Summary
Ce manuscrit décrit un modèle murin ostéolyse substance par l’exposition aux particules CoCrMo, qui constitue un modèle animal idéal pour évaluer les interactions entre particules d’usure et de diverses cellules de descellement aseptique.
Abstract
Ostéolyse de provoquées par les particules d’usure est une cause majeure de descellement aseptique dans l’échec de l’arthroplastie, mais le mécanisme sous-jacent reste incertaine. En raison de longs suivis nécessaires pour la détection et la présence sporadique, il est difficile d’évaluer l’ostéolyse induite par l’ofparticle pathogenèse en cas cliniques. Optimale des modèles animaux sont donc nécessaires pour poursuivre ses études. Le modèle murin d’ostéolyse substance établie par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil efficace et valable pour évaluer les interactions entre les particules et les diverses cellules de descellement aseptique. Dans ce modèle, CoCrMo particules ont d’abord obtenus en courant continu de vide élevé trois électrodes et remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate à une concentration de 50 mg/mL. Puis, 50 µL de la suspension qui en résulte a été appliquée au milieu de la calvaria murine après séparation du périoste crânien par sharp dissection. Après deux semaines, les souris ont été sacrifiées, et des spécimens de calotte cranienne ont été récoltés ; les évaluations qualitatives et quantitatives ont été effectuées par l’hématoxyline et éosine coloration et micro tomographie. Les points forts de ce modèle comprennent la simplicité de la procédure, une évaluation quantitative de la perte osseuse, rapidité de développement d’ostéolyse, utilisation potentielle transgénique ou des modèles knock-out et un coût relativement faible. Toutefois, ce modèle ne peut pour servir à évaluer la force mécanique et les effets chroniques des particules dans un descellement aseptique. Modèle murin ostéolyse substance générée par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil idéal pour évaluer les interactions entre les particules d’usure des cellules, par exemple, macrophages, fibroblastes, ostéoblastes et des ostéoclastes, au descellement aseptique.
Introduction
Le descellement aseptique est la cause la plus fréquente d’arthroplastie totale de hanche (THA) et l’échec d’arthroplastie (TKA) totale du genou, qui nécessite une chirurgie de révision1. Toutefois, le mécanisme sous-jacent reste peu clair2. Un suivi long est nécessaire pour la détection d’ostéolyse provoquées par les particules, dont la présence est rare ; par conséquent, il est difficile d’explorer sa pathogenèse en cas cliniques. Par conséquent, autres études mettant l’accent sur des mécanismes complexes de cellulaire et tissulaire nécessitent que les deux expériences in vivo en portent des modèles ostéolyse provoquées par les particules et des essais in vitro dans les cellules liées à l’os de l’homéostasie du3. Un modèle animal valide est important en révélant les effets des particules d’usure sur la perte osseuse, fournissant des preuves pour plus amples analyses cellulaires.
Un modèle murin ostéolyse substance construit par l’exposition aux particules CoCrMo est une méthode efficace et valable pour évaluer les interactions entre les particules et les diverses cellules de descellement aseptique. Dans ce modèle, particules CoCrMo causent ostéolyse substance en induisant des cytokines inflammatoires dans les macrophages, activation des ostéoclastes, inhibant la prolifération ostéoblastique et en encourageant l’apoptose ostéoblastique.
Il faut seulement deux semaines pour établir ce modèle. Ostéolyse peut être visualisé et quantifié par l’hématoxyline et éosine (H & E) souillant et micro computed tomography (micro-CT)2. En outre, ce modèle a une relativement faible coût et transgénique et knock-out souris modèles peuvent être utilisés pour dépister un grand nombre de composés à différentes doses3.
La procédure pour établir et évaluer ce modèle est simple. Tout d’abord, CoCrMo particules ont été obtenues en courant continu de vide élevé trois électrodes et remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 50 mg/mL. Puis, 50 µL de la suspension qui en résulte a été appliquée au milieu de la calvaria murine après séparation du périoste crânien par sharp dissection. Les souris ont été sacrifiées après deux semaines, et les échantillons de calotte cranienne ont été récoltés ; analyses qualitatives et quantitatives ont été effectuées par H & E coloration andmicro-CT.
