、潜在使用转基因或挖空模型以及相对较低的成本。然而, 这种模型不能用来评估机械力和颗粒在无菌松动的慢性影响。暴露于 CoCrMo 颗粒的小鼠颅骨骨溶解模型是评估磨损颗粒与各种细胞之间相互作用的理想工具, 例如, 在无菌性松动中,如:、细胞、成骨细胞、细胞和破骨。
Introduction
无菌松动是全髋关节置换术 (临区) 和全膝关节置换术 (TKA) 失败的最常见原因, 需要修订手术1。但是, 基础机制仍然不清楚2。需要长时间的随访, 以检测颗粒诱导的骨溶解, 其发生是罕见的;因此, 探讨其在临床病例中的发病机制具有挑战性。因此, 对复杂的细胞和组织机制的进一步研究需要体内实验中的磨损颗粒诱导的骨溶解模型和体外检测与骨骼稳态相关的细胞3。有效的动物模型对于揭示磨损颗粒对骨丢失的影响是很重要的, 为进一步的细胞化验提供了证据。
由接触 CoCrMo 颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型是一种有效、有效的评估无菌松动中颗粒与不同细胞间相互作用的方法。在该模型中, CoCrMo 颗粒通过诱导巨噬细胞炎性细胞因子, 活化破骨细胞, 抑制成骨生长, 促进成骨细胞凋亡, 引起颅骨溶解。
建立这个模型只需要两个星期的时间。骨溶解可以可视化和量化的苏木精和伊红 (H & E) 染色和微计算机断层扫描 (微 CT)2。此外, 该模型的成本相对较低, 转基因和挖空鼠标模型可以用来筛选大量的化合物在不同剂量的3。
建立和评估这个模型的程序是简单的。首先, 用高真空三电极直流电流和悬浮在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中获得了 CoCrMo 颗粒, 浓度为50毫克/毫升。然后, 50 µL 的结果被应用到小鼠颅骨的中间后, 通过尖锐解剖分离颅骨骨膜。两周后, 小鼠被献祭, 颅骨标本被收割;采用 H & E 染色 andmicro CT 进行定性和定量分析。
通过接触 CoCrMo 颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型, 是评估 CoCrMo 颗粒与各种细胞之间相互作用的理想工具, 如巨细胞、成纤维体、成骨细胞和破骨动物, 无菌松动。
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Protocol
这里所描述的所有方法都已获得南京大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。
1. CoCrMo 颗粒制剂
- 使用制造的高真空三电极直流电流4获得 CoCrMo 粒子。将 CoCrMo 合金置于仪器下 10-3 Pa 真空、0.04 兆帕氩气和氢 3:2 (v/v) 和650阴极电流。
- 测量 CoCrMo 颗粒的直径。
- 将1毫克的 CoCrMo 颗粒加入1.5 毫升无水乙醇中。
- 并用重悬 CoCrMo 颗粒在无水乙醇中的超声震动为28赫, 600 W 为5分钟。
- 在透射电子显微镜 (TEM) 的目标表上应用一滴 (约20µL)。捕捉 200 kV 加速度电压和 0.24 nm 分辨率的 TEM 照片系列。
- 利用所提供的软件计算 TEM 显微照片中的平均直径和粒度分布。
- 净化内毒素
- 在121摄氏度和 15 psi 的15分钟内, 蒸压釜50克颗粒。
- 用定量鲎鲎裂解 (拉尔) 法检测内毒素 (< 0.25% 欧盟/毫升被认为是指内毒素缺失)5。
- 并用重悬在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的颗粒浓度为50毫克/毫升作为库存解决方案6。
2. 颅骨骨溶解模型的构建
- 麻醉6周老 C57BL/J6 小鼠 (每组六只小鼠) withpentobarbital (50 毫克/千克)。使用捏试验评估麻醉的水平。防止眼睛干燥正常生理盐水。
- 把老鼠放在俯卧的位置。用剃须刀将颅骨上的毛皮去掉, 用含有75% 乙醇的医用棉球对皮肤进行消毒。
