Summary
Dette manuskript beskriver en murine calvarial osteolyse model af eksponering for CoCrMo partikler, der udgør en ideel dyremodel for vurdering af samspillet mellem slidpartikler og forskellige celler i aseptisk løsne.
Abstract
Slid partikel-induceret osteolyse er en væsentlig årsag til aseptisk løsne i artroplastik fiasko, men den underliggende mekanisme er fortsat uklart. På grund af længe opfølgninger nødvendige for afsløring og sporadisk forekomst, er det udfordrende for at vurdere patogenese ofparticle-induceret osteolyse i kliniske tilfælde. Dermed er optimal dyremodeller behov for yderligere undersøgelser. Den murine model af calvarial osteolyse etableret ved udsættelse for CoCrMo partikler er et effektivt og gyldigt redskab til vurdering af vekselvirkninger mellem partikler og forskellige celler i aseptisk løsne. I denne model, blev CoCrMo partikler først fremstillet af high-vacuum tre-elektrode jævnstrøm og genopslemmes i fosfatbufferet saltopløsning ved en koncentration på 50 mg/mL. Derefter blev 50 µL af den resulterende suspension anvendt til midten af de murine calvaria efter adskillelse af kraniel periosteum af skarpe dissektion. Efter to uger, musene blev ofret og calvaria prøver blev høstet; kvalitative og kvantitative evalueringer blev udført af hæmatoxylin og eosin pletter og mikro computertomografi. De stærke sider af denne model omfatter proceduren enkelhed, kvantitative evaluering af knogletab, hurtighed af osteolyse udvikling, potentielle brug transgene eller knockout modeller og en forholdsvis lav pris. Denne model kan dog ikke anvendes til at vurdere den mekaniske styrke og kroniske virkninger af partikler i aseptisk løsne. Murine calvarial osteolyse model genereret af eksponering for CoCrMo partikler er et ideelt værktøj til vurdering af samspillet mellem slidpartikler og forskellige celler, fx, makrofager, fibroblaster, osteoblaster og osteoklaster, i aseptisk løsne.
Introduction
Aseptisk løsning er den mest almindelige årsag af total hip artroplastik (THA) og total knæ artroplastik (TKA) svigt, som kræver revision kirurgi1. Den underliggende mekanisme er imidlertid uklart2. En lang opfølgning er påkrævet for at registrere partikel-induceret osteolyse, hvis forekomst er sjælden; Derfor, det er udfordrende for at udforske dens patogenese i kliniske tilfælde. Derfor kræver yderligere undersøgelser med fokus på komplekse cellulære og væv mekanismer både i vivo eksperimenter i bære partikel-induceret osteolyse modeller og in vitro- assays i celler relateret til knogle homøostase3. En gyldig dyremodel er vigtigt i afslørende virkningerne af slidpartikler på knogletab, dokumentation for yderligere cellulære assays.
En murine calvarial osteolyse model bygget af eksponering for CoCrMo partikler er en effektiv og lovlig metode til vurdering af vekselvirkninger mellem partikler og forskellige celler i aseptisk løsne. I denne model forårsage CoCrMo partikler calvarial osteolyse ved at inducere inflammatoriske cytokiner i makrofager, aktivere osteoklaster, hæmme osteoblastdannelse spredning og fremme osteoblastdannelse apoptose.
Det tager kun to uger til at etablere denne model. Osteolyse kan visualiseres og kvantificeres ved hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning og micro beregnet tomografi (mikro-CT)2. Endvidere, har denne model en forholdsvis lav pris, og transgene og knockout mus modeller kan anvendes til at screene et stort antal stoffer i forskellige doser3.
Proceduren til at etablere og evaluere denne model er enkel. Første blev CoCrMo partikler fremstillet ved high-vacuum tre-elektrode jævnstrøm og genopslemmes i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved en koncentration på 50 mg/mL. Derefter blev 50 µL af den resulterende suspension anvendt til midten af de murine calvaria efter adskillelse af kraniel periosteum af skarpe dissektion. Musene blev ofret efter to uger, og calvaria prøver blev høstet; kvalitative og kvantitative analyser blev udført af H & E farvning andmicro-CT.