Un modèle murin ostéolyse substance construit par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil idéal pour évaluer les interactions entre particules CoCrMo et diverses cellules, telles que les macrophages, fibroblastes, ostéoblastes et les ostéoclastes, au descellement aseptique.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Nanjing.
1. préparation de particules CoCrMo
- Obtenir CoCrMo particules en utilisant un mécano vide élevé trois électrodes de courant continu4. Placez CoCrMo alliage dans l’instrument sous vide de Pa-3 10, 0,04 MPa argon et hydrogène 3 / 2 (v/v) et 650 A cathode actuel.
- Mesurer les diamètres de particules CoCrMo.
- Ajouter 1 mg de particules CoCrMo dans 1,5 mL d’éthanol anhydre.
- Remettre en suspension les particules CoCrMo dans l’éthanol anhydre par agitation ultrasonique à 28 kHz et 600 W pendant 5 min.
- Appliquer une goutte (environ 20 µL) de la suspension qui en résulte sur la table objective d’un microscope électronique à transmission (TEM). Série de photos TEM à 200 tension d’accélération kV et 0,24 nm résolution de capture.
- Le logiciel fourni permet de calculer la moyenne granulométrie de diamètre et de particules dans les micrographies TEM.
- Décontaminer les endotoxines
- Autoclave 50 g de particules pendant 15 minutes à 121 ° C et 15 psi.
- Détecter les endotoxines par un test quantitatif de Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (< 0,25 % UE/mL était censée indiquer l’absence de l’endotoxine)5.
- Remettre en suspension les particules dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 50 mg/mL en solution mère6.
2. construction du modèle substance ostéolyse
- Anesthésier âgés de 6 semaine C57BL/J6 souris (six souris par groupe) withpentobarbital (50 mg/kg). Le test du pincement permet d’évaluer le niveau de l’anesthésie. Éviter le dessèchement des yeux avec une solution saline normale.
- Placez la souris en position couchée. Enlever la fourrure sur le crâne avec un rasoir et désinfecter la peau à l’aide de boules de coton médical contenant 75 % d’éthanol.
- Pour la localisation du point, identifier deux points, y compris les milieux entre les deux yeux et les oreilles, respectivement. Ensuite, déterminer la frontière entre ces deux points et inciser la peau le long de la ligne ci-dessus avec des ciseaux (Figure 1 a).
- Retirez le périoste crânien de la calotte cranienne avec un scalpel (Figure 1 b)6.
- Peau de suture aux deux extrémités par simple suture interrompu.
- Faire une ligne de suture par le milieu de l’incision sans nouage. Tenir les deux extrémités de la ligne de suture.
- Incorporer 50 µL de la suspension de particules CoCrMo (50 mg/mL dans du PBS) au milieu de la calvarias (Figure 1)2.
- Nouez la dernière maille au sein de la simple suture interrompu (Figure 1).
- Maintenir la souris pour un autre 2 semaines.
3. évaluation du modèle de substance ostéolyse par Micro-TDM
- Sacrifier les souris avec le dioxyde de carbone. Décapiter les souris dans le plan horizontal. Retirez le tissu cérébral à l’intérieur et la peau et la fourrure à l’extérieur. Récolter le calvarias pour d’autres expériences.
- Éclaircir tous les tissus mous sur la calotte cranienne doucement avec des pincettes. Difficulté la calvarias déboisées dans 4 % paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 24 h. immerger le calvarias en PBS 24h avant micro-tomodensitométrie.
- Analyser la souris calvarias par micro-CT haute résolution à une résolution isométrique de 18 µm et paramètres d’énergie des rayons x de 45 kV et 550 mA.
- Procéder à une reconstruction tridimensionnelle de données micro-CT avec le logiciel.
- Analyse qualitative et quantitative.
- Tout d’abord, sélectionnez la région carrée autour de la suture médiane comme la région d’intérêt.
- Ensuite, mesurer la densité minérale osseuse (DMO), OS volume/total volume (BV/TV), nombre trabéculaire (Tb.N), l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th), séparation/espacement trabéculaire (Tb.Sp) et pourcentage de porosité totale avec le logiciel pour micro-CT.
- Troisièmement, de comparer les trois groupes pour différentes mesures par ANOVA à. Pour l’analyse post-hoc de la variance, appliquer la méthode de Bonferroni2.