- 对于点定位, 分别识别两个点, 包括两个眼睛和耳朵之间的中点。然后, 确定上述两点之间的线, 并用剪刀切割上面线上的皮肤 (图 1A)。
- 用手术刀 (图 1B)6从颅骨中取出颅骨骨膜。
- 缝合皮肤两端有简单的中断缝合。
- 在切口中间做缝合线, 不打结。保持缝合线两端。
- 在 calvarias (图 1C)2中嵌入50µL CoCrMo 粒子悬浮 (PBS 中的50毫克/毫升)。
- 结在简单中断缝合内的最后一针 (图 1D)。
- 再维持2周的老鼠。
3. 显微 CT 扫描对颅骨骨溶解模型的评价
- 用二氧化碳牺牲老鼠。斩首在水平平面上的老鼠。取出里面的脑组织, 以及外面的皮肤和皮毛。为进一步的实验收获 calvarias。
- 用镊子轻轻地清除颅骨上的软组织。修复清除的 calvarias 在4% 多聚甲醛在4摄氏度24小时, 在微 CT 扫描前浸入 PBS 24 小时的 calvarias。
- 用高分辨率微 CT 分析小鼠 calvarias 45 kV 和 550 mA 的18µm 和 X 射线能量设置的等距分辨率。
- 采用软件对微 CT 数据进行三维重构。
- 定性和定量分析。
- 首先, 选择中线缝合周围的正方形区域作为感兴趣区域。
- 其次, 测量骨密度 (BMD)、骨容积/总容积 (BV/电视)、小梁数 (tb)、小梁厚度 (tb)、小梁分离/间隔 (tb)、总孔隙率与提供的微 CT 软件的比例。
- 第三, 用单向方差分析法对三组进行各种测量。对于差异后的特殊分析, 请应用 Bonferroni 方法2。
4. 用 H & E 染色法评价颅骨骨溶解模型
- 除去石灰质颅骨样品在15% 乙烯二胺四乙酸四酸 (EDTA)-PBS 在4°c。每天更换脱钙液3周。
- 将脱钙样品在石蜡中嵌入2厘米 x 1 厘米 x 1 厘米立方, 并将其切成2µm 切片, 在颗粒沉积区内。
- 用苏木精和伊红染色切片, 如前所述的7。
- 用光镜捕捉整体病理的显微照片。
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Representative Results
内部生产的纳米 CoCrMo 粒子的直径约为 50 nm (标准误差 3.56), 由 TEM (图 2) 进行量化。在小鼠 calvarias 接触 CoCrMo 颗粒后, 动物 (每组 n=6) 维持了两周。两周内, 颅骨切口完全愈合, 缝合可能下降。任何局部感染或不愈合都可能影响骨丢失评估。在小鼠牺牲之后, 颅骨样品被收获。然后, 所有的软组织被轻轻地清除, 微 CT 用于量化骨丢失。从三维重建图像和有代表性的冠状照片在横断面, 观察到明显的骨质流失的小鼠处理 CoCrMo 颗粒 (图 3)。骨密度 (BMD)、骨容积/总容积 (BV/电视)、小梁数 (tb) 和小梁厚度 (tb) 均显著降低, 而 CoCrMo 中的总孔隙度和小梁分离/间隔 (tb) 明显增加。组与控件和假操作组 (图 4) 进行比较。学生 t 测试被用来评估组之间的差异, 和 p < 0.05 被认为是统计学意义的。此外, 颅骨切片的 H & E 染色证实了 CoCrMo 颗粒治疗小鼠的骨丢失 (图 5)。
图 1: 粒子诱导的骨溶解 (PIO) 小鼠模型的示意图.左侧显示在建模中的鼠标位置。(A)点本地化。分别确定两只眼睛和耳朵之间的中点, 并在它们之间沿线切开皮肤。(B)从颅骨中公开和移除颅骨骨膜。(C)嵌入 CoCrMo 粒子悬浮在颅骨的中间。(D)缝合皮肤在简单中断缝合。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 透射电镜扫描 CoCrMo 粒子。(A)具有代表性的 CoCrMo 粒子透射电子显微图像。(B) CoCrMo 粒子的粒度分布与软件进行了量化。每个条形表示频率正常化为粒子的总数量。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 显微 CT 分析3维重构从控制小鼠和使用 PBS (假手术) 和 CoCrMo 颗粒治疗的样品.白色水平线指示横断面图像的位置。白色箭头表示 CoCrMo 植入组的骨丢失。