En murine calvarial osteolyse model bygget af eksponering for CoCrMo partikler er et ideelt værktøj til vurdering af samspillet mellem CoCrMo partikler og forskellige celler, makrofager, fibroblaster, osteoblaster og osteoklaster, i aseptisk løsne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Nanjing Universitet.
1. CoCrMo partikel forberedelse
- Få CoCrMo partikler ved hjælp af en opdigtet high-vacuum tre-elektrode jævnstrøm4. Placer CoCrMo legering i instrument under 10-3 Pa vakuum, 0,04 MPa argon og brint 3:2 (v/v) og 650 A katode aktuelle.
- Måle diameteren af CoCrMo partikler.
- Tilføje 1 mg af CoCrMo partikler til 1.5 mL af vandfri ethanol.
- Resuspend CoCrMo partikler i vandfri ethanol af ultralyd ryster på 28 kHz og 600 W i 5 min.
- Påfør en dråbe (ca. 20 µL) af den resulterende suspension på tabellen objektive af et transmissions-elektronmikroskop (TEM). Fange række TEM fotos på 200 kV acceleration spænding og 0,24 nm opløsning.
- Brug den medfølgende software til at beregne den gennemsnitlige diameter og partikel størrelse distribution i TEM micrographs.
- Dekontaminering endotoksiner
- Autoklave 50 g af partikler i 15 min ved 121 ° C og 15 psi.
- Opdage endotoksiner ved en kvantitativ Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay (< 0,25% EU/mL blev anset for at angive endotoxin fravær)5.
- Resuspend partiklerne i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved en koncentration på 50 mg/mL som stamopløsning6.
2. opførelsen af Calvarial osteolyse Model
- Bedøver 6 uger gamle C57BL/J6 mus (seks mus pr. gruppe) withpentobarbital (50 mg/kg). Bruge knivspids test til at vurdere omfanget af anæstesi. Forhindre udtørring af øjnene med normal saltvand.
- Placere mus i den liggende stilling. Fjerne pels på kraniet med en barbermaskine og desinficere huden ved hjælp af medicinsk bomuld bolde indeholdende 75% ethanol.
- For punkt lokalisering, hvilke to punkter, herunder midtpunkter mellem to øjne og ører, henholdsvis. Derefter fastslå linje mellem to ovenstående punkter, og incise huden langs linjen ovenfor med saks (figur 1A).
- Fjerne den kranielle periosteum fra calvaria med en skalpel (figur 1B)6.
- Sutur hud i begge ender med enkle afbrudt sutur.
- Gøre en sutur linje gennem midten af snittet uden knuder. Hold de to ender af suturen linje.
- Embed 50 µL af CoCrMo partikel suspension (50 mg/mL, i PBS) i midten af calvarias (figur 1 c)2.
- Knude det sidste søm i simpel afbrudt sutur (fig. 1 d).
- Vedligeholde mus for yderligere 2 uger.
3. vurdering af Calvarial osteolyse Model af Micro-CT Scanning
- Ofre mus med kuldioxid. Hug hovedet af mus i det vandrette plan. Fjern hjernevæv inde og hud og pels uden for. Høste calvarias til yderligere forsøg.
- Forsigtigt rydde alle bløddele på calvaria med pincet. Fix det ryddet calvarias i 4% PARAFORMALDEHYD ved 4 ° C i 24 h. Fordyb calvarias i PBS 24 h før mikro-CT-scanning.
- Analysere mus calvarias ved høj opløsning mikro-CT på en isometrisk resolution af 18 µm og X-ray energy indstillinger af 45 kV og 550 mA.
- Foretage tre-dimensionelle genopbygning af micro-CT data med softwaren.
- Kvalitativ og kvantitativ analyse.
- Vælg først den firkantede regionen omkring midterlinjen sutur som region af interesse.
- For det andet måle mineral knogletæthed (BMD), knogle mængde/total bind (BV/TV), trabekulær antallet (Tb.N), trabekulær tykkelse (Tb.Th), trabekulær adskillelse/afstand (Tb.Sp) og procentdelen af samlede porøsitet med den medfølgende software til mikro-CT.
- For det tredje, sammenligne de tre grupper til forskellige målinger af en-vejs ANOVA. Post hoc variansanalyse, anvende Bonferroni metode2.