4. evaluation de la substance ostéolyse modèle par une coloration H & E
- Détartrage des échantillons de la calotte cranienne dans 15 % acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA)-PBS à 4 ° C. Changez la solution de détartrage tous les jours pendant 3 semaines.
- Incorporer les échantillons décalcifiées à la paraffine pour un 2 x 1 cm x 1 cube de cm et les couper en 2 sections de µm dans la zone de dépôt de particules.
- Tacher les sections à l’hématoxyline et éosine décrite précédemment7.
- Capturer les micrographies de la pathomorphism globale au microscope photonique.
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Representative Results
Les produit nanoparticules CoCrMo internes étaient environ 50 nm (erreur standard de 3,56) de diamètre, tel que quantifié par TEM (Figure 2). Après l’exposition de souris calvarias CoCrMo particules, les animaux (n = 6 par groupe) ont été maintenus pendant encore deux semaines. Dans les deux semaines, l’incision de substance a été complètement guérie, et la suture peut tomber. Toute infection locale ou une pseudarthrose mai affecter l’évaluation de perte osseuse. Après le sacrifice des souris, des échantillons de calotte cranienne ont été récoltés. Ensuite, tous les tissus mous a été légèrement éclairci, et micro-CT a été utilisée pour quantifier la perte osseuse. Des deux images de reconstruction tridimensionnelle et représentant coronales photographies à la section transversale, la perte osseuse importante a été observée chez les souris traitées avec CoCrMo des particules (Figure 3). (BMD) de la densité minérale des os, OS volume/total volume (BV/TV), numéro trabéculaire (Tb.N) et l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th) ont chuté, tandis que la porosité totale et trabéculaire séparation/espacement (Tb.Sp) ont augmenté considérablement chez le CoCrMo groupe que chez les groupes des opération de contrôle et sham (Figure 4). Test t de Student a été utilisé pour évaluer les différences entre les groupes et p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. De plus, la coloration H & E des sections de la calotte cranienne a confirmé la perte osseuse chez les souris traitées avec CoCrMo des particules (Figure 5).
Figure 1 : Schématique du modèle souris ostéolyse provoquées par les particules (PIO). Le côté gauche montre la position de la souris dans la modélisation. (A) Point de localisation. Déterminer le point milieu entre les deux yeux et les oreilles, respectivement et inciser la peau le long de la ligne entre eux. (B) exposer et retirez le périoste crânien de la calotte cranienne. (C) incorporer CoCrMo suspension de particules dans le milieu de la calotte cranienne. (D) de Suture la peau en simple suture interrompu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Transmission au microscope électronique à balayage de particules CoCrMo. (A) images de microscopie électronique de Transmission représentatif des particules CoCrMo. (B) la distribution granulométrique des particules CoCrMo a été quantifiée avec le logiciel. Chaque barre représente la fréquence normalisée selon le nombre total de particules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse micro-CT avec reconstruction 3D d’échantillons provenant de souris témoins et ceux traités avec PBS (opération fictive) et particules CoCrMo. La ligne horizontale blanche indique l’emplacement de l’image coupe transversale. La flèche blanche indique la perte osseuse dans le groupe d’implantation de CoCrMo. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse Quantitative d’images micro-CT après reconstruction tridimensionnelle. Quantification de l’OS densité minérale (BMD) (A), volume de volume/total osseux (BV/TV) (B), pourcentage de porosité totale (C), le nombre trabéculaire (Tb.N) (D), épaisseur trabéculaire (Tb.Th) (E)et trabéculaire séparation/espacement (Tb.Sp) (F), erreur de mean±standard. Test t de Student a été utilisé pour évaluer les différences entre les groupes, avec p < 0,05 considérés comme statistiquement significatifs. **, P < 0,01 ; , P < 0,001. n = 6 souris par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Des images représentatives de H & E la coloration des échantillons (× 10) de la calotte cranienne de souris témoins et ceux traitement avec PBS (opération fictive) et particules CoCrMo. La flèche rouge indique ostéolyse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il existe deux méthodes principales pour usure provoquées par les particules ostéolyse chez la souris : le modèle air-poche et le modèle de substance ostéolyse. Le modèle air-poche, une pochette-air générée par voie sous-cutanée est tout d’abord établie, suivi par introduction de particules usure et l’implantation dans le tissu d’OS8. Le mur de la pochette imite le périoste au descellement aseptique. Cependant, l’implantation de l’OS est non vasculaires sans activité biologique, ce qui rend difficile d’évaluer les interactions directes entre les particules et le tissu osseux. Le modèle de l’ostéolyse substance présente plusieurs avantages sur l’homologue d’air-pochette. Tout d’abord, les particules d’usure sont directement exposés à la calvaria, permettant d’évaluer les interactions entre particules d’usure et d’os de l’homéostasie, y compris la résorption osseuse et les ostéoblastes, ostéoclastes et macrophages activités9,10 . Deuxièmement, des mesures quantitatives de la perte osseuse sont disponibles, permettant l’évaluation des diverses approches génétiques potentielles et d’agents biologiques en os perte prévention11. Troisièmement, il est possible d’évaluer la relation entre les particules d’usure et la perte osseuse dans les différents fonds génétiques, y compris les transgéniques et gène knockout souris12,13. Quatrièmement, il peut être utilisé pour dépister un grand nombre de composés à des doses différentes. Toutefois, le taux de réussite du modèle traditionalcalvarial ostéolyse est relativement faible, et utilisant l’histomorphométrie osseuse pour mesurer l’ostéolyse rend les résultats moins objective1.