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 对三维重建后的微 CT 图像进行定量分析.骨密度定量 (BMD) (A), 骨量/总容积 (BV/电视) (B), 总孔隙率(C), 小梁数 (tb) (D), 小梁厚度 (tb) (E), 小梁分离/间隔 (Tb. Sp) (F), mean±standard 错误。学生 t 测试被用来评估组之间的差异, 与 p < 0.05 认为统计学意义。**, P < 0.01;, P < 0.001。n = 每组6只老鼠。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 颅骨样品 (10×) 的 H & E 染色的代表性图像, 由对照小鼠和 PBS (假手术) 和 CoCrMo 颗粒治疗.红色箭头表示骨溶解。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在小鼠体内, 有两种主要的颗粒诱导骨溶解方法: 气袋模型和颅骨骨溶解模型。在气袋模型中, 首先建立一个皮下生成的气囊, 然后将粒子引入和植入到骨骼组织中8。囊壁模仿骨膜在无菌松动。然而, 骨移植 nonvascular 没有生物活性, 这使得很难评估颗粒和骨组织之间的直接相互作用。颅骨骨溶解模型在气袋对应物上有几个优点。首先, 磨损颗粒直接暴露于颅骨, 使其能够评估磨损颗粒与骨骼平衡之间的相互作用, 包括骨吸收、成骨细胞、破骨体和巨噬细胞活动9,10.其次, 定量测量骨丢失是可利用的, 允许评估各种潜在的遗传方法和生物制剂的骨质疏松预防11。第三, 可以评估不同遗传背景下的磨损颗粒与骨丢失的关系, 包括转基因和基因敲除小鼠12,13。4、可用于在不同剂量下筛选大量化合物。然而, traditionalcalvarial 骨溶解模型的成功率相对较低, 用骨骼形态计量学来测量骨质疏松的结果, 效果不太客观1。
为了提高模型的成功率, 使结果更加客观, 对其进行了若干修改。首先, 纳米粒子被用来增强颅骨和磨粒之间的相互作用。事实上, 纳米粒子与颅骨的相互作用增强, 与商业合金粒子相比, 其平均直径为1.5 µm14,15。其次, 对颅骨的1.0 厘米2区域进行了划定, 以达到充分暴露颅骨的目的。再次, 采用微 CT 和三维重建方法对骨缺损进行量化。
目前的模型有若干限制。首先, 小鼠的显微 CT 设备不能广泛用于研究人员, 需要技术人员进行扫描和三维重建。其次, 目前模型中使用的 CoCrMo 纳米粒子没有商业化, 其生产依赖于材料科学技术员的支持。第三, 该模型不代表颗粒对骨质量的慢性影响, 缺乏与骨质疏松相关的非生物因素, 如振荡流体压力或机械力。在纳米粒子的帮助下, 颅骨的暴露能显著提高模型的有效性。骨丢失可以量化, 更客观的数据得到了微 CT。
通过接触 CoCrMo 颗粒建立的小鼠颅骨骨溶解模型是评估 CoCrMo 颗粒与不同细胞 (如巨细胞、成纤维体、成骨细胞和破骨菌) 间相互作用的理想工具。此外, 还可以通过该模型对一系列药物对无菌松动的影响进行测试。
此过程有许多关键步骤。第一个是 CoCrMo 纳米粒子的应用, 平均直径为50纳米。第二, 颅骨的充分暴露。颅骨上的1.0 厘米2区域足够在这个模型中, 颅骨上的骨膜应该仔细和完全地解剖。骨膜的清晰解剖强化了颗粒与颅骨的相互作用。再次, 用显微 CT 定量测量骨丢失是可能的。三维重建骨丢失量的定量测量, 如骨密度、BV/电视、结核、结核、结核和总孔隙率, 使区分不同治疗方法的骨丢失差异更容易, 并提供确凿的证据证明骨质疏松与传统骨形态计量学。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究获得中国国家自然科学基金 (81572111)、江苏省临床科技项目基金会 (BL2012002)、南京市科研项目 (201402007)、自然科学的支持。江苏省基础 (BK20161385), 中国医生协会 (2015COS0810) 特别基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