4. evaluering af Calvarial osteolyse Model af H & E farvning
- Afkalke calvaria prøver i 15% ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA)-PBS ved 4 ° C. Ændre opløsningen afkalkning hver dag i 3 uger.
- Integrere de decalcified prøver i paraffin for en 2 cm x 1 cm x 1 cm terning, og skær dem i 2 µm sektioner i området af partikel deposition.
- Pletten sektioner med hæmatoxylin og eosin som tidligere beskrevet7.
- Fange micrographs af den samlede pathomorphism ved lysmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Internt producerede nanoskala CoCrMo partikler var omkring 50 nm (standardfejl for 3,56) i diameter, som kvantificeres ved TEM (figur 2). Efter eksponering af musen calvarias at CoCrMo partikler, dyrene (n = 6 pr. gruppe) blev opretholdt i endnu to uger. Inden for to uger, calvarial snit var helt helbredt og sutur kan falde. Enhver lokal infektion eller ophelet maj påvirker knogle tab vurdering. Efter mus offer, blev calvaria prøver høstet. Så alle bløddele var forsigtigt ryddet op, og mikro-CT blev brugt til at kvantificere knogletab. Fra både tre-dimensionelle genopbygning billeder og repræsentative koronale fotografier på tværsnit, blev betydeligt knogletab observeret i mus behandlet med CoCrMo partikler (figur 3). Knogle mineral tæthed (BMD), knogle mængde/total bind (BV/TV), trabekulær nummer (Tb.N) og trabekulær tykkelse (Tb.Th) blev væsentligt reduceret, mens samlede porøsitet og trabekulær adskillelse/afstand (Tb.Sp) var steget betydeligt i CoCrMo Gruppen sammenlignet med kontrol og sham operation grupper (figur 4). Student t-test blev anvendt til at vurdere forskelle mellem grupper og p < 0,05 blev anset for statistisk signifikant. Derudover bekræftet H & E farvning af calvaria sektioner knogletab i mus behandlet med CoCrMo partikler (figur 5).
Figur 1 : Skematisk af partikel-induceret osteolyse (PIO) musemodel. Venstre side viser mus holdning i modellering. (A) punkt lokalisering. Bestemme midtpunkter mellem to øjne og ører, henholdsvis, og incise huden langs linjen mellem dem. (B) afsløre og fjerne kraniel periosteum fra calvaria. (C) integrere CoCrMo partikel suspension i midten af calvaria. (D) sutur hud i simpel afbrudt sutur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Transmissions Elektron Mikroskopi scanning af CoCrMo partikler. (A) repræsentative transmissions Elektron Mikroskopi billeder af CoCrMo partikler. (B) partikelstørrelsesfordeling CoCrMo partikler blev kvantificeres med softwaren. Hver søjle repræsenterer frekvens normaliseret til det samlede antal partikler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Micro-CT analyse med 3-dimensionelle genopbygning af prøver fra kontrol mus og dem, der er behandlet med PBS (sham operation) og CoCrMo partikler. Den hvide vandrette linje angiver placeringen af tværsnit billede. Den hvide pil angiver knogletab i gruppen CoCrMo implantation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Kvantitativ analyse af micro-CT billederne efter tre-dimensionelle genopbygning. Kvantificering af knogle mineral tæthed (BMD) (A), knogle mængde/total bind (BV/TV) (B), procentdel af samlede porøsitet (C), trabekulær nummer (Tb.N) (D), trabekulær tykkelse (Tb.Th) (E), og trabekulær adskillelse/afstand (Tb.Sp) (F), i mean±standard fejl. Student t-test blev anvendt til at vurdere forskelle mellem grupperne med p < 0,05 anset for statistisk signifikant. **, P < 0,01; , P < 0,001. n = 6 mus pr. gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentant billeder af H & E farvning af calvaria prøver (10 ×) fra kontrol mus og dem, der er behandlet med PBS (sham operation) og CoCrMo partikel. Rød pil angiver osteolyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er to hovedmetoder til slid partikel-induceret osteolyse i mus: luft-pose model og calvarial osteolyse model. I modellen luft-pose er en subkutant genererede luft-pose først etableret, efterfulgt af slid partikel introduktion og implantation i knoglen væv8. Pose væg efterligner periosteum i aseptisk løsne. Knogle implantation er dog nonvascular med ingen biologisk aktivitet, hvilket gør det vanskeligt at vurdere direkte vekselvirkninger mellem partikler og knoglevævet. Calvarial osteolyse modellen har flere fordele i forhold til luft-pose modstykke. Først, slidpartikler udsættes direkte til calvaria, gør det muligt at vurdere samspillet mellem slidpartikler og knogle homøostase, herunder knogleresorption, og osteoblastdannelse, osteoklast og makrofag aktiviteter9,10 . For det andet er kvantitative målinger af knogletab tilgængelig, så vurderingen af forskellige potentielle genetiske metoder og biologiske agenser i knoglen tab forebyggelse11. For det tredje er det muligt at vurdere forholdet mellem slidpartikler og knogletab hos forskellige genetiske baggrunde, herunder transgene og gen knockout mus12,13. For det fjerde, det kan bruges til at screene et stort antal stoffer i forskellige doser. Men succesraten for traditionalcalvarial osteolyse model er relativt lav, og ved hjælp af knogle histomorfometri for at måle osteolyse gør resultater mindre objektive1.