Pour améliorer le taux de réussite du modèle et rendre les résultats plus objectif, plusieurs modifications ont été apportées. Tout d’abord, les nanoparticules ont été utilisés afin d’améliorer les interactions entre la calotte cranienne et de particules d’usure. En effet, les interactions entre particules nanométriques et la calotte cranienne est améliorée par rapport commercialement de particules d’alliage avec un diamètre moyen de 1,5 µm14,15. Deuxièmement, une zone de2 1,0 cm sur la calotte cranienne a été délimitée pour réaliser une exposition adéquate de la calotte cranienne. Troisièmement, une reconstruction tridimensionnelle et de micro-CT ont été utilisées pour quantifier la perte osseuse.
Il y a plusieurs limitations du modèle actuel. Tout d’abord, micro-CT équipement pour la souris n’est pas largement disponible pour les chercheurs et techniciens sont nécessaires pour la reconstruction tridimensionnelle et du balayage. Deuxièmement, les nanoparticules CoCrMo utilisées dans le modèle actuel ne sont pas disponibles dans le commerce, et leur production s’appuie sur le soutien des techniciens de la science des matériaux. Troisièmement, ce modèle ne représente pas les effets chroniques des particules sur la masse osseuse et n’a pas de facteurs non biologiques liés à ostéolyse comme pression de fluide oscillatoire ou forces mécaniques. L’efficacité du modèle pourrait être considérablement augmentée avec l’aide des nanoparticules et suffisamment l’exposition de la calotte cranienne. La perte osseuse ont pu être quantifiée, et des données plus objectives obtient avec micro-CT.
Un modèle murin ostéolyse substance établi par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil idéal pour évaluer les interactions entre particules CoCrMo et différentes cellules comme les macrophages, les fibroblastes, les ostéoblastes et les ostéoclastes dans le descellement aseptique. En outre, une série de médicaments peut être testée de leurs effets sur le descellement aseptique à l’aide de ce modèle.
Il y a beaucoup d’étapes critiques de cette procédure. Le premier est l’application des nanoparticules CoCrMo avec un diamètre moyen de 50 nm. Deuxièmement, une exposition adéquate de la calotte cranienne a été atteint. Une zone de2 1,0 cm sur la calotte cranienne est allé dans ce modèle, et le périoste sur la calotte cranienne devrait être disséqué avec soin et complètement. Une dissection claire du périoste s’intensifie les interactions entre les particules et la calotte cranienne. Troisièmement, une mesure quantitative de la perte osseuse par micro-CT est possible. Des mesures quantitatives de la perte osseuse de trois reconstruction tridimensionnelle, tels que BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp et pourcentage de porosité totale, rendent plus faciles à distinguer les différences de perte osseuse dans les différents traitements et fournissent des preuves solides de Ostéolyse comparée à l’histomorphométrie osseuse traditionnelles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81572111), les sciences cliniques et technologie projet Fondation de la Province du Jiangsu (BL2012002), le projet de la recherche scientifique de Nanjing (201402007), les sciences naturelles Fondation de la Province de Jiangsu (BK20161385) et la Fondation spéciale de docteur en médecine chinoise Association (2015COS0810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
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