For at forbedre succesraten for modellen og gøre resultaterne mere objektiv, er der sket flere ændringer. Først, nanoskala partikler blev brugt til at forbedre samspillet mellem calvaria og bære partikler. Faktisk, interaktioner mellem nanoskala partikler og calvaria er forbedret sammenlignet med kommercielt legering partikler, med en gennemsnitlig diameter på 1,5 µm14,15. For det andet blev en 1,0 cm2 område på calvaria afgrænset for at opnå tilstrækkelig eksponering af calvaria. For det tredje, mikro-CT og tre-dimensionelle genopbygningen blev brugt til at kvantificere knogletab.
Der er flere begrænsninger i den nuværende model. Første, micro-CT udstyr til mus er ikke almindeligt tilgængelig for forskere og teknikere er påkrævet for scanning og tre-dimensionelle genopbygning. For det andet, CoCrMo nanopartikler anvendes i den nuværende model er ikke kommercielt tilgængelige, og deres produktion er afhængig af støtte fra materialevidenskab teknikere. For det tredje, denne model repræsenterer ikke kroniske virkninger af partikler på knoglemasse og mangler ikke-biologiske faktorer relateret til osteolyse, som vakler væsketryk eller mekaniske kræfter. Effekten af modellen kunne forøges betydeligt ved hjælp af nanoskala partikler og nok eksponering af calvaria. Knogletab kan kvantificeres, og mere objektive data opnået med micro-CT.
En murine calvarial osteolyse model etableret ved udsættelse for CoCrMo partikler er et ideelt værktøj til at vurdere interaktioner mellem CoCrMo partikler og forskellige celler såsom makrofager, fibroblaster, osteoblaster og osteoklaster i aseptisk løsne. Derudover kan en række medicin testes af deres virkninger på aseptisk løsne ved hjælp af denne model.
Der er mange kritiske trin af denne procedure. Først er anvendelsen af CoCrMo nanopartikler med en gennemsnitlig diameter på 50 nm. For det andet, passende eksponering af calvaria blev opnået. En 1,0 cm2 område på calvaria var nok i denne model, og periosteum på calvaria bør blive dissekeret omhyggeligt og helt. En klar dissektion af periosteum intensiverer vekselvirkninger mellem partikler og calvaria. For det tredje er en kvantitativ måling af knogletab af micro-CT muligt. Kvantitative målinger af knogletab fra tre-dimensionelle genopbygning, såsom BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp og procentdel af samlede porøsitet, gøre det lettere at skelne knogle tab forskelle i forskellige behandlinger, og giver solid dokumentation for Osteolyse sammenlignet med traditionelle knogle histomorfometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81572111), klinisk videnskab og teknologi projekt fundament af Jiangsu-provinsen (BL2012002), den videnskabelige forskning projekt af Nanjing (201402007), naturvidenskabelige Grundlæggelsen af Jiangsu provinsen (BK20161385), og det speciel grundlaget for kinesisk læge Association (2015COS0810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
